Эритропоэз схема: Презентация на тему: «ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ АНЕМИЙ. Эритропоэз Эритропоэз

Эритропоэз и механизмы регуляции уровня железа плазмы крови

Одной из проблем современной гематологии являются железодефицитные анемии, так как многие из них до сих пор плохо поддаются лечению. Нам представляется, что это вызвано неясностью некоторых механизмов их патогенеза, обусловленной недостаточной глубиной изученности процессов регуляции гомеостаза железа, его хранения в депо и доставки к кост­ному мозгу — основному месту использования железа для синтеза гемоглобина.

Из 4–5 г железа, которое находится в организме, 20 % составля ет резервное железо, а остальное — функционально активное. Из этого количества в состав гемоглобина эритроцитов входит 62–70 %, 5–10 % содержится в скелетных мышцах (в миоглобине). Остальное железо находится в тканях, где оно принимает участие во многих метаболических процессах: в составе металлосодержащих энзимов обеспечивает митохондриальный транспорт электронов, синтез ДНК и деление клеток, метаболизм катехоламинов, детоксикационные механизмы, в обеспечении которых принимает участие, в частности, цитохром Р 450 , содержащий железо.

В обычных условиях для эритропоэза ежесуточно необходимо 20–25 мг железа. Практически все это железо костный мозг получает за счет его повторного использования. Основным местом резервного железа является ретикулоэндотелиальная система (РЭС) печени, откуда Fe поступает в эритробласты костного мозга с белком плазмы крови трансферрином (гликопротеином MB 76000), мигрирующим при электрофорезе белков плазмы вместе с b -глобулином. Поступившее в эритробласт железо используется для синтеза гема и депонируется в эритробласт в виде резерва. В макрофагах печени и костного мозга резервное железо депонируется в молекуле ферритина, в состав которой входит белок апоферритина, образующий подобие скорлупы, в центре которой аккумулируется железо. Молекулы ферритина, в свою очередь, образуют внутри лизосом большие аморфные нерастворимые агрегаты — гемосидерин. Таким образом, ферритин и гемосидерин — это формы резервного железа в клетках. При освобождении железа из клеточного резерва оно переводится в двухвалентное состояние (благодаря энзиму ксантиноксидазе, аскорбиновой кислоте и др.), соединяется с трансферрином и транспортируется через плазму крови к эритробластам костного мозга [1].

В настоящее время основным регулятором уровня железа в плазме крови большинство исследователей считает гепсидин (hepcidin). Гепсидин — небольшой протеин (25 аминокислот), который синтезируется в печени и здесь же на уровне купферовских клеток регулирует выход железа в русло крови. Впервые он был описан в 2001 году как один из стимуляторов антимикробного иммунитета [2, 3]. Но вскоре было показано и его участие в гомеостазе железа [4, 5].

Обстоятельно описаны также и механизмы его действия как одного из основных регуляторов гомеостаза железа на уровне обеспечения всасывания в энтероцитах тонкого кишечника [11], а также резорбции из клеток РЭС [11]. При поражении печени содержание гепсидина в плазме крови снижается, что приводит к дефициту усвоения железа из кишечника [8, 9].

Гепсидин стимулирует синтез РНК, что в конечном итоге связывает ферропортин и тем самым уменьшает поступление ионов железа в общий кровоток [11]. Одним из регуляторов уровня самого гепсидина является метриптаза-2 — фермент, расщепляющий гепсидин [12].

В то же время еще совсем неясным остается механизм, с помощью которого осуществляется взаимодействие системы эритропоэза (а это основной «потребитель» железа) и гомеостаза его в организме [6]. Лишь постулируeтся наличие какого-то еще неизвестного фактора-посредника [5, 7, 10]. Предполагается, что таким фактором может быть эритропоэтин [13].

Позволю себе напомнить некоторые положения современной науки об эритропоэзе и его основном стимуляторе — эритропоэтине, основным местом синтеза которого являются перитубулярные клетки почки [14], а также гепатоциты, окружающие венозные синусы печени [15]. В настоящее время при использовании различных методов культур тканей костного мозга показано, что эритропоэз осуществляется в так называемых эритробластических островках [16]. Превращение общей родоначальной клетки в эритроидные предшественники происходит при тесном межклеточном взаимодействии структур костного мозга и специфических регуляторов, а их дальнейшее созревание в зрелый эритроцит происходит при обязательном участии макрофагов костного мозга.

Эритроидный островок представляет собой центральный макрофаг, окруженный, как короной, эритробластами, находящимися на различной стадии своего созревания. Эти макрофаги обеспечивают модуляцию эритроидных колоний, продуцируя разнообразные специфические регуляторы активности влияния основного стимулятора пролиферации и созревания эритробластов — эритропоэтина [18]. Они же могут синтезировать некоторое количество эритропоэтина. В эритробластических островках развитие нормобластов заканчивается их денуклеацией (выталкиванием ядра) и превращением в ретикулоциты с последующим высвобождением этих клеток и поступлением их в синусоиды костного мозга. Ретикулоцит — это юный эритроцит, содержащий иРНК, благодаря которой еще в течение почти двух суток продолжается синтез гемоглобина: в первые сутки ретикулоцит находится в костном мозге, а во вторые — уже в русле крови. По их концентрации в периферической крови судят об интенсивности эритропоэза.

Главным стимулом продукции эритропоэтина является тканевая гипоксия, что подтверждается быстрым накоплением иРНК эритропоэтина после возникновения дефицита кислорода, к которому высоко чувствительны соответствующие клетки почек. Поэтому секреция эритропоэтина зависит от содержания кислорода в альвеолярном воздухе, функции легких (вентиляция, диффузия и перфузия), сердечного выброса, общей кислородной емкости крови, уровня гемоглобина, его способности связывать и отдавать кислород и определяется количеством кислорода в крови и потребностью тканей в нем [19, 20]. Между уровнями гемоглобина или гематокрита и плазменного эритропоэтина существует обратная линейная корреляция [20, 21]. Следовательно, уровень эритропоэтина в плазме может служить маркером тканевой оксигенации. По мнению некоторых исследователей, печень и почки выделяют неактивный эритропоэтин, так называемый эритроген, который в плазме крови под влиянием специфического фермента эритрогенина превращается в эритропоэтин. Эритропоэтин обладает рядом уникальных свойств [22–24]. Он не имеет сходства с каким-либо другим плазменным белком, а в плазме крови циркулирует только одна его форма. Плазменный клиренс эритропоэтина не зависит от его концентрации в плазме и от клеточности костного мозга. Исследователи не обнаружили преформированных мест его депонирования. Эритропоэтин оказывает влияние на различные звенья эритропоэза, начиная с реактивных клеток, позволяя им дифференцироваться в узнаваемые под микроскопом предшественники эритроцитов, в которых начинается синтез гемоглобина. Особенно активно он влияет на созревание эритроидных клеток-предшественников и, увеличивая их резерв, стимулирует пролиферацию созревающих клеток.

Суть исследования

Целью эксперимента явилось выяснение того факта, почему в норме при активации эритропоэза в плазме крови повышается концентрация железа; то есть является ли это ответом на уровень эритропоэтина плазмы, содержание в крови которого увеличивается, или нет. Указание на эритропоэтин как на стимулятор уровня железа в плазме крови возникает по аналогии с другими гормональными регуляторами. К примеру, гомеостаз йода, его всасывание стимулируется ТТГ, а концентрация кальция крови регулируется кальцитонином, паратгормоном и витамином D 3 .

Для этого нами использован многоступенчатый эксперимент. Сначала животных (крысы линии Вистар) на 18 часов помещали в барокамеру при пониженном содержании кислорода (аналог высоты 4000 м над уровнем моря). Это широко используемая модель стимуляции образования эритропоэтина. После этого крыс забивали кровопотерей, а сыворотку крови (по 2 мл) вводили реципиентам (№ 1). Спустя сутки, когда из их крови эритропоэтин уже исчезал [7], у этих животных также забирали кровь, а сыворотку вводили (по 2 мл) следующим реципиентам (№ 2). Спустя сутки кровь данных реципиентов исследовалась на содержание железа. В каждой серии также исследовалась концентрация железа у контрольных крыс (им вводился физиологический раствор).

Уровень железа и его производных в плазме крови исследовалися с помощью стандартного набора BIOTEST Fe70. Конечное определение экстинкции производилось на спектрофотометре на базе ЦНИЛа университета. Концентрация ретикулоцитов в крови определялась окраской мазков 1% спиртовым раствором бриллиант крезилблау.

Результаты и их обсуждение

Приведенная выше схема эксперимента позволила нам использовать два типа сыворотки: реципиентам № 1 вводилась сыворотка, содержащая эритропоэтин, а у реципиентов № 2 в сыворотке он уже отсутствовал, поскольку известно, что Т 1/2 вводимого с сывороткой эритропоэтин составляет всего 1,5 часа [7].

Полученные результаты исследований приведены в табл. 1. Прежде всего необходимо обратить внимание на то, что концентрация ретикулоцитов в крови животных отражает вышесказанное о наличии или отсутствии эритропоэтина во вводимой реципиентам сыворотке. У реципиентов № 1, так же как у животных после пребывания в гипоксической барокамере, как и должно быть под влиянием эритропоэтина, содержание ретикулоцитов возрастало. В отличие от этого у реципиентов № 2 оно оставалось без изменения, что свидетельствует об отсутствии у них повышенного уровня стимулятора.

Как видно из приведенных данных, после пребывания в барокамере, которое приводит к стимуляции образования эритропоэтина и началу интенсификации кроветворения под его действием, уровень железа и железосвязывающая способность сыворотки крови достоверно понижались.

В отличие от этого введение сыворотки реципиентам № 1 приводит к росту уровня транспортного железа в их крови. Но наиболее важно то, что в еще большей степени возросли как уровень транспортируемого железа, так и железосвязывающая способность сыворотки крови у реципиентов № 2, причем отличие было достоверным даже по отношению к реципиентам № 1. Примечательно, что во всех группах животных процент насыщения железом транспортной системы плазмы был одинаковым.

Полученные результаты можно трактовать таким образом. Под воздействием стимулированного кроветворения у реципиентов № 1 увеличивается доставка железа к костному мозгу. Это обусловлено тем, что в их крови появляется какой-то фактор-посредник (его мы назвали фактором Fе), который информирует клетки-депо железа о необходимости выброса микроэлемента в кровь для обеспечения увеличенных потребностей костного мозга. Эффект этого посредника еще более четко проявляется у реципиентов № 2. Очень важно то, что он не является эритропоэтином, поскольку проявляет свой эффект и после исчезновения последнего.

Снижение показателей транспорта железа после пребывания в барокамере можно объяснить тем, что к моменту исследования данный фактор-посредник еще не образовался (или его еще очень мало), а активированное кроветворение уже забирает больше железа из плазмы крови.

Нельзя исключать того, что выявленный нами фактор является тем посредником, который информирует систему гепсидина об интенсивности кроветворения. Весьма важно то, что он не является эритропоэтином, вопреки мнению D.R. Asby et al. [ 13 ] . Косвенным подтверждением нашей точки зрения являются и результаты лечения недоношенных новорожденных с низким содержанием гемоглобина в эритроцитах, получавших эритропоэтин. При этом отмечена тенденция к снижению содержания сывороточного железа, ферритина, трансферрина даже при одновременном введении эритропоэтина и препаратов железа (от 2 до 6 мг/кг/сутки) и витамина Е (5– 15 мг/день) [25, 26]. Большинство исследователей отрицают преимущества повышенных лечебных доз железа для повышения эффективности терапии эритропоэтином и при других железодифицитных состояниях [27–29]. То есть можно предположить, что здесь имеет место недостаток образования фактора (фактора Fе), существование которого постулируется нами.

Выводы

1. При стимулированном эрит­ро­поэзе в плазме крови растет уровень железа и повышаются показатели железотранспортных систем плазмы крови.

2. Мобилизация железа из депо происходит под воздействием какого-то фактора, который мы обо­значили рабочим названием «фактор Fe».

3. Фактор Fе не является стимулятором кроветворения эритропоэтином.

Bibliography

1. Руководство по гематологии / Под ред. А.И. Воробьева. — Т. 2. — М.: Медицина, 1985. — 366 с.

2. Krause А., Neitz S., Magert H.J., Sc hulz А., Forssmann WG., Schulz-Knappe P., Adermann К. LEAP-1, а novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial acti­vity // FEBS Lett. — 2001. — 480. — 147-150.

3. Parc C.H., Valore E.V., Waring A.J., Ganz T. Hepcidin, а urinary antimicrobial peptide sinthsized in liver // J. Biol. Chem. — 2001. — 276. — 7806-7810.

4. Andrews N.C. Anemia of inflammation: the cytokine-hepcidin link // J. Clin. Invest. — 2004. — 113. — 1251-1253.

5. Peyssonnaux C., Zinkernagel A.S., Schuepbach R.A. Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcripcion factors (HIFs) // J. Clin. Invest. — 2007 Jul. — 117(7). — 1926-1932.

6. Wrighting D.M., Andrews N.C. Iron homeostasis and erythropoiesis // Curr. Top. Dev. Biol. — 2008. — 82. — 141-167.

7. Wieczorek L., Hirth P., Scho­pe K.B. Molecular biology of Eryth ropoietin // Prod. Develop. Pharmac. — 1991. — Vol. 2. — Р. 13-16.

8. Toledano M., Kozer E., Goldstein L.H., Abu-Kishk I., Bar-Haim A., Siman-Tov Y., Rechavi M., Rechavi G., Weizer-Stern O., Berkovitch M. Hepcidin in acute iron tox i­city // Am. J. Emerg. Med. — 2009. — 27(7). — 761-4.

9. Muckenthaler M.U. Fine tuning of hepcidin expression by positive and negative regulators // Cell Metab. — 2008. — 8(1). — 1-3.

10. Beguin Y. Soluble transferrin receptor for the evaluation of erythropoiesis and iron status // Clin. Chim. Acta. — 2003. — 329(1–2). — 9-22.

11. Ramey G. et al. Heptidin targets ferroportin for degradation in hepatocytes // Hematologica. — 2009 Sep. — 22. — 235-242.

12. Knutson M.D. Into the matrix: regulation of the iron regulatory hormone heptidin by metriptase-2 // Nutr. Rev. — 2009. —67(5). — 284-288.

13. Ashdy D.R. et al. Plasma heptidin levels are elevated but responsive to erythropoietin therapy in renal dis ease // Kidney Int. — 2009. — 75(9). — 976-81.

14. Lacombe C., Da Silva J.-L., Bruneval P. et al. Peritubular cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney // J. Clin.Invers. — 1988. — Vol. 81. — P. 620-623.

15. Koury S.T., Bondarant M.C., Koury H.J. Localization of cells producing erythropoietin in murine liver by in situu hybridization // Blood. — 1991. — Vol. 77, № 11. — P. 2497-2506.

16. Bessis M. Ultrastructural aspects of erythropoiesis // Internatio­nal Conf. on Hematopoiesis. — Capri, 1971. — P. 7-20.

17. Захаров Ю.М., Тишевская Н.В. О взаимосвязи функциональной активности центральных макрофагов с кинетикой эритропоэза в эритробластических островках // Вопросы экспериментальной физиологии. — M.; Екатеринбург, 1997. — 95-103.

18. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Эритробластический островок. — М.: Медицина, 2002. — 280 с.

19. Juul S.E. Erythropoietin in the neonate // Curr. Probl. Pediatr. — 1999. — Vol. 5. — P. 129-149.

20. Морщакова Е.Ф. Анемия не­доношенных и эритропоэтин // Педиатрия. — 1997. — № 4. — С. 49-54.

21. Павлов А.Д., Морщакова Е.Ф., Румянцев А.Г. Эритропоэтин: биологические свойства и при менение в клинической практике. — М.: Гэотар Медицина, 2001.

22. Chen J. Anemia of premature // Amer. J. Perinatol. — 1995. — Vol. 5. — P. 314-318.

23. Ермоленко В.М., Николаев А.Ю. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинической практике // Терапевтический архив. — 1991. — № 6. — С. 81-86.

24. Koenig J.M., Christensen R.D. Effect of erythropoietin on granulocytopoieiesis: in vitro and vivo studies in weanling rats // Pediatr. Res. — 1990. — Vol. 27. — P. 583-587.

25. Ohls R.K. The use of erythropoietin in neonates // Clin. Perinatol. — 2000. — Vol. 3. — P. 681-696.

26. Spencer M.K., Khong T.Y., Matthews B.L. et al. Haematopoietic indicators of fetal metabolic acidosis // Aust. NZJ Obstet. Gynaecol. — 2000. — Vol. 40. — P. 286-289.

27. Bader D., Kugelman A., Maor-Rogin N. et al. The role of high-dose oral iron supplementation during erythropoietin therapy for anemia of prematurity // J. Perinatol. — 2001. — Vol. 21. — P. 215-220.

28. Picaud J.C., Putet G., Salle B.L., Claris A.D. Iron supplementation in preterm infants treated with erythropoietin // Arch. Pediatr. — 1999. — Vol. 6. — P. 657-664.

29. Dani C., Reali M.F., Bertini G. et al. The role of blood transfusions and iron intake on retinopathy of pre maturity // Early Hum. Dev. — 2001. — Vol. 62. — P. 57-63.

Карта сайта

Страница не найдена. Возможно, карта сайта Вам поможет.

  • Главная
  • Университет
    • Об университете
    • Структура
    • Нормативные документы и процедуры
    • Лечебная деятельность
    • Международное сотрудничество
    • Пресс-центр
      • Новости
      • Анонсы
      • События
      • Объявления и поздравления
      • Конференции
      • Фотоальбом
        • Торжественные мероприятия к Дню защитника Отечества-2022
        • Досрочное голосование. Референдум по внесению дополнений и изменений в Конституцию Республики Беларусь
        • Чрезвычайный и Полномочный Посол Индии в Республике Беларусь посетил ГрГМУ
        • Предварительное распределение-2022 (часть 2)
        • Предварительное распределение-2022 (часть 1)
        • Отчетное заседание рабочей группы по координации деятельности Центров мониторинга профессиональных рисков и психологической поддержки медицинских работников
        • Студенты ГрГМУ помогают практическому здравоохранению в борьбе с коронавирусом
        • В ГрГМУ прошла расширенная итоговая коллегия главного управления здравоохранения Гродненского облисполкома
        • Расширенное заседание совета университета
        • Студенты ГрГМУ помогают практическому здравоохранению
        • Рабочий визит в Грузию в рамках учебной аккредитации вузов-партнеров
        • Новогодний бал во Дворце Независимости
        • Новогодний бал для талантливой молодежи Гродненщины
        • Финал V Турнира трех вузов по ScienceQuiz
        • Встреча представителей учреждений здравоохранения со студентами-выпускниками вуза
        • Визит профессора Джаниты Абейвикремы Лиянаге, Чрезвычайного и Полномочного Посла Демократической Социалистической Республики Шри-Ланки
        • Областной этап конкурса «Студент года-2021″
        • Республиканская онлайн-конференция, посвященная 60-летию кафедры акушерства и гинекологии
        • Alma Mater-2021 (ПФ, МДФ)
        • В ГрГМУ вручили сертификаты слушателям школы резерва кадров
        • Оториноларингологические чтения
        • Alma Mater-2021 (ЛФ, МПФ)
        • Диалоговая площадка с депутатом Палаты представителей Олегом Сергеевичем Гайдукевичем
        • Визит экспертной группы бизнес-премии «Лидер года»
        • Заместитель премьер-министра Республики Беларусь Игорь Викторович Петришенко встретился со студентами ГрГМУ
        • Делегация Багдадского университета с визитом в ГрГМУ
        • Студенческий фестиваль национальных культур-2021
        • Студент года-2021
        • Занятия в симуляционном центре ГрГМУ, имитирующем «красную зону»
        • Торжественная церемония вручения дипломов о переподготовке
        • Праздничный концерт, посвященный Дню Матери
        • Церемония подписания договора о сотрудничестве вуза и Гродненской православной епархии
        • Диалоговая площадка с председателем Гродненского облисполкома Владимиром Степановичем Караником
        • Выставка-презентация учреждений высшего образования «Образование будущего»
        • Товарищеский турнир по мини-футболу
        • Конференция «Современные проблемы радиационной и экологической медицины, лучевой диагностики и терапии»
        • Посвящение в первокурсники-2021
        • Встреча заместителя министра здравоохранения Д.В. Чередниченко со студентами
        • Открытый диалог, приуроченный к 19-летию БРСМ
        • Группа переподготовки по специальности «Организация здравоохранения»
        • Собрания факультетов для первокурсников-2021
        • День знаний — 2021
        • Совет университета
        • Студенты военной кафедры ГрГМУ приняли присягу
        • День освобождения Гродно-2021
        • Ремонтные и отделочные работы
        • Итоговая практика по военной подготовке
        • День Независимости-2021
        • Студенты военной кафедры ГрГМУ: итоговая практика-2021
        • Выпускной лечебного факультета-2021
        • Выпускной медико-психологического и медико-диагностического факультетов-2021
        • Выпускной педиатрического факультета-2021
        • Выпускной факультета иностранных учащихся-2021
        • Вручение дипломов выпускникам-2021
        • Митинг-реквием, посвященный 80-й годовщине начала Великой Отечественной войны
        • Акция «Память», приуроченная к 80-летию начала Великой Отечественной войны
        • Республиканский легкоатлетический студенческий забег «На старт, молодежь!»
        • Актуальные вопросы гигиены питания
        • Торжественное мероприятие к Дню медицинских работников-2021
        • Совет университета
        • Выездное заседание Республиканского совета ректоров
        • Церемония вручения медалей и аттестатов особого образца выпускникам 2021 года
        • Предупреждение деструктивных проявлений в студенческой среде и влияния агрессивного информационного контента сети интернет
        • Онлайн-выставка «Помнить, чтобы не повторить»
        • Областная межвузовская конференция «Подвиг народа бессмертен»
        • Финал первого Республиканского интеллектуального турнира ScienceQuiz
        • Конференция «Актуальные вопросы коморбидности заболеваний в амбулаторной практике: от профилактики до лечения»
        • День семьи-2021
        • Диалоговая площадка с председателем Гродненского областного Совета депутатов
        • Праздничные городские мероприятия к Дню Победы
        • Областной этап конкурса «Королева студенчества-2021″
        • Праздничный концерт к 9 мая 2021
        • IV Республиканский гражданско-патриотический марафон «Вместе – за сильную и процветающую Беларусь!»
        • Университетский кубок КВН-2021
        • Музыкальная планета студенчества (завершение Дней ФИУ-2021)
        • Молодёжный круглый стол «Мы разные, но мы вместе»
        • Дни ФИУ-2021. Интеллектуальная игра «Что?Где?Когда?»
        • Неделя донорства в ГрГМУ
        • Творческая гостиная. Дни ФИУ-2021
        • Открытие XVIII студенческого фестиваля национальных культур
        • Передвижная мультимедийная выставка «Партизаны Беларуси»
        • Республиканский субботник-2021
        • Семинар «Человек внутри себя»
        • Международный конкурс «Здоровый образ жизни глазами разных поколений»
        • Вручение нагрудного знака «Жена пограничника»
        • Встреча с представителями медуниверситета г. Люблина
        • Королева Студенчества ГрГМУ — 2021
        • День открытых дверей-2021
        • Управление личными финансами (встреча с представителями «БПС-Сбербанк»)
        • Весенний «Мелотрек»
        • Праздничный концерт к 8 Марта
        • Диалоговая площадка с председателем Гродненского облисполкома
        • Расширенное заседание совета университета
        • Гродно — Молодежная столица Республики Беларусь-2021
        • Торжественное собрание, приуроченное к Дню защитника Отечества
        • Вручение свидетельства действительного члена Белорусской торгово-промышленной палаты
        • Новогодний ScienceQuiz
        • Финал IV Турнира трех вузов ScienseQuiz
        • Областной этап конкурса «Студент года-2020″
        • Семинар дистанционного обучения для сотрудников университетов из Беларуси «Обеспечение качества медицинского образования и образования в области общественного здоровья и здравоохранения»
        • Студент года — 2020
        • День Знаний — 2020
        • Церемония награждения лауреатов Премии Правительства в области качества
        • Военная присяга
        • Выпускной лечебного факультета-2020
        • Выпускной медико-психологического факультета-2020
        • Выпускной педиатрического факультета-2020
        • Выпускной факультета иностранных учащихся-2020
        • Распределение — 2020
        • Стоп коронавирус!
        • Навстречу весне — 2020
        • Профориентация — 18-я Международная специализированная выставка «Образование и карьера»
        • Спартакиада среди сотрудников «Здоровье-2020″
        • Конференция «Актуальные проблемы медицины»
        • Открытие общежития №4
        • Встреча Президента Беларуси со студентами и преподавателями медвузов
        • Новогодний утренник в ГрГМУ
        • XIX Республиканская студенческая конференция «Язык. Общество. Медицина»
        • Alma mater – любовь с первого курса
        • Актуальные вопросы коморбидности сердечно-сосудистых и костно-мышечных заболеваний в амбулаторной практике
        • Областной этап «Студент года-2019″
        • Финал Science Qiuz
        • Конференция «Актуальные проблемы психологии личности и социального взаимодействия»
        • Посвящение в студенты ФИУ
        • День Матери
        • День открытых дверей — 2019
        • Визит в Азербайджанский медицинский университет
        • Семинар-тренинг с международным участием «Современные аспекты сестринского образования»
        • Осенний легкоатлетический кросс — 2019
        • 40 лет педиатрическому факультету
        • День Знаний — 2019
        • Посвящение в первокурсники
        • Акция к Всемирному дню предотвращения суицида
        • Турслет-2019
        • Договор о создании филиала кафедры общей хирургии на базе Брестской областной больницы
        • День Независимости
        • Конференция «Современные технологии диагностики, терапии и реабилитации в пульмонологии»
        • Выпускной медико-диагностического, педиатрического факультетов и факультета иностранных учащихся — 2019
        • Выпускной медико-психологического факультета — 2019
        • Выпускной лечебного факультета — 2019
        • В добрый путь, выпускники!
        • Распределение по профилям субординатуры
        • Государственные экзамены
        • Интеллектуальная игра «Что? Где? Когда?»
        • Мистер и Мисс факультета иностранных учащихся-2019
        • День Победы
        • IV Республиканская студенческая военно-научная конференция «Этих дней не смолкнет слава»
        • Республиканский гражданско-патриотический марафон «Вместе — за сильную и процветающую Беларусь!»
        • Литературно-художественный марафон «На хвалях спадчыны маёй»
        • День открытых дверей-2019
        • Их имена останутся в наших сердцах
        • Областной этап конкурса «Королева Весна — 2019″
        • Королева Весна ГрГМУ — 2019
        • Профориентация «Абитуриент – 2019» (г. Барановичи)
        • Мероприятие «Карьера начинается с образования!» (г. Лида)
        • Итоговое распределение выпускников — 2019
        • «Навстречу весне — 2019″
        • Торжественная церемония, посвященная Дню защитника Отечества
        • Торжественное собрание к Дню защитника Отечества — 2019
        • Мистер ГрГМУ — 2019
        • Предварительное распределение выпускников 2019 года
        • Митинг-реквием у памятника воинам-интернационалистам
        • Профориентация «Образование и карьера» (г.Минск)
        • Итоговая коллегия главного управления здравоохранения Гродненского областного исполнительного комитета
        • Спартакиада «Здоровье — 2019»
        • Итоговая научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицины».
        • Расширенное заседание Совета университета.
        • Научно-практическая конференция «Симуляционные технологии обучения в подготовке медицинских работников: актуальность, проблемные вопросы внедрения и перспективы»
        • Конкурс первокурсников «Аlma mater – любовь с первого курса»
        • XVI съезд хирургов Республики Беларусь
        • Итоговая практика
        • Конкурс «Студент года-2018»
        • Совет университета
        • 1-й съезд Евразийской Аритмологической Ассоциации (14.09.2018 г.)
        • 1-й съезд Евразийской Аритмологической Ассоциации (13.09.2018 г.)
        • День знаний
        • День независимости Республики Беларусь
        • Церемония награждения победителей конкурса на соискание Премии СНГ
        • День герба и флага Республики Беларусь
        • «Стань донором – подари возможность жить»
        • VIII Международный межвузовский фестиваль современного танца «Сделай шаг вперед»
        • Конкурс грации и артистического мастерства «Королева Весна ГрГМУ – 2018»
        • Окончательное распределение выпускников 2018 года
        • Митинг-реквием, приуроченный к 75-летию хатынской трагедии
        • Областное совещание «Итоги работы терапевтической и кардиологической служб Гродненской области за 2017 год и задачи на 2018 год»
        • Конкурсное шоу-представление «Мистер ГрГМУ-2018»
        • Предварительное распределение выпускников 2018 года
        • Итоговая научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицины»
        • II Съезд учёных Республики Беларусь
        • Круглый стол факультета иностранных учащихся
        • «Молодежь мира: самобытность, солидарность, сотрудничество»
        • Заседание выездной сессии Гродненского областного Совета депутатов
        • Областной этап республиканского конкурса «Студент года-2017»
        • Встреча с председателем РОО «Белая Русь» Александром Михайловичем Радьковым
        • Конференция «Актуальные вопросы инфекционной патологии», 27.10.2017
        • XIX Всемирный фестиваль студентов и молодежи
        • Республиканская научно-практическая конференция «II Гродненские аритмологические чтения»
        • Областная научно-практическая конференция «V Гродненские гастроэнтерологические чтения»
        • Праздник, посвящённый 889-летию города Гродно
        • Круглый стол на тему «Место и роль РОО «Белая Русь» в политической системе Республики Беларусь» (22.09.2017)
        • ГрГМУ и Университет медицины и фармации (г.Тыргу-Муреш, Румыния) подписали Соглашение о сотрудничестве
        • 1 сентября — День знаний
        • Итоговая практика на кафедре военной и экстремальной медицины
        • Квалификационный экзамен у врачей-интернов
        • Встреча с Комиссией по присуждению Премии Правительства Республики Беларусь
        • Научно-практическая конференция «Амбулаторная терапия и хирургия заболеваний ЛОР-органов и сопряженной патологии других органов и систем»
        • День государственного флага и герба
        • 9 мая
        • Республиканская научно-практическая конференция с международным участием «V белорусско-польская дерматологическая конференция: дерматология без границ»
        • «Стань донором – подари возможность жить»
        • «Круглый стол» Постоянной комиссии Совета Республики Беларусь Национального собрания Республики Беларусь по образованию, науке, культуре и социальному развитию
        • Весенний кубок КВН «Юмор–это наука»
        • Мисс ГрГМУ-2017
        • Распределение 2017 года
        • Общегородской профориентационный день для учащихся гимназий, лицеев и школ
        • Праздничный концерт, посвященный Дню 8 марта
        • Конкурсное шоу-представление «Мистер ГрГМУ–2017»
        • «Масленица-2017»
        • Торжественное собрание и паздничный концерт, посвященный Дню защитника Отечества
        • Лекция профессора, д.м.н. О.О. Руммо
        • Итоговая научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицины»
        • Меморандум о сотрудничестве между областной организацией Белорусского общества Красного Креста и региональной организацией Красного Креста китайской провинции Хэнань
        • Визит делегации МГЭУ им. А.Д. Сахарова БГУ в ГрГМУ
        • «Студент года-2016»
        • Визит Чрезвычайного и Полномочного Посла Королевства Швеция в Республике Беларусь господина Мартина Оберга в ГрГМУ
        • Конкурс первокурсников «Аlma mater – любовь с первого курса»
        • День матери в ГрГМУ
        • Итоговая практика-2016
        • День знаний
        • Визит китайской делегации в ГрГМУ
        • Визит иностранной делегации из Вроцлавского медицинского университета (Республика Польша)
        • Торжественное мероприятие, посвященное профессиональному празднику – Дню медицинского работника
        • Визит ректора ГрГМУ Виктора Александровича Снежицкого в Индию
        • Республиканская университетская суббота-2016
        • Республиканская акция «Беларусь против табака»
        • Встреча с поэтессой Яниной Бокий
        • 9 мая — День Победы
        • Митинг, посвященный Дню Государственного герба и Государственного флага Республики Беларусь
        • Областная межвузовская студенческая научно-практическая конференция «1941 год: трагедия, героизм, память»
        • «Цветы Великой Победы»
        • Концерт народного ансамбля польской песни и танца «Хабры»
        • Суботнiк ў Мураванцы
        • «Мисс ГрГМУ-2016»
        • Визит академика РАМН, профессора Разумова Александра Николаевича в УО «ГрГМУ»
        • Визит иностранной делегации из Медицинского совета Мальдивской Республики
        • «Кубок ректора Гродненского государственного медицинского университета по дзюдо»
        • «Кубок Дружбы-2016» по мини-футболу среди мужских и женских команд медицинских учреждений образования Республики Беларусь
        • Распределение выпускников 2016 года
        • Визит Министра обороны Республики Беларусь на военную кафедру ГрГМУ
        • Визит Первого секретаря Посольства Израиля Анны Кейнан и директора Израильского культурного центра при Посольстве Израиля Рей Кейнан
        • Визит иностранной делегации из провинции Ганьсу Китайской Народной Республики в ГрГМУ
        • Состоялось открытие фотовыставки «По следам Библии»
        • «Кубок декана» медико-диагностического факультета по скалолазанию
        • Мистер ГрГМУ-2016
        • Приём Первого секретаря Посольства Израиля Анны Кейнан в ГрГМУ
        • Спартакиада «Здоровье» УО «ГрГМУ» среди сотрудников 2015-2016 учебного года
        • Визит Посла Республики Индия в УО «ГрГМУ»
        • Торжественное собрание и концерт, посвященный Дню защитника Отечества
        • Митинг-реквием, посвященный Дню памяти воинов-интернационалистов
        • Итоговое заседание коллегии главного управления идеологической работы, культуры и по делам молодежи Гродненского облисполкома
        • Итоговая научно-практическая конференция Гродненского государственного медицинского университета
        • Новогодний концерт
        • Открытие профессорского консультативного центра
        • Концерт-акция «Молодёжь против СПИДа»
        • «Студент года-2015»
        • Открытые лекции профессора, академика НАН Беларуси Островского Юрия Петровича
        • «Аlma mater – любовь с первого курса»
        • Открытая лекция Регионального директора ВОЗ госпожи Жужанны Якаб
        • «Открытый Кубок по велоориентированию РЦФВиС»
        • Совместное заседание Советов университетов г. Гродно
        • Встреча с Министром здравоохранения Республики Беларусь В.И. Жарко
        • День города
        • Дебаты «Врач — выбор жизни»
        • День города
        • Праздничный концерт «Для вас, первокурсники!»
        • Акция «Наш год – наш выбор»
        • День знаний
        • Открытое зачисление абитуриентов в УО «Гродненский государственный медицинский университет»
        • Принятие военной присяги студентами ГрГМУ
        • День Независимости Республики Беларусь
        • Вручение дипломов выпускникам 2015 года
        • Республиканская олимпиада студентов по педиатрии
        • Открытие памятного знака в честь погибших защитников
        • 9 мая
        • «Вторая белорусско-польская дерматологическая конференция: дерматология без границ»
        • Мистер университет
        • Мисс универитет
        • КВН
        • Гродненский государственный медицинский университет
        • Чествование наших ветеранов
        • 1 Мая
        • Cовместный субботник
      • Наши издания
      • Медицинский календарь
      • Университет в СМИ
      • Видео-презентации
    • Общественные объединения
    • Комиссия по противодействию коррупции
    • Образовательная деятельность
  • Абитуриентам
  • Студентам
  • Выпускникам
  • Слайдер
  • Последние обновления
  • Баннеры
  • Иностранному гражданину
  • Научная деятельность
  • Поиск

Эритропоэз это

Читать PDF
234.20 кб

Эффективность препаратов, стимулирующих эритропоэз, и их влияние на качество жизни больных с анемией

Романенко Николай Александрович, Бессмельцев Станислав Семёнович, Кармацкая Ирина Игоревна, Потихонова Надежда Александровна, Абдулкадыров Кудрат Мугутдинович

Цель. Изучить эффективность различных препаратов, стимулирующих эритропоэз, и оценить их влияние на качество жизни пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями и анемией. Методы.

Читать PDF
138.67 кб

Проблема соотношения пользы и риска терапии средствами, стимулирующими эритропоэз, при диабетической

Пчелин И. Ю., Шишкин А. Н., Коробицын Л. П.

Читать PDF
220.05 кб

Эритропоэз у больных с апластической анемией и тромбоцитопенической пурпурой в условиях высокогорья

Исмаилова А. З.

Читать PDF
166.98 кб

Резолюция экспертного совещания по использованию эритропоэз-стимулирующих препаратов в онкологии от

От редакции Уважаемые коллеги, доводим до вашего сведения, что в ноябре 2007 г. состоялось отрадное событие.

Читать PDF
321.88 кб

Эритропоэз в эритробластических островках костного мозга в токсигенном периоде после воздействия раз

А.Ф. Каюмова, И.Р. Габдулхакова, А.В. Богданова, М.Я. Фазлыахметова, О.В. Самоходова, А.Р. Шамратова

Цель.

Читать PDF
1.45 мб

Фармакоэкономическая эффективность применения препаратов, стимулирующих эритропоэз, для лечения анем

И.Н. Дьяков

Читать PDF
421.78 кб

Механизмы влияния оксигенобаротерапии на эритропоэз и обмен железа у беременных с анемией

Созонова Н.С., Чернова А.Л., Лазарев И.П., Шевлюкова Т.П.

Несмотря на значительные успехи в области профилактики и лечения анемии, проблема железодефицитных состояний не теряет своей актуальности, а коррекция этого осложнения гестации продолжает оставаться одним из приоритетных направлен

Читать PDF
187.33 кб

Раннее применение препаратов, стимулирующих эритропоэз, у недоношенных новорожденных или детей с низ

Ohlsson A., Aher S. M.

У недоношенных новорожденных наблюдается низкий уровень эритропоэтина (ЭПО) в плазме крови, что является основанием для использования препаратов, стимулирующих эритропоэз (ПСЭ), с целью профилактики или лечения анемии, для обеспеч

Читать PDF
93.69 кб

ЭРИТРОПОЭЗ И ОБМЕН ЖЕЛЕЗА ПРИ ОЖОГАХ

Баркова Э.Н., Балабанова Л.Ф., Жданова Е.В., Кузнецов В.В., Назаренко Е.В.

Цель исследования выявить особенности биоритмов обмена железа и эритропоэза при термической травме и определить их роль в патогенезе анемии. Материалы и методы.

Читать PDF
203.83 кб

Препараты эритропоэтина и железа в лечении анемии у больных хронической болезнью почек на преддиализ

Милованов Ю. С., Лысенко Л. В., Милованова С. Ю., Добросмыслов И. А.

Одной из актуальных проблем нефрологии является улучшение качества жизни и общей «выживаемости» больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН), распространенность которой в мире неуклонно нарастает.

Читать PDF
50.85 кб

Применение рекомбинантного человеческого эритропоэтина «Эпрекса» в лечении анемии у детей с онкопато

Чардымова Л. Р., Привалова Л. П., Паршиков В. В.

Читать PDF
563.17 кб

Оценка иммуномодулирующего эффекта терапии с применением эритропоэтина у больных ревматоидным артрит

Кожевников B. C., Коненкова Л. П., Сизиков А. Э., Зонова Е. В., Королев М. А., Пронкина Н. В., Евсюкова Е. В., Меняева Е. В., Фролов Н. И., Козлов В. А.

Целью данной работы явилась попытка оценки иммуномодулирующей активности эритропоэтина у больных ревматоидным артритом.

Читать PDF
204.04 кб

Влияние Рекормона на функциональную активность прекурсоров эритропоэза при миелосупрессии, вызванной

Удут Е. В.

Читать PDF
0.00 байт

Влияние эритропоэтина на клиническое течение хронической сердечной недостаточности у пациентов с ане

Провоторов В. М., Авдеева С. А.

Цель. Изучить клиническую эффективность корригирующей терапии анемии у больных хронической сердечной недостаточностью (ХСН) и ишемической болезнью сердца (ИБС). Материал и методы.

Читать PDF
0.00 байт

Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином при ишемии конечности pharmacological precondi

Колесник И. М., Покровский M. В., Покровская Т. Г., Гудырев О. С., Даниленко Л. М., Корокин М. В., Алехин С. А., Григоренко А. П., Старосельцева О. А., Должикова И. Н., Братчиков О. И., Молчанова О. В., Ефременкова Д. А., Полянская О. С., Филимонов В. А.

Исследована возможность стимуляции неоваскулогенеза дистантным ишемическим прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе в ишемизированной мышце голени крыс.

ЭПОЭТИН АЛЬФА (EPOETIN ALFA) ОПИСАНИЕ

Эпоэтин альфа следует с осторожностью применять у пациентов с эпилепсией, наличием судорожных припадков в анамнезе или состояниями, предрасполагающими к повышению судорожной готовности, такими как инфекции ЦНС или метастатическое поражение головного мозга.

Увеличение частоты развития тромботических осложнений наблюдалось у пациентов, получающих препараты, стимулирующие эритропоэз. Осложнения включают в себя тромбозы вен и артерий (в т.ч. летальные случаи), такие как тромбоз глубоких вен, эмболию легочной артерии, тромбоз сетчатки глаза и инфаркт миокарда. Также отмечались случаи острого нарушения мозгового кровоснабжения (включая ишемический инсульт, геморрагический инсульт и транзиторную ишемическую атаку). Пациентам с повышенным риском развития тромбоза или других сосудистых осложнений требуется тщательный медицинский контроль.

С осторожностью применяют при подагре.

До начала применения следует убедиться, что пациенты с артериальной гипертензией получали эффективную антигипертензивную терапию.

На фоне применения необходимо контролировать уровень АД, обращая внимание на возникновение или усиление необычных головных болей. При этом может потребоваться коррекция проводимой терапии или назначение антигипертензивных средств. Если несмотря на адекватную терапию АД не снижается, эпоэтин альфа следует отменить.

До начала применения эпоэтина альфа следует оценить состояние депо железа в организме. У большинства больных с хронической почечной недостаточностью, у онкологических и ВИЧ-инфицированных больных уровень ферритина в плазме крови уменьшается одновременно с увеличением гематокрита. Уровень ферритина необходимо определять в течение всего курса лечения. Если он составляет менее 100 нг/мл, рекомендуется заместительная терапия препаратами железа. Пациенты, сдающие аутологичную кровь и находящиеся в пред- или послеоперационном периоде, также должны получать дополнительно адекватное количество железа.

В период применения следует контролировать уровень гемоглобина, по крайней мере, 1 раз в неделю до достижения стабильного уровня, затем несколько реже.

С осторожностью следует применять у пациентов с порфирией. При хронической почечной недостаточности на фоне терапии эпоэтином альфа возможно обострение порфирии.

Пациентам, находящимся на гемодиализе, на фоне терапии эпоэтином альфа часто требуется увеличение дозы гепарина во время диализа из-за повышения гематокрита. При неадекватной дозе гепарина возможна окклюзия диализной системы.

У пациентов с хронической почечной недостаточностью и клинически выраженной ИБС или застойной сердечной недостаточностью поддерживающий уровень гемоглобина не должен превышать верхний предел оптимального рекомендованного уровня (не более 10-12 г/дл у взрослых).

При применении у пациентов с нарушениями функции печени возможно замедление биотрансформации эпоэтина альфа и выраженное усиление эритропоэза.

Нельзя полностью исключить возможность влияния эпоэтина альфа на рост некоторых типов опухолей, особенно на злокачественные новообразования костного мозга.

Следует соблюдать все специальные предупреждения и меры предосторожности, связанные с программой сбора аутологичной крови (это распространяется на всех пациентов, получающих эпоэтин альфа).

Терапевтическая эффективность эпоэтина альфа может уменьшиться при дефиците железа, фолиевой кислоты, витамина B12, интоксикации алюминием, интеркуррентных заболеваниях, скрытом кровотечении, гемолизе, фиброзе костного мозга.

Влияние на способность к управлению транспортными средствами и механизмами

При применении эпоэтина альфа до установления оптимальной поддерживающей дозы пациентам с ХПН следует избегать занятий потенциально опасными видами деятельности из-за увеличения риска развития артериальной гипертензии в начале терапии.

РАЦИОНАЛЬНАЯ ТАКТИКА ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЙ ТЕРАПИИ АНЕМИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ХИМИОТЕРАПИЕЙ: ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИМЕНЕНИЯ ЭРИТРОПОЭЗ-СТИМУЛИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ У ПАЦИЕНТОВ С ОНКОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В УСЛОВИЯХ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ | Ларионова

1. Roé E., García Muret M.P., Marcuello E. et al. Description and management of cutaneous side effects during cetuximab or erlotinib treatments: a prospective study of 30 patients. J Am Acad Dermatol 2006;55(3):429–37. DOI: 10.1016/j.jaad.2006.04.062. PMID: 16908348.

2. Herrstedt J. Supportive Care and Palliative Care-Cooperation or Competition? International Symposium on Supportive Care in Cancer, Miami, USA, June 26– 28, 2014.

3. Снеговой А.В., Давыдов М.И. Современные возможности поддерживающей терапии лекарственного противоопухолевого лечения. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина 2016;27(2):5–17..

4. Metcalf D. Concise review: hematopoietic stem cells and tissue stem cells: current concepts and unanswered questions. Stem Cells 2007;25(10):2390–5. DOI: 10.1634/stemcells.2007-0544. PMID: 17690176.

5. Снеговой А.В., Aapro M., Давиденко И.С. и др. Практические рекомендации по лечению анемии у онкологических больных. Злокачественные опухоли 2015;4s:316–26. DOI: 10.18027/2224-50572015-4s-316-326.

6. Kreys E.D., Koeller J.M. Documenting the Benefits and Cost Savings of a Large Multistate Cancer Pathway Program From a Payer’s Perspective. J Oncol Pract 2013;9(5):e241–7. DOI: 10.1200/JOP.2012.000871. PMID: 23943896.

7. Coleman R.E., Abrahamsson P.-A., Hadji P. Handbook of cancer-related bone disease. Bristol, UK: BioScientifica Ltd., 2010; 231 p.

8. Maddens S., Charruyer A., Plo I. et al. Kit signaling inhibits the sphingomyelinceramide pathway through PLC gamma 1: implication in stem cell factor radioprotective effect. Blood 2002;100(4):1294–301. PMID: 12149210.

9. Schwab M., Zanger U.M., Marx C. et al. German 5-FU Toxicity Study Group. Role of genetic and nongenetic factors for fluorouracil treatment-related severe toxicity: a prospective clinical trial by the German 5-FU Toxicity Study Group. J Clin Oncol 2008;26(13):2131–8. DOI: 10.1200/JCO.2006.10.4182. PMID: 18299612.

10. Food and Drug Administration. Jevtana (cabazitaxel) Injection Label Information. URL: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/201023lbl.pdf. Accessed November 12, 2015.

11. Food and Drug Administration. Taxotere (docetaxel) Injection Label Information. URL: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docslabel/2010/020449s059lbl.pdf. Accessed November 12, 2015.

12. Food and Drug Administration. Xtandi (enzalutamide) Capsules Label Information. URL: http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2012/203415lbl.pdf. Accessed November 12, 2015.

13. Groopman J., Itri L. Chemotherapy-induced anemia in adults: incidence and treatment. J Nat Cancer Inst 1999;91(19):1616–34. DOI: 10.1093/jnci/91.19.1616. PMID: 10511589.

14. Zhang G., Yang P., Guo P. et al. Unraveling the mystery of cancer metabolism in the genesis of tumor-initiating cells and development of cancer. Biochim Biophys Acta 2013;1836(1): 49–59. DOI: 10.1016/j.bbcan.2013.03.001. PMID: 23523716.

15. Caro J.J., Salas M., Ward A., Goss G. Anemia as an independent prognostic factor for survival in patients with cancer: a systemic, quantitative review. Cancer 2001;91(12):2214–21. DOI: 10.1002/1097-0142(20010615)91:12<2214::AID-CNCR1251>3.0.CO;2-P. PMID: 11413508.

16. URL: http://www.ncagip.ru/medical-services/price/trasfusion.php. Дата обращения 30.07.2016.

17. Hoff C.M., Lassen P., Eriksen J.G. et al. Does transfusion improve the outcome for HNSCC patients treated with radiotherapy? Results from the randomized DAHANCA 5 and 7 trials. Acta Oncologica 2011;50(7):1006–14. DOI: 10.3109/0284186X.2011.592650. PMID: 21790306.

18. Blajchman M.A. Transfusion immunomodulation or TRIM: what does it mean clinically? Hematology 2005;10(Suppl 1):208–14. DOI: 10.1080/10245330512331390447. PMID: 16188675.

19. Bohlius J., Wilson J., Seidenfeld J. et al. Recombinant human erythropoietins and cancer patients: updated meta-analysis of 57 studies including 9353 patients. J Natl Cancer Inst 2006;98(10):708–714. DOI: 10.1093/jnci/djj189. PMID: 16705125.

20. Bennett C.L., Silver S., Djulbegovic B. et al. Venous thromboembolism and mortality associated with recombinant erythropoietin and darbepoetin administration for the treatment of cancer-associated anemia. JAMA 2008;299(8):914–24. DOI: 10.1001/jama.299.8.914. PMID: 18314434.

21. Glaspy J., Crawford J., Vansteenkiste J. et al. Erythropoiesis-stimulating agents in oncology: a study-level meta-analysis of survival and other safety outcomes. Br J Cancer 2010;102(2):301–15. DOI: 10.1038/sj.bjc.6605498. PMID: 20051958.

22. Glaspy J., Osterborg A., Ludwig H. et al. Evaluation of the association between (Hb) events and safety outcomes in cancer patients with chemotherapy induced anemia: an integrated analysis of patient-level data from 6 randomized, placebo-controlled trials of darbepoetin. Eur J Cancer Supplements 2007;5(4):147–8. DOI: 10.1016/s13596349(07)70639-0.

23. Ludwig H., Crawford J., Osterborg A. et al. Pooled analysis of individual patientlevel data from all randomized, double blind, placebo-controlled trials of darbepoetin alfa in the treatment of patients with chemotherapy-induced anemia. J Clin Oncol 2009;27(17):2838–47. DOI: 10.1200/jco.2008.19.1130. PMID: 19380447.

24. Oncologic Drug Advisory Committee (ODAC) Meeting Information Package. Darbepoetin alfa (BLA#103951) and Epoetin alfa (BLA#103234). URL: http://www.scribd.com/doc/1117102/US-Foodand-Drug-Administration-20074301b20101-Amgen.

25. Tonelli M., Hemmelgarn B., Reiman T. et al. Benefits and harms of erythropoiesisstimulating agents for anemia related to cancer: a meta-analysis. CMAJ 2009;180(11):E62–E71. DOI: 10.1503/cmaj.090470. PMID: 19407261.

26. Glaspy J., Osterborg A., Ludwig H. et al. Evaluation of the association between (Hb) events and safety outcomes in cancer patients with chemotherapy induced anemia: an integrated analysis of patientlevel data from 6 randomized, placebocontrolled trials of darbepoetin. Eur J Cancer Supplement 2007;5(4):147–8. DOI: 10.1016/s1359-6349(07)70639-0.

27. Delarue R., Haioun C., Coiffier B. et al. Survival effect of darbepoetin alfa in patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) treated with immunochemotherapy: The LNH03-6B study. J Clin Oncol 2011;29(Suppl 15):9048. DOI: 10.1200/jco.2011.29.15_suppl.9048.

28. Technology appraisals: Guidance development Equality impact assessment for the multiple technology appraisal of erythropoiesis-stimulating agents (epoetin and darbepoetin) for treating cancer-treatment induced anaemia (including review of TA142). URL: www.nice.org.uk. Issue date: November 2014.

29. National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Cancerand ChemotherapyInduced Anemia. National Comprehensive Cancer Network, 2017. Version 1.2018; Fort Washington, PA.

30. Снеговой А.В., Кононенко И.Б., Ларионова В.Б. и др. Протоколы клинических рекомендаций поддерживающей терапии в онкологии. М.: АБВ-пресс, 2017. C. 11.

31. Федеральный закон от 05.04.2013 г. № 44-ФЗ «О контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд».

32. Приказ Министерства экономического развития РФ от 25.03.2014 г. № 155 «Об условиях допуска товаров, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных».

33. Постановление Правительства Российской Федерации от 05.02.2015 г. № 102 «Об ограничениях и условиях допуска отдельных видов медицинских изделий, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок для обеспечения государственных и муниципальных нужд».

34. Forbes C.A., Worthy G., Harker J. et al. Dose efficiency of erythropoiesis-stimulating agents for the treatment of patients with chemotherapy-induced anemia: a systematic review. Clin Ther 2014;36(4):594–610. DOI: 10.1016/j.clinthera.2014.02.007. PMID: 24656152.

35. Crathorne L., Huxley N., Haasova M. et al. The effectiveness and cost-effectiveness of erythropoiesis-stimulating agents (epoetin and darbepoetin) for treating cancer treatment-induced anaemia (including review of technology appraisal no. 142): a systematic review and economic model. Health Technol Assess 2016;20(13):1–588. DOI: 10.3310/hta20130. PMID: 26907163

36. Gabrilove J.L., Cleeland C.S., Livingston R.B. et al. Clinical evaluation of once-weekly dosing of epoetin alfa in chemotherapy patients: improvements in hemoglobin and quality of life are similar to threetimes-weekly dosing. J Clin Oncol 2001;19(11):2875–82. DOI: 10.1200/JCO.2001.19.11.2875. PMID: 11387360.

37. Pashos C.L., Larholt K., Fraser K.A. et al. Outcomes of erythropoiesis-stimulating agents in cancer patients with chemotherapy-induced anemia. Support Care Cancer 2012;20(1):159–65. DOI: 10.1007/s00520-010-1083-7. PMID: 21359879.

38. Steensma D.P., Dakhil S.R., Novotny P.J. et al. A randomized comparison of once weekly epoetin alfa to extended schedule epoetin or darbepoetin in chemotherapyassociated anemia. Am J Hematol 2015;90(10):877–81. DOI: 10.1002/ajh.24110. PMID: 26149465.

39. Воробьев П.А., Авксентьева М.В., Борисенко О.В. и др. Клинико-экономический анализ. 3-е изд., доп., с приложениями. М.: НЬЮДИАМЕД; 2008, 226–9.

40. Постановление Правительства Москвы от 24 февраля 2010 г. №163-ПП «Об установлении торговых надбавок к ценам на лекарственные средства, включенные в перечень ЖНВЛП».

41. Официальная инструкция по применению лекарственного препарата Аранесп®. Государственный реестр лекарственных средств. Официальный сайт [Электронный ресурс]. Дата обращения: 24.10.2017 г.

42. Официальная инструкция по применению лекарственного препарата Эральфон®. Государственный реестр лекарственных средств. Официальный сайт, [электронный ресурс]. Дата обращения: 24.10.2017 г.

43. Тарифное соглашение на оплату медицинской помощи, оказываемой по территориальной программе обязательного медицинского страхования города Москвы на 2017 год от 29.12.2016 г., Московский городской фонд обязательного медицинского страхования. .

44. Приложение № 6 к Тарифному соглашению на оплату медицинской помощи, оказываемой по территориальной программе обязательного медицинского страхования города Москвы на 2017 год от 29.12.2016 год, Московский городской фонд обязательного медицинского страхования. .

45. Приложение № 8.1 к Тарифному соглашению на оплату медицинской помощи, оказываемой по территориальной программе обязательного медицинского страхования города Москвы на 2017 год от 29.12.2016 год, Московский городской фонд обязательного медицинского страхования.

46. Rashid N., Koh H.A., Baca H.C. et al. Clinical Impact of Chemotherapy-Related Adverse Events in Patients with Metastatic Breast Cancer in an Integrated Health Care System. J Manag Care Spec Pharm 2015;21(10):863–71. DOI: 10.18553/jmcp.2015.21.10.863. PMID: 26402387.

47. Ludwig H., Aapro M., Bokemeyer C. et al. A European patient record study on diagnosis and treatment of chemotherapyinduced anaemia. Support Care Cancer 2014;22(8):2197–206. DOI: 10.1007/s00520-014-2189-0. PMID: 24659244.

48. Снеговой А.В. Рациональная тактика поддерживающей терапии лекарственного противоопухолевого лечения. Дис. … д-ра мед. наук. М., 2017.

49. Repetto L., CIPOMO investigators. Incidence and clinical impact of chemotherapy induced myelotoxicity in cancer patients: an observational retrospective survey. Crit Rev Oncol Hematol 2009;72(2):170–9. DOI: 10.1016/j.critrevonc.2009.03.004. PMID: 19406660.

50. Avila M.A., Berasain C., Torres L. et al. Reduced mRNA abundance of the main enzymes involved in methionine metabolism in human liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2000;33(6):907–14. DOI: 10.1016/S01688278(00)80122-1. PMID: 11131452.

ПРОБЛЕМА СООТНОШЕНИЯ ПОЛЬЗЫ И РИСКА ТЕРАПИИ СРЕДСТВАМИ, СТИМУЛИРУЮЩИМИ ЭРИТРОПОЭЗ, ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ | Пчелин

1. Elliott S, Pham E, Macdougall IC. Erythropoietins: A common mechanism of action. Exp Hematol 2008; 36: 1573-1584

2. Шестакова МВ, Дедов ИИ. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек. ООО «Медицинское информационное агентство», М., 2009; 355-358

3. Kestenbaum B, Kimmel PL, Malozowski S et al. Reevaluating erythropoiesis-stimulating agents. N Engl J Med 2010; 362: 1742-1743

4. Bosman DR, Winkler AS, Marsden JT et al. Anaemia associated with erythropoietin deficiency occurs early in diabetic nephropathy. Diabetes Care 2001; 24: 495-499

5. Thomas MC, MacIsaac RJ, Tsalamandris C et al. Unrecognized Anemia in Patients with Diabetes: A cross-sectional survey. Diabetes Care 2003; 26: 1164-1169

6. McGill JB, Bell DSH. Anemia and the role of erythropoietin in diabetes. J Diabetes Complications 2006; 20: 262-272

7. McCullough PA, Bakris GL, Owen WF. Slowing the progression of diabetic nephropathy and its cardiovascular consequences. Am Heart J 2004; 48: 243-251

8. Najafian B, Mauer M. Progression of diabetic nephropathy in type 1 diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract 2009; 83: 1-8

9. Hahr AJ, Molitch ME. Diabetes, Cardiovascular Risk and Nephropathy. Cardiol Clin 2010. In press

10. Conti AA, Minelli M, Gensini GF. Global management of high risk patients: Integrated primary cardiovascular prevention in diabetics. International Congress Series 2007; 1303: 10-20

11. Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY et al. Baseline characteristics in the Trial to Reduce Cardiovascular Events With Aranesp Therapy (TREAT). Am J Kidney Dis 2009; 54: 59-69

12. Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY et al. A trial of darbepoetin alfa in type 2 diabetes and chronic kidney disease. N Engl J Med 2009; 361: 2019-2032

13. Wright RJ, Kanagasundaram NS, Quinton R et al. Darbepoetin alfa and chronic kidney disease. N Engl J Med 2010; 362: 653-654

14. Marsden PA. Treatment of Anemia in Chronic Kidney Disease — Strategies Based on Evidence. N Engl J Med 2009; 361: 2089-2090

15. Drueke TB, Locatelli F, Clyne N et al. Normalization of Hemoglobin Level in Patients with Chronic Kidney Disease and Anemia. N Engl J Med 2006; 355: 2071-2084

16. Singh AK, Szczech L, Tang KL et al. Correction of Anemia with Epoetin Alfa in Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 2006; 355: 2085-2098

17. Zoppini G, Targher G, Chonchol M et al. Anaemia, independent of chronic kidney disease, predicts all-cause and cardiovascular mortality in type 2 diabetic patients. Atherosclerosis 2010; 210: 575-580

18. Joss N, Patel R, Paterson K et al. Anaemia is common and predicts mortality in diabetic nephropathy. QJM 2007; 100: 641-647

19. Unger EF, Thompson AM, Blank MJ. Erythropoiesis-Stimulating Agents – Time for a reevaluation. N Engl J Med 2010; 362: 189-192

20. Vaziri ND, Zhou XJ. Potential mechanisms of adverse outcomes in trials of anemia correction with erythropoietin in chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 1082-1088

21. Konstantinopoulos PA, Karamouzis MV, Papavassiliou AG. Selective modulation of the erythropoietic and tissue-protective effects of erythropoietin: Time to reach the full therapeutic potential of erythropoietin. Biochim Biophys Acta 2007; 1776: 1-9

22. Ruifrok WT, Boer RA, Westenbrink BD et al. Erythropoietin in cardiac disease: New features of an old drug. Eur J Pharmacol 2008; 585: 270-277

23. Miura T, Miki T, Nishihara M et al. Molecular mechanisms of cardiomyocyte protection against ischemia/reperfusion injury by erythropoietin (EPO) receptor activation. J Mol Cell Cardiol 2006; 41: 1043-1044

24. Cooij MA, Groenendaal F, Kavelaars A et al. Neuroprotective properties and mechanisms of erythropoietin in ‘in vitro’ and ‘in vivo’ experimental models for hypoxia/ischemia. Brain Res Rev 2008; 59: 22-33

25. Pallet N, Bouvier N, Legendre C et al. Antiapoptotic properties of recombinant human erythropoietin protects against tubular cyclosporine toxicity. Pharmacol Res 2010; 61: 71-75

26. Wang W, Zhang J. Protective effect of erythropoietin against aristolochic acid-induced apoptosis in renal tubular epithelial cells. Eur J Pharmacol 2008; 588: 135-140

27. Chang YK, Choi DE, Na KR et al. Erythropoietin Attenuates Renal Injury in an Experimental Model of Rat Unilateral Ureteral Obstruction via Anti-Inflammatory and Anti-Apoptotic effects. J Urol 2009; 181: 1434-1443

28. Sekiguchi N, Inoguchi T, Kobayashi K et al. Erythropoietin attenuated high glucose-induced apoptosis in cultured human aortic endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2005; 34: 218-222

29. Quin C, Xiao Y, Zhong Q et al. Anti-inflammatory effect of erythropoietin pretreatment on cardiomyocytes with hypoxia/reoxygenation injury and the possible mechanism. Chin J Traumatol 2008; 11: 352-358

30. Hirata A, Minamino T, Asanuma H et al. Erythropoietin Enhances Neovascularization of Ischemic Myocardium and Improves Left Ventricular Dysfunction After Myocardial Infarction in Dogs. J Am Coll Cardiol 2006; 48: 176-184

31. Lykissas MG, Sakellariou E, Vekris MD et al. Axonal regeneration stimulated by erythropoietin: An experimental study in rats. J Neurosci Methods 2007; 164: 107-115

32. Vaziri ND. Cardiovascular effects of erythropoietin and anemia correction. Curr Opin Nephrol and Hypertens 2001; 10: 633-637

33. Zhang Z, Barrett JD, Jamgotchian N et al. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) stimulates gene transcription of renin angiotensin system and growth factor mRNAs in rat vascular smooth muscle cells [abstract]. J Investig Med 1996; 44: 91

34. Vaziri ND. Mechanism of erythropoietin-induced hypertension. Am J Kidney Dis 1999; 33: 821-828

35. Akimoto T, Kuzano E, Fujita N et al. Erythropoietin modulates angiotensin II-or noradrenaline-induced Ca2+ mobilization in cultured rat vascular smooth-muscle cells. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 491-499

36. Vogel V, Kramer HJ, Bдcker A et al. Effects of Erythropoietin on Endothelin-1 Synthesis and the Cellular Calcium Messenger System in Vascular Endothelial Cells. Am J Hypertens 1997; 10: 289-296

37. Eckardt KU. Erythropoietin and microvascular diabetic complications. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 388-390

38. Nagarajan S, Mansfield E, Hsieh S et al. Transplant reno-vascular stenoses associated with early erythropoietin use. Clin Transplant 2007; 21: 597-608

39. Fuste B, Seradell M, Escolar G et al. Erythropoietin triggers a signaling pathway in endothelial cells and increases the thrombogenicity of their extracellular matrices in vitro. Thromb Haemost 2002; 88: 687-685

40. Kahraman S, Yilmaz R, Kirkpantur A et al. Impact of rhEPO therapy initiation on soluble adhesion molecule levels in haemodialysis patients. Nephrology 2005; 10: 64-69

41. Гуревич КЯ, ред. Человеческий рекомбинантный эритропоэтин (Эпокрин) в лечении анемии (Практическое руководство). ИКФ «Фолиант», СПб., 2001; 45-46

42. Пчелин И. Ю, Шишкин А Н. Механизмы развития и клиническое значение анемии у пациентов с сахарным диабетом 1 и 2 типа. Вестн С.-Петерб ун-та Сер 11 2010; (2): 73-80

43. Kazory A, Ross EA. Anemia: The Point of Convergence or Divergence for Kidney Disease and Heart Failure? J Am Coll Cardiol 2009; 53: 639-647

44. Kleijn L, Boer RA, Voors AA. Should erythropoietin treatment in chronic heart failure be haemoglobin targeted? Eur J Heart Fail 2010; 12: 215-216

45. Goldsmith D, Covic A. Time to Reconsider Evidence for Anaemia Treatment (TREAT) = Essential Safety Arguments (ESA). Nephrol Dial Transplant 2010. In press

Проблема соотношения пользы и риска терапии средствами, стимулирующими эритропоэз, при диабетической нефропатии Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© И.Ю.Пчелин, А.Н.Шишкин, Л.П.Коробицын, 2010 УДК 616.379-088.64:616.61]:616.155.1-007.1-08

И.Ю. Пчелин1, А.Н. Шишкин1, Л.П. Коробицын2

ПРОБЛЕМА СООТНОШЕНИЯ ПОЛЬЗЫ И РИСКА ТЕРАПИИ СРЕДСТВАМИ, СТИМУЛИРУЮЩИМИ ЭРИТРОПОЭЗ, ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ

I.Yu. Pchelin, A.N. Shishkin, L.P. Korobitsyn

PROBLEM OF THE THERAPY USE AND RISK RATIO OF THE MEDICATION WHICH STIMULATE ERTHROPOESIS IN DIABETIC NEPHROPATHY

1Кафедра факультетской терапии медицинского факультета Санкт-Петербургского государственного университета, 2 ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия

РЕФЕРАТ

Более 20 лет для коррекции анемии у пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) применяются средства, стимулирующие эритропоэз (ССЭ). В настоящее время в России доступно несколько препаратов из группы ССЭ: эпоэтин-а (эпокрин, эральфон, эпрекс), эпоэтин-р (рекормон), эпоэтин-ю (эпомакс), дарбэпоэтин-а (аранесп), пегилированный эпоэтин-р (мир-цера). Несмотря на то, что изучению эффективности терапии ССЭ и её влияния на прогрессирование ХБП и сердечнососудистых осложнений было посвящено большое количество исследований, до сих пор отсутствует единое мнение относительно показаний к проведению терапии ССЭ, оптимальных терапевтических схем и целевых уровней гемоглобина. Ключевые слова: анемия, хроническая болезнь почек, диабетическая нефропатия, эритропоэтин, стимуляторы эритро-поэза, побочные эффекты.

ABSTRACT

For more than 20 years to correct anemia in patients with chronic kidney disease (CKD) are used medications which stimulate erythropoesis (MSE). Currently in Russia there are multiple preparations of the MSE group: epoetin-а (epokrin, eralfon, Eprex), epoetin-р (Recormon), epoetin-ю (epomaks), darbepoetin-а (Aranesp), pegylated epoetin-р (Mircera ). Despite the fact that the study of the effectiveness of therapy MSE and its impact on the progression of CKD and cardiovascular disease was the subject of many studies, there is still no consensus regarding indications for treatment of MSE, the optimal therapeutic regimen and target hemoglobin levels.

Key words: anemia, chronic kidney disease, diabetic nephropathy, erythropoietin, erythropoesis stimulants, side effects.

Более 20 лет для коррекции анемии у пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) применяются средства, стимулирующие эритропоэз (ССЭ) [1]. В настоящее время в России доступно несколько препаратов из группы ССЭ: эпоэтин-а (эпокрин, эральфон, эпрекс), эпоэтин-Р (рекормон), эпоэтин-ю (эпомакс), дарбэпоэтин-а (аранесп), пегилированный эпоэтин-в (мирцера) [2]. Несмотря на то, что изучению эффективности терапии ССЭ и её влияния на прогрессирование ХБП и сердечно-сосудистых осложнений было посвящено большое количество исследований, до сих пор отсутствует единое мнение относительно показаний к проведению терапии ССЭ, оптимальных терапевтических схем и целевых уровней гемоглобина [3].

Пчелин И.Ю. 197227, Санкт-Петербург, СПбГУ, медицинскиий факультет, пр. Испытателей, д. 6., к. 1, кв. 112; Тел.: +79213614700. E-mail: [email protected]

Особое значение эта проблема приобретает при лечении пациентов с диабетической нефропатией, поскольку для этой группы больных свойственны раннее развитие анемии [4-6], прогрессирующее течение ХБП [7, 8], наличие макрососудистых поражений и чрезвычайно высокий сердечно-сосудистый риск [9, 10].

На настоящий момент наиболее крупным исследованием по изучению влияния терапии ССЭ на риск сердечно-сосудистых событий и скорость прогрессирования ХБП у пациентов с диабетической нефропатией является исследование TREAT (Trial to Reduce Cardiovascular Events With Aranesp Therapy), результаты которого были опубликованы в 2009 г. В исследовании принимали участие 4038 пациентов с сахарным диабетом типа 2, скоростью клубочковой фильтрации (СКФ) от 20 до 60 мл/мин на 1,73 м2 поверхности тела (рас-

считанной по формуле MDRD-4) и анемией (уровнем гемоглобина не более 110 г/л) на додиализном этапе лечения. Больные были рандомизированы в одну из двух групп: пациенты из первой группы получали терапию дарбэпоэтином в дозе, необходимой для достижения целевого уровня гемоглобина 130 г/л, пациенты из второй группы — плацебо (в случае снижения гемоглобина ниже уровня 90 г/л эти больные также получали дарбэпоэтин в качестве «терапии спасения») [11]. Вопреки ожиданиям, результаты исследования TREAT свидетельствовали о том, что применение дарбэпоэтина у пациентов с диабетической нефропатией не оказывало статистически значимого влияния на риск смерти, сердечно-сосудистых событий и развития терминальной хронической почечной недостаточности, хотя и приводило к достоверному увеличению уровня гемоглобина, уменьшению потребности в гемотрансфузиях и умеренно выраженному улучшению качества жизни. В то же время пациенты, получавшие дарбэпоэтин, имели повышенный риск острых нарушений мозгового кровообращения и тромбоэмболических осложнений [12].

Некоторые особенности дизайна исследования TREAT представляются несоответствующими современным рекомендациям по ведению нефроло-гических больных и являются уязвимыми для критики. К ним относятся: высокий целевой уровень гемоглобина (130 г/л), отсутствие терапии препаратами железа в качестве обязательного компонента лечения и недоучёт факторов, способствующих развитию резистентности к ССЭ [13]. Кроме того, различия между группами больных, получавшими дарбэпотин и плацебо, были нивелированы использованием дарбэпоэтина в качестве «терапии спасения» при снижении гемоглобина ниже уровня 90 г/л у пациентов, получавших плацебо [14].

Проблема определения оптимального уровня гемоглобина для пациентов c ХБП, не получающих заместительной почечной терапии, рассматривалась также в многоцентровых исследованиях CREATE (Cardiovascular Risk Reduction by Early Anemia Treatment with Epoetin Beta) и CHOIR (Correction of Hemoglobin and Outcomes in Renal Insufficiency). В исследовании CREATE, включавшем около 20% пациентов с сахарным диабетом, было показано, что раннее применение эпоэтина-ß с целью достижения нормального уровня гемоглобина (130-150 г/л) не снижает риска сердечно-сосудистых событий при ХБП по сравнению с частичной коррекцией анемии (целевой уровень гемоглобина — от 105 до 115 г/л) [15]. Результаты же исследования CHOIR, включавшего около 50% пациентов с сахарным диабетом, свидетельство-

вали о повышении риска сердечно-сосудистых событий при использовании высокого целевого уровня гемоглобина (135 г/л) по сравнению с относительно низким (113 г/л) [16].

Вышеприведённые данные входят в кажущееся противоречие с результатами других исследований, которые указывают на то, что наличие анемии у пациентов с ХБП ассоциировано с прогрес-сированием сердечно-сосудистых осложнений [17, 18]. Для разрешения этого противоречия необходимо рассмотреть возможные механизмы неблагоприятного влияния антианемической терапии с использованием ССЭ на сердечно-сосудистую систему.

В качестве факторов, способных приводить к увеличению риска сердечно-сосудистых событий у пациентов с ХБП при использовании ССЭ в дозах, необходимых для достижения высоких целевых значений концентрации гемоглобина, в научной литературе предполагались: 1) собственно высокий уровень гемоглобина; 2) темпы роста концентрации гемоглобина, её колебания, превышение целевых значений; 3) негемопоэтические эффекты данной группы препаратов [19]. Однако при проведении вторичного анализа данных многоцентровых исследований подтвердить наличие непосредственной связи между высоким значением гемоглобина, достигнутым в ходе лечения ССЭ, и сердечнососудистым риском не удалось. Напротив, сердечно-сосудистые события более часто наблюдались у пациентов, резистентных к терапии ССЭ, т.е. не достигших высоких целевых уровней гемоглобина [20]. В связи с этим в настоящее время активно обсуждаются негемопоэтические эффекты ССЭ и их клиническое значение при проведении антианемической терапии у пациентов с диабетической нефропатией.

В ряде экспериментальных исследований было показано кардио-, нефро- и нейропротективное действие эритропоэтина и его аналогов, не связанное со стимуляцией эритропоэза и увеличением транспорта кислорода кровью [21, 22]. Одним из механизмов, лежащих в основе этих эффектов, как было установлено, является непосредственное торможение апоптоза различных типов клеток. Антиапоп-тотическое действие ССЭ способствует уменьшению повреждения клеток миокарда и коры головного мозга под действием ишемии-реперфузии [23, 24], эпителия канальцев почек под действием нефротоксических лекарственных препаратов [25, 26] и обструкции мочеточников [27], эндоте-лиальных клеток под действием гипергликемии [28]. Кроме того, ССЭ ингибируют экспрессию провоспалительных цитокинов (фактора некроза

опухолей-а, интерлейкина-1, интерлейкина-6), что также опосредованно препятствует апоптозу кар-диомиоцитов и клеток других типов [29]. Среди прочих благоприятных эффектов ССЭ можно отметить стимуляцию неоваскуляризации миокарда [30] и положительное влияние на регенерацию нервной ткани [31].

В то же время ССЭ имеют немало потенциально неблагоприятных эффектов, выраженность которых увеличивается при использовании высоких доз препаратов. К ним относятся: повышение артериального давления (что имеет особое значение при сахарном диабете), стимуляция пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов, влияние на тромбоциты и систему свёртывания крови [20].

Повышение артериального давления на фоне лечения ССЭ, как было показано в экспериментальных исследованиях, может происходить как при наличии достаточных запасов железа в организме, так и при его дефиците (несмотря на перси-стирование анемии в последнем случае) [32]. Поэтому в настоящее время считается, что решающее значение в развитии этого побочного эффекта терапии имеют именно негемопоэтические эффекты ССЭ. Основными механизмами развития ги-пертензии под действием ССЭ являются: 1) активация ренин-ангиотензиновой системы за счёт стимуляции синтеза ренина и ангиотензиногена, экспрессии ангиотензиновых рецепторов [33]; 2) увеличение соотношения концентраций тромбок-сана и простациклина в плазме крови [34]; 3) повышение внутриклеточной концентрации ионизированного кальция в гладкомышечных клетках [35]; 4) повышение концентрации эндотелина-1 в плазме крови [36].

Стимуляция пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов под действием ССЭ может способствовать прогрессированию пролиферативной диабетической ретинопатии [37], развитию стеноза почечной артерии после трансплантации почки [38] и ремоделированию сердечно-сосудистой системы в результате увеличения продукции факторов роста и профибротических цитокинов [34].

Влияние ССЭ на систему гемостаза включает увеличение количества тромбоцитов в крови за счёт усиления эффекта тромбопоэтина, их активацию посредством повышения внутриклеточной концентрации ионизированного кальция и стимуляцию продукции фактора Виллебранда, Е-селекти-на и Р-селектина [39, 40].

Таким образом, применение ССЭ в неоправданно высоких дозах в результате действия вышеопи-

санных факторов может приводить к ремоделированию сердечно-сосудистой системы, увеличению вероятности тромбоза коронарный артерий, микрососудистому поражению почек и прогрессиро-ванию нефросклероза, что повышает риск возникновения сердечно-сосудистык событий и развития терминальной хронической почечной недостаточности [20].

Необходимость применения высоких доз ССЭ в клинической практике, как правило, связана с резистентностью к проводимому лечению (перси-стированием анемии) [41]. У пациентов с диабетической нефропатией резистентность к ССЭ может быть обусловлена дефицитом железа, фолие-вой кислоты и витамина B12, наличием инфекционного процесса и системного воспаления, побочными эффектами сахароснижающих препаратов, гемолизом и другими факторами [42]. Масштабы проблемы резистентности к антианемической терапии можно оценить по результатам вторичных анализов данных многоцентровых исследований. Установлено, что у больных из групп с высоким целевым уровнем гемоглобина ожидаемые показатели были достигнуты менее чем в половине случаев (21% в исследовании CHOIR и 38% в исследовании CREATE). При этом средняя доза ССЭ, которую получали пациенты в группе с высоким целевым уровнем гемоглобина, была в 2-3 раза выше той, которую получали пациенты с более низким целевым уровнем гемоглобина [20].

С учётом вышеприведённых фактов в научной литературе последних лет обсуждаются следующие вопросы: 1) Должна ли в принципе терапия ССЭ быть нацеленной на достижение определённого уровня гемоглобина? 2) Должны ли быть какие-то отличия в тактике применения ССЭ у пациентов с анемией при диабетической нефропатии и пациентов с анемией, развитие которой обусловлено ХБП другой этиологии или сердечной недостаточностью? 3) Как соотносятся эффекты ССЭ и препаратов железа при их совместном применении? [43-45].

Таким образом, в настоящее время очевидна необходимость проведения дополнительных исследований по изучению клинической эффективности и безопасности различны« схем применения ССЭ у пациентов с диабетической нефропатией. Общим направлением этих исследований должен стать поиск возможностей оптимизации соотношения терапевтических и побочных эффектов ССЭ. Дальнейшего изучения требуют механизмы и клиническое значение тромбопоэтического действия и других потенциально неблагоприятных эффектов ССЭ.

Существующие рекомендации по проведению

антианемической терапии у пациентов с ХБП, возможно, требуют коррекции для пациентов с диабетической нефропатией, которые имеют наиболее высокий риск сердечно-сосудистых событий. До появления результатов новых исследований целевой уровень гемоглобина у пациентов с диабетической нефропатией, получающих ССЭ на додиа-лизном этапе лечения, не должен превышать 120 г/л. К назначению ССЭ на ранних стадиях диабетического поражения почек необходимо подходить индивидуально, с учётом клинической картины и значимости анемии, зависящей от степени физической активности и выраженности сердечно-сосудистой патологии. С особой осторожностью следует применять ССЭ при артериальной гипертензии и наличии факторов риска тромбоэмболических осложнений. Для повышения эффективности терапии ССЭ при диабетической нефропатии необходимо своевременно выявлять и устранять факторы, способствующие возникновению резистентности к этой группе препаратов.

БИБЛИОАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Elliotts, Pham E, Macdougall IC. Erythropoietins: A common mechanism of action. Exp Hematol 2008; 36: 15731584

2. Шестакова МВ, Дедов ИИ. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек. ООО «Медицинское информационное агентство», М., 2009; 355-358

3. Kestenbaum B, Kimmel PL, Malozowski S etal. Reevaluating erythropoiesis-stimulating agents. N Engl J Med 2010; 362: 1742-1743

4. Bosman DR, Winkler AS, Marsden JT et al. Anaemia associated with erythropoietin deficiency occurs early in diabetic nephropathy. Diabetes Care 2001; 24: 495-499

5. Thomas MC, MacIsaac RJ, Tsalamandris C etal. Unrecognized Anemia in Patients with Diabetes: A cross-sectional survey. Diabetes Care 2003; 26: 1164-1169

6. McGillJB, Bell DSH. Anemia and the role of erythropoietin in diabetes. J Diabetes Complications 2006; 20: 262-272

7. McCullough PA, Bakris GL, Owen WF. Slowing the progression of diabetic nephropathy and its cardiovascular consequences. Am Heart J 2004; 48: 243-251

8. Najafian B, MauerM. Progression of diabetic nephropathy in type 1 diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract 2009; 83: 1-8

9. HahrAJ, Molitch ME. Diabetes, Cardiovascular Risk and Nephropathy. Cardiol Clin 2010. In press

10. Conti AA, Minelli M, Gensini GF. Global management of high risk patients: Integrated primary cardiovascular prevention in diabetics. International Congress Series 2007; 1303: 10-20

11. Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY etal. Baseline characteristics in the Trial to Reduce Cardiovascular Events With Aranesp Therapy (TREAT). Am J Kidney Dis 2009; 54: 59-69

12. Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY etal. A trial of darbepoetin alfa in type 2 diabetes and chronic kidney disease. N Engl J Med 2009; 361:2019-2032

13. Wright RJ, Kanagasundaram NS, Quinton R et al. Darbepoetin alfa and chronic kidney disease. N Engl J Med 2010; 362: 653-654

14. Marsden PA. Treatment of Anemia in Chronic Kidney Disease — Strategies Based on Evidence. N Engl J Med 2009; 361:2089-2090

15. DruekeTB, Locatelli F, Clyne N etal. Normalization of Hemoglobin Level in Patients with Chronic Kidney Disease and Anemia. N Engl J Med 2006; 355: 2071-2084

16. Singh AK, Szczech L, Tang KL etal. Correction of Anemia with Epoetin Alfa in Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 2006; 355: 2085-2098

17. Zoppini G, Targher G, Chonchol M et al. Anaemia, independent of chronic kidney disease, predicts all-cause and cardiovascular mortality in type 2 diabetic patients. Atherosclerosis 2010; 210: 575-580

18. Joss N, Patel R, Paterson K etal. Anaemia is common and predicts mortality in diabetic nephropathy. QJM 2007; 100: 641-647

19. Unger EF, Thompson AM, Blank MJ. Erythropoiesis-Stimulating Agents — Time for a reevaluation. N Engl J Med 2010; 362: 189-192

20. Vaziri ND, ZhouXJ. Potential mechanisms of adverse outcomes in trials of anemia correction with erythropoietin in chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 10821088

21. Konstantinopoulos PA, Karamouzis MV, Papavassiliou AG. Selective modulation of the erythropoietic and tissue-protective effects of erythropoietin: Time to reach the full therapeutic potential of erythropoietin. Biochim Biophys Acta 2007; 1776: 1-9

22. RuifrokWT, Boer RA, Westenbrink BD et al. Erythropoietin in cardiac disease: New features of an old drug. Eur J Pharmacol 2008; 585: 270-277

23. MiuraT, MikiT, NishiharaM etal. Molecular mechanisms of cardiomyocyte protection against ischemia/reperfusion injury by erythropoietin (EPO) receptor activation. J Mol Cell Cardiol 2006; 41: 1043-1044

24. Cooij MA, Groenendaal F, Kavelaars A etal. Neuroprotective properties and mechanisms of erythropoietin in ‘in vitro’ and ‘in vivo’ experimental models for hypoxia/ ischemia. Brain Res Rev 2008; 59: 22-33

25. Pallet N, BouvierN, Legendre C etal. Antiapoptotic properties of recombinant human erythropoietin protects against tubular cyclosporine toxicity. Pharmacol Res 2010; 61: 71-75

26. Wang W, Zhang J. Protective effect of erythropoietin against aristolochic acid-induced apoptosis in renal tubular epithelial cells. Eur J Pharmacol 2008; 588: 135-140

27. Chang YK, Choi DE, Na KR etal. Erythropoietin Attenuates Renal Injury in an Experimental Model of Rat Unilateral Ureteral Obstruction via Anti-Inflammatory and Anti-Apoptotic effects. J Urol 2009; 181: 1434-1443

28. Sekiguchi N, Inoguchi T, Kobayashi K etal. Erythropoietin attenuated high glucose-induced apoptosis in cultured human aortic endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2005; 34: 218-222

29. Quin C, XiaoY Zhong Q etal. Anti-inflammatory effect of erythropoietin pretreatment on cardiomyocytes with hypoxia/ reoxygenation injury and the possible mechanism. Chin J Traumatol 2008; 11: 352-358

30. HirataA, MinaminoT, Asanuma H etal. Erythropoietin Enhances Neovascularization of Ischemic Myocardium and Improves Left Ventricular Dysfunction After Myocardial Infarction in Dogs. J Am Coll Cardiol 2006; 48: 176-184

31. Lykissas MG, Sakellariou E, Vekris MD et al. Axonal regeneration stimulated by erythropoietin: An experimental study in rats. J Neurosci Methods 2007; 164: 107-115

32. Vaziri ND. Cardiovascular effects of erythropoietin and anemia correction. Curr Opin Nephrol and Hypertens 2001; 10: 633-637

33. ZhangZ, Barrett JD, Jamgotchian N etal. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) stimulates gene transcription of renin angiotensin system and growth factor mRNAs in rat vascular smooth muscle cells [abstract]. J Investig Med 1996; 44: 91

34. Vaziri ND. Mechanism of erythropoietin-induced hypertension. Am J Kidney Dis 1999; 33: 821-828

35. Akimoto T, Kuzano E, Fujita N etal. Erythropoietin modulates angiotensin II- or noradrenaline-induced Ca2+ mobilization in cultured rat vascular smooth-muscle cells.

Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 491-499

36. Vogel V, Kramer HJ, Bдcker A etal. Effects of Erythropoietin on Endothelin-1 Synthesis and the Cellular Calcium Messenger System in Vascular Endothelial Cells. Am J Hypertens 1997; 10: 289-296

37. Eckardt KU. Erythropoietin and microvascular diabetic complications. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 388-390

38. Nagarajan S, Mansfield E, Hsieh S etal. Transplant reno-vascular stenoses associated with early erythropoietin use. Clin Transplant 2007; 21: 597-608

39. Fuste B, Seradell M, Escolar G etal. Erythropoietin triggers a signaling pathway in endothelial cells and increases the thrombogenicity of their extracellular matrices in vitro. Thromb Haemost 2002; 88: 687-685

40. Kahraman S, Yilmaz R, Kirkpantur A et al. Impact of rhEPO therapy initiation on soluble adhesion molecule levels in haemodialysis patients. Nephrology 2005; 10: 64-69

41. Гуревич КЯ, ред. Человеческий рекомбинантный

эритропоэтин (Эпокрин) в лечении анемии (Практическое руководство). ИКФ «Фолиант», СПб., 2001; 45-46

42. Пчелин И. Ю, Шишкин А Н. Механизмы развития и клиническое значение анемии у пациентов с сахарным диабетом 1 и 2 типа. Вестн С.-Петерб ун-та Сер 11 2010; (2): 73-80

43. KazoryA, Ross EA. Anemia: The Point of Convergence or Divergence for Kidney Disease and Heart Failure? J Am Coll Cardiol 2009; 53: 639-647

44. Kleijn L, Boer RA, Voors AA. Should erythropoietin treatment in chronic heart failure be haemoglobin targeted? Eur J Heart Fail 2010; 12: 215-216

45. Goldsmith D, Covic A. Time to Reconsider Evidence for Anaemia Treatment (TREAT) = Essential Safety Arguments (ESA). Nephrol Dial Transplant 2010. In press

Поступила в редакцию 09.06.2010 г.

Принята в печать 16.09.2010 г.

границ | От эритробластов до зрелых эритроцитов: клиренс органелл у млекопитающих

Введение

Зрелые эритроциты (эритроциты) являются результатом тонко регулируемого процесса, называемого эритропоэзом, который производит 2 миллиона эритроцитов каждую секунду у здоровых взрослых людей (Palis, 2014). Стандартная модель эритропоэза начинается с гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в костном мозге (КМ), дающих начало мультипотентным предшественникам, которые переходят в эритроидные предшественники зрелых эритроцитов.Эта иерархическая взаимосвязь, однако, подвергается сомнению, демонстрируя большую пластичность потенциальных судеб клеток, с несколькими исследованиями на мышах (Adolfsson et al., 2005) и недавними новыми данными на людях (Notta et al., 2016).

Созревание из эритроидных предшественников называется терминальным эритропоэзом и происходит в костном мозге в пределах эритробластных островков, которые состоят из центрального макрофага, окруженного эритробластами, и заканчивается в кровотоке, где ретикулоциты завершают свое созревание в течение 1–2 дней.Во время этой фазы проэритробласты (Pro-E) претерпевают морфологические изменения, такие как уменьшение размера клеток и конденсация хроматина, продуцируют специфические белки, такие как гемоглобин, и проявляют сниженную пролиферативную способность, давая начало базофильным (Baso-E), полихроматофильным ( Поли-Е) и ортохроматофильные (Орто-Е) эритробласты последовательно. Несмотря на то, что известно несколько факторов роста, регулирующих эритропоэз, ЭПО является основным регулятором эритропоэза, управляющим пролиферацией и дифференцировкой предшественников эритроцитов, предотвращая апоптоз эритробластов (Koury and Bondurant, 1990; Ji et al., 2011). Взаимодействие макрофагов и эритробластов в BM имеет важное значение, поскольку макрофаги способствуют пролиферации и дифференцировке и обеспечивают эритробласты железом (de Back et al., 2014).

В конце терминального созревания эритробласты млекопитающих вытесняют свои ядра и теряют все свои органеллы, такие как аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ЭР), митохондрии и рибосомы. После изгнания ядра ретикулоцит продолжает созревание, теряя 20–30% клеточной поверхности (Waugh et al., 1997; Da Costa et al., 2001) и устранение любых оставшихся связанных с мембраной цитозольных органелл посредством комбинированного пути аутофагии/экзосомы (Blanc et al., 2005).

В то время как обширная литература посвящена общим механизмам эритропоэза (Palis, 2014), в этом обзоре основное внимание уделяется механизмам и молекулярным участникам, участвующим в клиренсе органелл и ремоделировании мембран с целью получения полностью функциональных двояковогнутых зрелых эритроцитов. Рисунок 1 суммирует наиболее охарактеризованные этапы клиренса органелл на протяжении терминальной дифференцировки эритробластов.

Рисунок 1 . Терминальное созревание эритробластов. (A) На стадии эритробласта активируются два Ulk1-опосредованных аутофагических пути, обеспечивающих клиренс органелл: Atg5/7-зависимый путь с протеолитической Atg4-зависимой активацией MAPLC3, световым каналом 3 белка 1, ассоциированного с микротрубочками (LC3 ) и Atg5/7-независимый путь, который не связан с белком LC3. Активация LC3 делает возможной его вставку в мембрану фагофора, начиная поглощение органелл посредством распознавания убиквитинового сигнала или путем прямого связывания специализированных рецепторов на мембране органеллы.В неэритроидных клетках Rab9a важен для образования фагофора во время Atg5/7-независимого пути аутофагии. После образования аутофагосомы ее слияние с лизосомой обеспечивает деградацию органелл гидролитическими ферментами. В процессе энуклеации образуются пиреноциты и ретикулоциты, которые все еще содержат некоторые органеллы, которые должны быть удалены для окончательного созревания в эритроциты. (B) На этой стадии нежелательные мембранные белки, такие как рецептор трансферрина (TfR), интернализуются эндоцитозом и удаляются экзоцитозом из мультивезикулярных структур тела.Гликофорин A (GPA)/LC3 двойные положительные везикулы, содержащие остатки органелл, также обнаруживаются в ретикулоцитах, что предполагает сотрудничество между путями эндоцитоза (GPA + ) и аутофагии (LC3 + ) для элиминации органелл. Однако, как аутофагосомы взаимодействуют с мультивезикулярными тельцами (MVBs), следуя тому же пути рециркуляции мембранных белков или отпочковываясь непосредственно от плазматической мембраны после слияния с эндоцитарными везикулами, остается неизвестным.

Энуклеация

Наиболее ярким аспектом эритропоэза млекопитающих является образование энуклеированных клеток.Энуклеация происходит в ортохроматических эритробластах, продуцирующих два типа клеток, ретикулоциты и пиреноциты [ядро, окруженное крошечным слоем цитоплазмы и плазматической мембраной (ПМ)]. Пиреноциты быстро элиминируются макрофагами эритробластического островка, где воздействие фосфатидилсерина действует как сигнал «съешь меня» (Yoshida et al., 2005).

Среди изменений, происходящих во время терминальной дифференцировки, остановка клеточного цикла, хроматин и ядерная конденсация и ядерная поляризация важны для энуклеации.Кроме того, экспульсия ядра, как полагают, зависит от реорганизации белков адгезии при взаимодействии PM и макрофагов (Lee et al., 2004; Soni et al., 2006). Фактор транскрипции KFL1 необходим для энуклеации (Parkins et al., 1995; Magor et al., 2015), регулируя экспрессию белков клеточного цикла, деацетилаз, каспаз и белков ядерной мембраны (Gnanapragasam et al., 2016; Gnapragasam и Бикер, 2017).

Конденсация ядер и хроматина необходима для энуклеации (Popova et al., 2009; Ji et al., 2010) и зависит от статуса ацетилирования гистонов h4 и h5 под контролем гистоновых ацетилтрансфераз (HAT) и гистоновых деацетилаз (HDAC). Соответственно, Gcn5, белок HAT, подавляется, а ацетилирование гистонов h4K9 и h5K5 снижается во время эритропоэза плода мыши. Кроме того, Gcn5 повышается с помощью c-Myc, который, как известно, снижается во время поздней фазы эритропоэза (Jayapal et al., 2010). На той же модели показано, что роль белка HDAC2 важна не только для конденсации хроматина, но и для образования сократительного актинового кольца (CAR), которое участвует в ядерном пикнозе (Ji et al., 2010). Более того, недавно было показано, что основные гистоны высвобождаются через открытие ядра, которое индуцируется зависимым от активности каспазы 3 расщеплением ламина В и конденсацией хроматина (Gnanapragasam and Bieker, 2017).

Многие исследования демонстрируют зависимость энуклеации от клеточного цикла (Gnanapragasam and Bieker, 2017). Интересно, что циклин-индуцируемый фактор транскрипции E2F-2, который является прямой мишенью KLF1 во время терминального эритропоэза, по-видимому, играет роль в энуклеации, индуцируя экспрессию CRIK (Citron Rho-interacting kinase).Помимо своих обычных мишеней, связанных с организацией микротрубочек и цитокинезом, CRIK участвует в ядерной конденсации (Swartz et al., 2017).

Элементы цитоскелета играют важную роль в энуклеации эритробластов, действуя подобно цитокинезу, но асимметрично. В частности, как видно с помощью электронной и иммунофлуоресцентной микроскопии, актиновые филаменты (F-актин) конденсируются позади выдавливающегося ядра с образованием CAR. Использование цитохалазина D, ингибитора F-актина, вызывает полную блокировку энуклеации (Koury et al., 1989). Более того, образование CAR зависит от Rac1 GTPase и от mDia2, нижележащего эффектора Rho GTPase, поскольку подавление этих двух белков нарушает образование CAR и блокирует энуклеацию эритробластов (Ji et al., 2008).

Что касается других элементов цитоскелета, то фармакологическое ингибирование виментина не влияет на энуклеацию, что согласуется с его снижением при эритропоэзе у человека (Dellagi et al., 1983). Однако нарушение регуляции микротрубочек снижает скорость энуклеации.Микротрубочки образуют корзинку вокруг ядра (Koury et al., 1989), которая смещается вблизи ПМ на поздних стадиях эритробласта, указывая на то, что эта сеть должна быть существенной для поляризации ядра. Недавно была показана важность молекулярного мотора dynein, который обеспечивает однонаправленное движение к минус-концу микротрубочек. Кроме того, активность PI3K индуцируется полимерами микротрубочек, улучшает эффективность поляризации и способствует движению ядер. Однако ингибирование PI3K не блокирует, а только задерживает энуклеацию мышей (Wang et al., 2012).

В 2010 году группа Криспино с помощью электронной микроскопии наблюдала образование везикул вблизи места экструзии ядра как в первичных мышиных, так и в человеческих эритробластах, предполагая, что другой механизм способствует энуклеации. Кроме того, как показано генетической невалидностью, клатрин необходим для образования пузырьков (Keerthivasan et al., 2010). Совсем недавно было показано, что сурвивин необходим для энуклеации эритробластов, но вместо того, чтобы воздействовать на цитокинез через хромосомный комплекс-пассажир, сурвивин способствует энуклеации посредством взаимодействия с EPS15 и клатрином (Keerthivasan et al., 2012).

Ясно, что мы все еще находимся в начале изучения молекулярных игроков, вовлеченных в процесс энуклеации. Более того, как показано в Таблице 1, большинство молекулярных игроков были идентифицированы у мышей, и нам все еще не хватает демонстрации того, что эти игроки также участвуют в эритропоэзе человека.

Таблица 1 . Сравнение исследований на эритроидных клетках человека или мыши или на других клеточных моделях.

Митохондриальный клиренс

Основным механизмом митохондриального клиренса является митофагия, избирательный тип аутофагии, который способствует деградации поврежденных митохондрий.Важность этого процесса подчеркивается знанием того, что нарушение функции митохондрий вызывает увеличение продукции активных форм кислорода, что, в свою очередь, может привести к повреждению клеточных компонентов (белков, нуклеиновых кислот и липидов) и вызвать гибель клеток (Lee et al. ., 2012).

Во время регулярных процессов аутофагии стресс или лишение питательных веществ активирует APM-активированную протеинкиназу (AMPK), запуская два убиквитин-зависимых пути (рис. 1А). Один из них обеспечивает сборку фагофора и включает несколько связанных с аутофагией белков (Atg), таких как Atg5 и Atg7.Другой направлен на активацию и липидирование LC3 (MAPLC3, микротрубочковый белок 1, световой канал 3) с помощью Atg4, окислительно-восстановительного регулируемого белка. Atg4 и Atg7 взаимодействуют, чтобы конъюгировать LC3 с фосфатидилэтаноламином в липидном бислое мембраны, происходящей из места контакта ER-митохондрий (Tooze and Yoshimori, 2010; Hamasaki et al., 2013). Удлиненный фагофор затем рекрутируется для поглощения мишеней с помощью адаптерных белков, содержащих LC3-взаимодействующую область (LIR), которая образует двухмембранную аутофагосому, которая будет сливаться с лизосомой, инициируя деградацию компонентов аутофагосомы.

При повреждении или деполяризации митохондрий белки митохондриальной мембраны обнажаются и действуют как маяк для рекрутирования мембран фагофора (Liu et al., 2014). Примером является PINK1 (P-TEN-индуцированная киназа 1)-зависимое рекрутирование паркина. При деполяризации митохондрий PINK1 накапливается в OMM (внешней митохондриальной мембране) и индуцирует митохондриальную транслокацию паркина, убиквитинлигазы E3 типа RBR (промежуточное кольцо) путем прямого фосфорилирования (Kim et al., 2008; Нарендра и др., 2010). Стабилизация Parkin в OMM приводит к полиубиквитинированию многих белков, вызывая деление митохондрий и остановку подвижности, а также рекрутирование фагофора путем взаимодействия с p62/SQSTM1, белком, содержащим LIR (Geisler et al., 2010). В отличие от обычной индукции митофагии, митохондрии-мишени во время созревания эритробластов полностью функциональны. BNIP3L/NIX, интегральный белок OMM, содержащий только Bh4, впервые идентифицированный в ретикулоцитах мыши, по-видимому, является основным митохондриальным белком, участвующим в терминальной дифференцировке (Schweers et al., 2007; Сандовал и др., 2008). Этот белок активируется во время эритропоэза и индуцирует деполяризацию митохондриальной мембраны и рекрутирование мембранно-конъюгированного LC3 в митохондрии (Aerbajinai et al., 2003; Novak et al., 2010). Действие Nix не опосредуется его доменом Bh4, а скорее, по-видимому, обусловлено цитоплазматическим коротким линейным мотивом, действующим как клеточный сигнал для рекрутирования др. белков (Zhang et al., 2012). Однако до сих пор неизвестно, активирует ли Nix-индуцированная деполяризация митохондрий паркинзависимый путь (Yuan et al., 2017).

Недавно было обнаружено, что в митофагии участвуют и другие митохондриальные рецепторы, такие как FUNDC1, индуцируемый MARCH5, убиквитинлигаза Е3, действующая в условиях гипоксии (Chen et al., 2017), Bcl2-L-13 (Murakawa et al., 2015). ), оптинейрин (Wong and Holzbaur, 2014) и Prohibitin 2 (Wei et al., 2017). Остается неизвестным, играют ли они роль в созревании эритроцитов.

Белки

Canonical Atg также участвуют в терминальном созревании. В эритропоэзе человека расщепление LC3 находится под контролем эндопептидазы Atg4 и необходимо для созревания аутофагосом (Betin et al., 2013). У мышей экспрессия Ulk1 (Atg1) коррелирует с терминальной дифференцировкой и участвует в элиминации митохондрий и рибосом (Chan et al., 2007; Kundu et al., 2008). Зависимый от убиквитинирования путь также играет роль в созревании ретикулоцитов, но не является существенным. Действительно, в ретикулоцитах Atg7 -/- митохондриальный клиренс затронут лишь частично (Zhang and Ney, 2009; Zhang et al., 2009). Однако активация Nix и Ulk1, по-видимому, необходима (Mortensen et al., 2010; Honda et al., 2014), предполагая сосуществование как Atg5/Atg7-зависимых, так и независимых путей во время терминальной дифференцировки.

Некоторые исследования предполагают, что Atg5/7-независимая деградация митохондрий включает эндосомальный транспорт регуляторных белков Rab. Аутофагосомы, образованные Ulk1-зависимым путем, сливаются с производными Гольджи везикулами и поздними эндосомами Rab9a-зависимым образом перед тем, как они нацеливаются на лизосомы (Wang et al., 2016). Интересно, что недавно также было показано, что Rab белки участвуют в удалении митохондрий полностью независимым от аутофагии путем.Деполяризованные митохондрии, по-видимому, поглощаются Rab5-позитивными эндосомами, которые созревают в Rab7-позитивные поздние эндосомы и затем сливаются с лизосомами (Hammerling et al., 2017a,b). В отличие от канонической аутофагии, которая включает окружение ubiquitin-декорированной мишени двойной мембранной структурой, все митохондрии, по-видимому, поглощаются ранней инвагинацией мембраны эндосом посредством механизма ESCRT. Неизвестно, может ли это также происходить в созревающих эритробластах.

Митофагия, по-видимому, также регулируется транскрипцией.Действительно, гемин-зависимая дифференцировка эритроидной клеточной линии демонстрирует признаки митофагии (Fader et al., 2016). Фактор транскрипции NF-E2, участвующий в экспрессии глобинового гена, также регулирует митофагию посредством регуляции генов Nix и Ulk1 (Gothwal et al., 2016; Lupo et al., 2016). Другим ключевым регулятором является регуляторный каскад KRAB/KAP1-миРНК, который действует как косвенный репрессор генов митофагии у мышей, а также в клетках человека, вероятно, за счет понижающей и повышающей регуляции ряда микроРНК, таких как миР-351, которые нацелен на Никс (Barde et al., 2013).

Параллельно с аутофагическим путем цитозольная деградация, по-видимому, происходит во время созревания ретикулоцитов. 15-липоксигеназа (15-LOX), фермент, который катализирует диоксигенацию полиненасыщенных жирных кислот, трансляционно ингибируется до стадии ретикулоцитов и действует, проницая мембраны органелл, обеспечивая доступ протеасом и их деградацию. Интересно, что затрагивается только элиминация митохондрий, в то время как клиренс рибосом остается эффективным при использовании ингибитора липоксигеназы (Grüllich et al., 2001). Этот механизм все еще остается спорным, так как 15-LOX может также действовать на пути аутофагии как нарушитель градиента pH OMM, который может вызывать митофагию (Vijayvergiya et al., 2004) и на окисление фосфолипидов, конъюгирующих с LC3, во время образования аутофагосомы; даже в этом случае эти особенности, как показано в таблице 1, еще не были продемонстрированы в эритроидных клетках (Morgan et al., 2015).

Рибосомы и другие органеллы

В целом, аутофагия играет важную роль в элиминации других органелл, таких как лизосомы, пероксисомы и ER.Однако в литературе представлено очень мало исследований на эритроидных клетках (табл. 1).

В то время как Nix необходим для удаления митохондрий, Ulk1 участвует в деградации рибосом и митохондрий (Schweers et al., 2007; Kundu et al., 2008; Sandoval et al., 2008). Сходным образом, эффективный клиренс рибосом и ER и ингибирование митофагии наблюдались у мышей Atg7 -/- (Mortensen et al., 2010). Эти данные свидетельствуют о том, что неаутофагические или Atg7-независимые пути аутофагии могут существовать для элиминации др. органелл (Рис. 1А).

Было высказано предположение, что в неэритроидных клетках млекопитающих пероксисомы элиминируются тремя различными путями: макроаутофагией (Iwata, 2006), опосредованной 15-LOX (Yokota et al., 2001) и пероксисомальными протеазами Lon (Yokota et al. , 2008). Более того, аутофагическая деградация лизосом (лизофагия) недавно была идентифицирована в клетках HeLa, где она опосредована убиквитинированием и включает белок p62 (Hung et al., 2013). Сходство между пексофагией/лизофагией и митофагией в неэритроидных клетках предполагает, что пути аутофагии также могут быть вовлечены в терминальное созревание эритробластов.

После энуклеации ретикулоциты созревают в костном мозге (R1), а затем выходят в кровоток (R2) для завершения процесса. В то время как деградация органелл начинается во время энуклеации, элиминация мРНК происходит в кровотоке и опосредована рибонуклеазами, генерирующими нуклеотиды, которые расщепляются эритроидной пиримидиннуклеотидазой. Это устранение имеет решающее значение, так как дефицит этого фермента вызывает гемолитическую анемию (Валентин и др., 1974). мРНК в ретикулоцитах R2 в основном относятся к трем перекрывающимся категориям: транспортная, метаболическая и сигнальная трансдукция (Lee et al., 2014), и их присутствие необходимо для достижения стадии зрелых эритроцитов. Это подтверждает важность экзосомного пути для окончательного созревания в эритроциты с активной элиминацией других субклеточных компонентов.

Экзоцитоз и ремоделирование мембран

Экзосомы представляют собой небольшие везикулы, которые секретируются во внеклеточную среду из различных типов клеток. Инвагинации ПМ образуют ранние эндосомы, которые поглощают различные мишени, образуя мультивезикулярные тела (МВБ, поздние эндосомы), которые в конечном итоге сливаются с ПМ и высвобождают экзосомы.Считается, что в ретикулоцитах этот путь участвует в ремоделировании клеточного объема и мембраны с целью уменьшения объема и удаления нежелательных мембранных белков. Впервые это было обнаружено в ретикулоцитах овцы, где рецептор трансферрина (TfR) сначала интернализуется в маленькие везикулы размером 100–200 нм, а затем поглощается MVB (Pan et al., 1985; Johnstone et al., 1989). Стадия интернализации зависит от клатрина, а деградация не зависит от лизосом и происходит путем экзоцитоза после слияния MVB с PM, как показано на рисунке 1B (Killisch et al., 1992). Этот процесс необходим для окончательной элиминации других мембранных белков, необходимых для ретикулоцита, но отсутствующих в зрелой клетке. Белки, такие как аквапорин-1 (AQP1) (Blanc et al., 2009), интегрин α4β1 (Rieu et al., 2000), транспортер глюкозы и ацетилхолинэстераза (Johnstone et al., 1987), обнаружены в гликофорине-А (GPA) положительные эндосомы, в то время как белки цитоскелета, такие как актин или спектрин, никогда не обнаруживались в этих эндосомах (Liu et al., 2010).

В то время как множество данных отмечает роль аутофагии в удалении органелл во время терминального созревания, сам этап деградации демонстрирует расхождения с каноническим протеолизом с участием лизосомных белков из-за исчезновения лизосомного компартмента во время созревания и удаления LAMP2 путем экзоцитоза (Barres et al. ., 2010). Недавно было обнаружено, что GPA-позитивные эндосомы экспрессируют LC3 на мембране эндосом, что указывает на кооперацию как аутофагии, так и экзоцитоза при удалении остатков органелл в ретикулоцитах R2. Эти гибридные везикулы содержат митохондрии, Гольджи и лизосомы, которые могут быть образованы слиянием внешней мембраны аутофагосомы и эндосомы, происходящей из PM (Griffiths et al., 2012). Экзоцитозу этого пузырька может способствовать селезенка, поскольку у пациентов после спленэктомии внутри ретикулоцитов обнаруживаются большие вакуоли (Holroyde and Gardner, 1970).

Следует отметить важность доменов липидов, таких как домены, обогащенные холестерином и сфингомиелином, в ремоделировании ПМ, поскольку они оба были обнаружены в специфических сайтах мембранных везикул (Leonard et al., 2017).

Заключение

Даже если все животные модели, используемые для идентификации молекулярных игроков, участвующих в конечной дифференцировке, обнаруживают дефекты созревания и анемию, связь между клиренсом органелл и гематологическими заболеваниями человека все еще в основном неизвестна.Эритроидные расстройства, такие как β-талассемия и миелодиспластический синдром (МДС), характеризуются неэффективным кроветворением, анемией, диссоциацией между пролиферацией и дифференцировкой клеток-предшественников и неэффективной элиминацией агрегированного белка (Arber et al., 2016; Taher et al. , 2017). Действительно, дефекты созревания ретикулоцитов и аутофагии выявляются у пациентов с HbE/β-талассемией (Lithanatudom et al., 2011; Khandros et al., 2012; Butthep et al., 2015), а дефекты энуклеации обнаруживаются у пациентов с МДС (Garderet и другие., 2010; Парк и др., 2016). Нарушенная аутофагия участвует в цитозольном токсическом накоплении Lyn и задержке деградации митохондрий и лизосом при хорее-акантоцитозе (Lupo et al., 2016). Использование модуляторов аутофагии полезно в случае ВСС или β-талассемии (Franco et al., 2014; Jagadeeswaran et al., 2017). Более того, анемия при синдроме Пирсона недавно была связана с неполным митохондриальным клиренсом ретикулоцитов (Palis, 2014) и асинхронизацией нагрузки железом (Ahlqvist et al., 2015), в то время как у пациентов с серповидноклеточной анемией наблюдалось накопление белков в эритроцитах, что свидетельствует о дефекте экзосомального пути (De Franceschi, 2009; Carayon et al., 2011).

Раскрытие молекулярных механизмов и взаимосвязей, управляющих терминальным созреванием эритробластов, было бы бесценным в терапии гематологических заболеваний. Однако большая часть наших знаний о эритропоэзе человека основана на животных моделях и/или ex vivo культивированных клетках-предшественниках человека (таблица 1). При интерпретации результатов следует проявлять большую осторожность, учитывая важные различия между эритропоэзом мыши и человека, а также средами in vivo и in vitro , как показано в обширном анализе транскриптома в исследовании терминальной эритроидной дифференцировки (An et al. ., 2014).

Вклад авторов

Все перечисленные авторы внесли существенный, непосредственный и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее для публикации.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантами Лаборатории передового опыта GR-Ex, ссылка ANR-11-LABX-0051. Labex GR-Ex финансируется программой «Investissements d’avenir» Национального исследовательского агентства Франции, ссылка ANR-11-IDEX-0005-02.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

MM финансируется исследовательской и инновационной программой Horizon 2020 Европейского Союза в рамках соглашения о гранте Марии Склодовской-Кюри № 665850. Мы благодарим И. Маргинедас-Фрейша и К. Хаттаб за полезные обсуждения.

Ссылки

Адольфссон, Дж., Монссон, Р., Буза-Видас, Н., Халтквист, А., Люба, К., Дженсен, С. Т., и соавт. (2005). Идентификация Flt3+ лимфомиелоидных стволовых клеток, лишенных эритро-мегакариоцитарного потенциала. Сотовый 121, 295–306.doi: 10.1016/j.cell.2005.02.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эрбаджинай, В., Гиаттина, М., Ли, Т.Ю., Раффилд, М., и Миллер, Дж.Л. (2003). Проапоптотический фактор Nix коэкспрессируется с Bcl-xL во время терминальной эритроидной дифференцировки. Кровь 102, 712–717. doi: 10.1182/blood-2002-11-3324

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Альквист, К. Дж., Леончини, С., Пекорелли, А., Вортманн, С.Б., Ахола С., Форсстрём С. и др. (2015). Мутагенез мтДНК нарушает элиминацию митохондрий во время созревания эритроцитов, что приводит к усилению разрушения эритроцитов. Нац. коммун. 6:6494. doi: 10.1038/ncomms7494

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

An, X., Schulz, V.P., Li, J., Wu, K., Liu, J., Xue, F., et al. (2014). Глобальный транскриптомный анализ терминальной эритроидной дифференцировки человека и мыши. Кровь 123, 3466–3477.дои: 10.1182/кровь-2014-01-548305

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Арбер, Д. А., Орази, А., Хассерджян, Р., Тиле, Дж., Боровиц, М. Дж., Ле Бо, М. М., и соавт. (2016). Пересмотренная в 2016 г. классификация миелоидных новообразований и острого лейкоза Всемирной организации здравоохранения. Кровь 127, 2391–2405. дои: 10.1182/кровь-2016-03-643544

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Барде И., Раувель Б., Марин-Флорез Р.М., Корсинотти А., Лауренти Э., Верп С. и соавт. (2013). Каскад KRAB/KAP1-miRNA регулирует эритропоэз посредством стадийно-специфического контроля митофагии. Наука 340, 350–353. doi: 10.1126/science.1232398

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Баррес, К., Блан, Л., Бетт-Бобильо, П., Андре, С., Мамун, Р., Габиус, Х.-Дж., и другие. (2010). Галектин-5 связывается с поверхностью экзосом ретикулоцитов крысы и модулирует поглощение везикул макрофагами. Кровь 115, 696–705. дои: 10.1182/кровь-2009-07-231449

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бетин, В. М. С., Синглтон, Б. К., Парсонс, С. Ф., Ансти, Д. Дж., и Лейн, Дж. Д. (2013). Аутофагия облегчает клиренс органелл во время дифференцировки эритробластов человека: доказательства роли паралогов ATG4 во время созревания аутофагосом. Аутофагия 9, 881–893. doi: 10.4161/авто.24172

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Блан, Л., Де Гассар, А., Геминар, К., Бетт-Бобильо, П., и Видаль, М. (2005). Высвобождение экзосом ретикулоцитами — неотъемлемой частью системы дифференцировки эритроцитов. Клетки крови. Мол. Дис. 35, 21–26. doi: 10.1016/j.bcmd.2005.04.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Блан, Л., Лю, Дж., Видал, М., Часис, Дж. А., Ан, X., и Мохандас, Н. (2009). Аквапорин-1 водного канала разделяется на экзосомы во время созревания ретикулоцитов: значение для регуляции объема клеток. Кровь 114, 3928–3934. doi: 10.1182/blood-2009-06-230086

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Буттхеп, П., Виседпаницкий, Р., Джиндадамронгвех, С., и Фучароен, С. (2015). Повышенные уровни эритропоэтина и цитокинов связаны с нарушением созревания ретикулоцитов у пациентов с талассемией. Клетки крови. Мол. Дис. 54, 170–176. doi: 10.1016/j.bcmd.2014.11.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Карайон, К., Chaoui, K., Ronzier, E., Lazar, I., Bertrand-Michel, J., Roques, V., et al. (2011). Протеолипидный состав экзосом изменяется в процессе созревания ретикулоцитов. Дж. Биол. хим. 286, 34426–34439. doi: 10.1074/jbc.M111.257444

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чан, Э.Ю.В., Кир, С., и Туз, С.А. (2007). Скрининг siRNA кинома идентифицирует ULK1 как многодоменный модулятор аутофагии. Дж. Биол. хим. 282, 25464–25474.дои: 10.1074/jbc.M703663200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Да Коста, Л., Мохандас, Н., Соретт, М., Гранж, М.-Дж., Черня, Г., и Кинобер, Т. (2001). Временные различия в потере мембраны приводят к различным особенностям ретикулоцитов при наследственном сфероцитозе и иммунной гемолитической анемии. Кровь 98, 2894–2899. doi: 10.1182/кровь.V98.10.2894

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

де Бак, Д.З., Костова Э.Б., ван Краай М., ван ден Берг Т.К. и ван Брюгген Р. (2014). макрофагов и эритроцитов; сложная история любви. Перед. Физиол. 5:9. doi: 10.3389/fphys.2014.00009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Dellagi, K., Vainchenker, W., Vinci, G., Paulin, D., and Brouet, J.C. (1983). Изменение экспрессии виментиновых промежуточных филаментов при дифференцировке гемопоэтических клеток человека. EMBO J. 2, 1509–1514.

Реферат PubMed | Академия Google

Фейдер, К.М., Саласса, Б.Н., Гроссо, Р.А., Вергара, А.Н., и Коломбо, М.И. (2016). Гемин индуцирует митофагию в клеточной линии лейкемических эритробластов: гемин индуцирует митофагию в клетках K562. Биол. Ячейка 108, 77–95. doi: 10.1111/boc.201500058

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Франко, С.С., Де Фалько, Л., Гаффари, С., Бругнара, К., Синклер, Д.А., Матте, А., и др. (2014). Ресвератрол ускоряет созревание эритроцитов за счет активации FoxO3 и улучшает состояние при анемии у мышей с бета-талассемией. Гематологический 99, 267–275. doi: 10.3324/гематол.2013.0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Garderet, L., Kobari, L., Mazurier, C., De Witte, C., Giarratana, M.-C., Perot, C., et al. (2010). Ненарушенная терминальная эритроидная дифференцировка и сохраненная способность к энуклеации в миелодиспластических клонах 5q(del): исследование одной клетки. Гематологический 95, 398–405. doi: 10.3324/гематол.2009.012773

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гейслер, С., Holmström, K.M., Skujat, D., Fiesel, F.C., Rothfuss, O.C., Kahle, P.J., et al. (2010). Опосредованная PINK1/Parkin митофагия зависит от VDAC1 и p62/SQSTM1. Нац. Клеточная биол. 12, 119–131. doi: 10.1038/ncb2012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гнанапрагасам, М. Н., МакГрат, К. Э., Катерман, С., Сюэ, Л., Палис, Дж., и Бикер, Дж. Дж. (2016). Выход из клеточного цикла, регулируемый EKLF/KLF1, необходим для энуклеации эритробластов. Кровь 128, 1631–1641.дои: 10.1182/кровь-2016-03-706671

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Готвал, М., Верле, Дж., Ауманн, К., Циммерманн, В., Грундер, А., и Пал, Х.Л. (2016). Новая роль ядерного фактора-эритроида 2 в созревании эритроидов путем модуляции митохондриальной аутофагии. Haematologica 101, 1054–1064. doi: 10.3324/гематол.2015.132589

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гриффитс, Р. Э., Купциг, С., Cogan, N., Mankelow, T.J., Betin, V.M.S., Trakarnsanga, K., et al. (2012). Созревающие ретикулоциты интернализуют плазматическую мембрану в содержащие гликофорин А везикулы, которые перед экзоцитозом сливаются с аутофагосомами. Кровь 119, 6296–6306. doi: 10.1182/blood-2011-09-376475

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Grüllich, C., Duvoisin, R.M., Wiedmann, M., and Van Leyen, K. (2001). Ингибирование 15-липоксигеназы приводит к замедлению деградации органелл в ретикулоците. Письмо ФЭБС. 489, 51–54. doi: 10.1016/S0014-5793(01)02080-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хамасаки М., Фурута Н., Мацуда А., Незу А., Ямамото А., Фудзита Н. и др. (2013). Аутофагосомы образуются в местах контакта ER-митохондрий. Природа 495, 389–393. doi: 10.1038/nature11910

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hammerling, B.C., Najor, R.H., Cortez, M.Q., Shires, S.E., Leon, L.J., Gonzalez, E.R., et al. (2017а). Эндосомальный путь Rab5 опосредует зависимый от паркина митохондриальный клиренс. Нац. коммун. 8:14050. doi: 10.1038/ncomms14050

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hammerling, B.C., Shires, S.E., Leon, L.J., Cortez, M.Q., and Gustafsson, Å. Б. (2017б). Выделение Rab5-позитивных эндосом выявляет новый путь митохондриальной деградации, используемый BNIP3 и Parkin. Малые ГТФазы 11, 1–8.дои: 10.1080/21541248.2017.1342749

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Холройд, С.П., и Гарднер, Ф.Х. (1970). Приобретение аутофагических вакуолей человеческими эритроцитами физиологическая роль селезенки. Кровь 36, 566–575.

Реферат PubMed | Академия Google

Хонда С., Аракава С., Нисида Ю., Ямагути Х., Исии Э. и Симидзу С. (2014). Ulk1-опосредованная Atg5-независимая макроаутофагия обеспечивает элиминацию митохондрий из эмбриональных ретикулоцитов. Нац. коммун. 5:4004. doi: 10.1038/ncomms5004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хун, Ю.-Х., Чен, Л.М.-В., Ян, Дж.-Ю., и Юань Ян, В. (2013). Пространственно-временно контролируемая индукция опосредованного аутофагией оборота лизосом. Нац. коммун. 4:2111. doi: 10.1038/ncomms3111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джагадисваран Р., Васкес Б. А., Тируппати М., Ганеш Б. Б., Ибанез В., Cui, S., et al. (2017). Фармакологическое ингибирование LSD1 и mTOR снижает задержку митохондрий и связанные с этим уровни АФК в эритроцитах при серповидно-клеточной анемии. Экспл. Гематол. 50, 46–52. doi: 10.1016/j.exphem.2017.02.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джаяпал С.Р., Ли К.Л., Джи П., Калдис П., Лим Б. и Лодиш Х.Ф. (2010). Понижающая регуляция Myc необходима для терминального созревания эритроцитов. Дж. Биол.хим. 285, 40252–40265. doi: 10.1074/jbc.M110.181073

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джи П., Джаяпал С. Р. и Лодиш Х. Ф. (2008). Для энуклеации культивируемых эритробластов плода мыши требуются Rac GTPases и mDia2. Нац. Клеточная биол. 10, 314–321. дои: 10.1038/ncb1693

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., and Lodish, H.F. (2010). Гистондеацетилаза 2 необходима для конденсации хроматина и последующей энуклеации культивируемых эритробластов плода мыши. Haematologica 95, 2013–2021 гг. doi: 10.3324/гематол.2010.029827

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ji, Y.Q., Zhang, Y.Q., Li, M.Q., Du, M.R., Wei, W.W., and Li, D.J. (2011). ЭПО улучшает пролиферацию и ингибирует апоптоз трофобласта и децидуальных стромальных клеток посредством активации STAT-5 и инактивации сигнала р38 на ранних сроках беременности человека. Междунар. Дж. Клин. Эксп. Патол. 4, 765–774.

Реферат PubMed | Академия Google

Джонстон, Р.М., Адам М., Хаммонд Дж. Р., Орр Л. и Турбайд К. (1987). Образование везикул при созревании ретикулоцитов. Ассоциация активности плазматической мембраны с высвободившимися везикулами (экзосомами). Дж. Биол. хим. 262, 9412–9420.

Реферат PubMed | Академия Google

Джонстон, Р. М., Бьянчини, А., и Тенг, К. (1989). Созревание ретикулоцитов и высвобождение экзосом: трансферриновый рецептор, содержащий экзосомы, проявляет множественные функции плазматической мембраны. Кровь 19, 1844–1851.

Академия Google

Keerthivasan, G., Liu, H., Gump, J.M., Dowdy, S.F., Wickrema, A., and Crispino, J.D. (2012). Новая роль сурвивина в энуклеации эритробластов. Haematologica 97, 1471–1479. doi: 10.3324/гематол.2011.061093

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Киртивасан Г., Смолл С., Лю Х., Викрема А. и Криспино Д. Д. (2010). Перенос везикул играет новую роль в энуклеации эритробластов. Кровь 116, 3331–3340. дои: 10.1182/кровь-2010-03-277426

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кхандрос, Э., Том, К.С., Д’Суза, Дж., и Вайс, М.Дж. (2012). Интегрированные пути контроля качества белка регулируют свободный α-глобин при мышиной β-талассемии. Кровь 119, 5265–5275. doi: 10.1182/blood-2011-12-397729

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Киллиш, И., Штейнлайн, П., Ромиш, К., Hollinshead, R., Beug, H., and Griffiths, G. (1992). Характеристика ранних и поздних эндоцитарных компартментов трансферринового цикла. Антитело к трансферриновому рецептору блокирует эритроидную дифференцировку, захватывая рецептор в ранней эндосоме. J. Cell Sci. 103, 211–232.

Реферат PubMed | Академия Google

Kim, Y., Park, J., Kim, S., Song, S., Kwon, S.-K., Lee, S.-H., et al. (2008). PINK1 контролирует митохондриальную локализацию паркина посредством прямого фосфорилирования. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 377, 975–980. doi: 10.1016/j.bbrc.2008.10.104

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кобаяси И., Убукава К., Сугавара К., Асанума К., Го Ю.-М., Ямасита Дж. и др. (2016). Энуклеация эритробластов является динеинзависимым процессом. Экспл. Гематол . 44, 247–256.e12. doi: 10.1016/j.exphem.2015.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кури, С.Т., Коури, М.Дж., и Бондюран, М.С. (1989). Распределение и функция цитоскелета во время созревания и энуклеации 13 эритробластов млекопитающих. J. Cell Biol. 109, 3005–3013.

Академия Google

Коури, М.Дж., и Бондюран, М.С. (1990). Контроль производства эритроцитов: роль запрограммированной гибели клеток (апоптоз) и эритропоэтина. Переливание 30, 673–674. doi: 10.1046/j.1537-2995.1990.308321.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Краусс, С.В. (2005). Реорганизация ядерной субструктуры на поздних стадиях эритропоэза носит избирательный характер и не включает каспазное расщепление основных белков ядерной субструктуры. Кровь 106, 22:00–22:05. doi: 10.1182/blood-2005-04-1357

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Кюн, Х., Белкнер, Дж., и Визнер, Р. (1990). Субклеточное распределение продуктов липоксигеназы в мембранах ретикулоцитов кролика. ФЕБС J . 191, 221–227. doi: 10.1111/j.1432-1033.1990.tb19113.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Kundu, M., Lindsten, T., Yang, C.-Y., Wu, J., Zhao, F., Zhang, J., et al. (2008). Ulk1 играет критическую роль в аутофагическом клиренсе митохондрий и рибосом во время созревания ретикулоцитов. Кровь 112, 1493–1502. doi: 10.1182/blood-2008-02-137398

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Э., Чой, Х.С., Хван, Дж.Х., Хох, Дж.К., Чо, Ю.-H., и Baek, EJ (2014). РНК в ретикулоцитах — это не просто мусор: она необходима для финальных стадий образования эритроцитов. Клетки крови. Мол. Дис. 53, 1–10. doi: 10.1016/j.bcmd.2014.02.009

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Lee, J.C.-M., Gimm, J.A., Lo, A.J., Koury, M.J., Krauss, S.W., Mohandas, N., et al. (2004). Механизм сортировки белков при энуклеации эритробластов: роль связности цитоскелета. Кровь 103, 1912–1919.doi: 10.1182/blood-2003-03-0928

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Леонард, К., Конрард, Л., Гутманн, М., Поллет, Х., Каркин, М., Вермилен, К., и соавт. (2017). Вклад липидных доменов плазматической мембраны в (ре)формирование эритроцитов. Науч. Респ. 7:4264. doi: 10.1038/s41598-017-04388-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Литанатудом П., Ваннатунг Т., Личароенкиат А., Свасти С., Фучароен С.и Смит, Д. Р. (2011). Усиленная активация аутофагии в эритробластах β-талассемии/Hb E во время эритропоэза. Энн. Гематол. 90, 747–758. doi: 10.1007/s00277-010-1152-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, Дж., Го, X., Мохандас, Н., Часис, Дж. А., и Ан, X. (2010). Ремоделирование мембран во время созревания ретикулоцитов. Кровь 115, 2021–2027 гг. doi: 10.1182/blood-2009-08-241182

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лупо, Ф., Tibaldi, E., Matte, A., Sharma, A.K., Brunati, A.M., Alper, S.L., et al. (2016). Новая молекулярная связь между дефектной аутофагией и эритроидными аномалиями при хорее-акантоцитозе. Кровь 128, 2976–2987. дои: 10.1182/кровь-2016-07-727321

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Магор, Г.В., Таллак, М.Р., Гиллиндер, К.Р., Белл, К.С., МакКаллум, Н., Уильямс, Б., и соавт. (2015). Новорожденные с нулевым KLF1 обнаруживают водянку плода и нарушенный эритроидный транскриптом. Кровь 125, 2405–2417. doi: 10.1182/blood-2014-08-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Морган А. Х., Хаммонд В. Дж., Сакох-Накатогава М., Осуми Ю., Томас С. П., Бланше Ф. и др. (2015). Новая роль 12/15-липоксигеназы в регуляции аутофагии. Окислительно-восстановительный биол. 4, 40–47. doi: 10.1016/j.redox.2014.11.005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мортенсен, М., Фергюсон, Д.J.P., Edelmann, M., Kessler, B., Morten, K.J., Komatsu, M., et al. (2010). Потеря аутофагии в эритроидных клетках приводит к дефектному удалению митохондрий и тяжелой анемии in vivo . Проц. Натл. акад. Sci.U.S.A. 107, 832–837. doi: 10.1073/pnas.0

0107

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Муракава Т., Ямагути О., Хасимото А., Хикосо С., Такеда Т., Ока Т. и др. (2015). Bcl-2-подобный белок 13 является гомологом Atg32 млекопитающих, который опосредует митофагию и фрагментацию митохондрий. Нац. коммун. 6:7527. doi: 10.1038/ncomms8527

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нарендра, Д.П., Джин, С.М., Танака, А., Суен, Д.-Ф., Готье, К.А., Шен, Дж., и др. (2010). PINK1 избирательно стабилизируется на поврежденных митохондриях для активации паркина. PLoS Биол. 8:e1000298. doi: 10.1371/journal.pbio.1000298

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нотта Ф., Занди С., Такаяма Н., Добсон С., Ган О.И., Уилсон Г. и соавт. (2016). Различные пути наследственного развития изменяют иерархию крови человека на протяжении онтогенеза. Наука 351:aab2116. doi: 10.1126/science.aab2116

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Новак И., Киркин В., Макьюэн Д.Г., Чжан Дж., Уайлд П., Розенкноп А. и др. (2010). Nix является селективным рецептором аутофагии для митохондриального клиренса. EMBO Rep. 11, 45–51. doi: 10.1038/embor.2009.256

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пан, Б.-Т., Тенг, К., Ву, К., Адам, М., и Джонстон, Р.М. (1985). Электронно-микроскопические доказательства экстернализации рецептора трансферрина в везикулярной форме в ретикулоцитах овцы. J. Cell Biol. 101, 942–948. doi: 10.1083/jcb.101.3.942

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Панкив С., Клаузен Т. Х., Ламарк Т., Брех А., Бруун Ж.-А., Аутцен Х., и другие. (2007). p62/SQSTM1 связывается непосредственно с Atg8/LC3, чтобы способствовать деградации агрегатов убиквитинированного белка посредством аутофагии. Дж. Биол. Химия . 282, 24131–24145. doi: 10.1074/jbc.M702824200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Park, S.M., Ou, J., Chamberlain, L., Simone, T.M., Yang, H., Virbasius, C.-M., et al. (2016). U2AF35(S34F) способствует трансформации, направляя образование 3′-конца аберрантной пре-мРНК aTG7. Мол. Ячейка 62, 479–490.doi: 10.1016/j.molcel.2016.04.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Паркинс, А.С., Шарп, А.Х., и Оркин, С.Х. (1995). Летальная β-талассемия у мышей с отсутствием эритроидного CACCC-фактора транскрипции EKLF. Природа 375, 318–322. дои: 10.1038/375318a0

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Попова Е.Ю., Краусс С.В., Шорт С.А., Ли Г., Вильялобос Дж., Эцелл Дж. и соавт. (2009). Конденсация хроматина в терминально дифференцирующихся эритробластах мыши не связана с особыми структурными белками, но зависит от деацетилирования гистонов. Рез. хромосомы. 17, 47–64. doi: 10.1007/s10577-008-9005-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рьё, С., Геминар, К., Рабесандратана, Х., Сент-Мари, Дж., и Видаль, М. (2000). Экзосомы, высвобождаемые во время созревания ретикулоцитов, связываются с фибронектином через интегрин α4β1. евро. Дж. Биохим. 267, 583–590. doi: 10.1046/j.1432-1327.2000.01036.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сандовал, Х., Thiagarajan, P., Dasgupta, S.K., Schumacher, A., Pchal, J.T., Chen, M., et al. (2008). Существенная роль Nix в аутофагическом созревании эритроидных клеток. Природа 454, 232–235. doi: 10.1038/nature07006

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Schweers, R.L., Zhang, J., Randall, M.S., Loyd, M.R., Li, W., Dorsey, F.C., et al. (2007). NIX необходим для запрограммированного митохондриального клиренса во время созревания ретикулоцитов. Проц. Натл.акад. науч. США 104, 19500–19505. doi: 10.1073/pnas.0708818104

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сони С., Бала С., Гвинн Б., Сар К. Э., Питерс Л. Л. и Ханспал М. (2006). Отсутствие белка макрофагов эритробластов (Emp) приводит к нарушению экструзии ядер эритробластов. Дж. Биол. хим. 281, 20181–20189. дои: 10.1074/jbc.M603226200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шварц, К.Л., Вуд С.Н., Мурти Т., Рамирез О., Цинь Г., Пиллаи М.М. и соавт. (2017). E2F-2 способствует ядерной конденсации и энуклеации терминально дифференцированных эритробластов. Мол. Клетка. биол. 37:e00274–e00216. doi: 10.1128/MCB.00274-16

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тахер, А. Т., Уэзеролл, Д. Дж., и Каппеллини, М. Д. (2017). Талассемия. Ланцет. doi: 10.1016/S0140-6736(17)31822-6. [Epub перед печатью].

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Валентайн, В.Н., Финк К., Палья Д.Е., Харрис С.Р. и Адамс В.С. (1974). Наследственная гемолитическая анемия с дефицитом пиримидин-5′-нуклеотидазы эритроцитов человека. Дж. Клин. Вкладывать деньги. 54, 866–879. DOI: 10.1172/JCI107826

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Vijayvergiya, C., De Angelis, D., Walther, M., Kühn, H., Duvoisin, R.M., Smith, D.H., et al. (2004). Высокий уровень экспрессии 15-липоксигеназы кролика вызывает коллапс митохондриального градиента рН в клеточной культуре. Биохимия 43, 15296–15302. дои: 10.1021/bi048745v

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван Дж., Фанг Ю., Ян Л., Юань Н., Чжан С., Сюй Л. и др. (2016). Клетки эритролейкемии приобретают способность к альтернативной митофагии. Науч. Реп. 6:24641. дои: 10.1038/srep24641

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван Дж., Рамирес Т., Джи П., Джаяпал С. Р., Лодиш Х. Ф. и Мурата-Хори М.(2012). Энуклеация эритробластов млекопитающих требует PI3K-зависимой поляризации клеток. J. Cell Sci. 125, 340–349. doi: 10.1242/jcs.088286

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Waugh, R.E., McKenney, J.B., Bauserman, R.G., Brooks, D.M., Valeri, C.R., and Snyder, L.M. (1997). Площадь поверхности и объем изменяются при созревании ретикулоцитов в кровообращении павиана. Дж. Лаб. клин. Мед. 129, 527–535. doi: 10.1016/S0022-2143(97)

-X

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вэй Ю., Чанг В.-К., Самптер Р., Мишра П. и Левин Б. (2017). Прогибитин 2 является рецептором митофагии внутренней митохондриальной мембраны. Ячейка 168, 224–238.e10. doi: 10.1016/j.cell.2016.11.042

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Weil, M., Raff, M.C., and Braga, V.M. (1999). Активация каспазы в терминальной дифференцировке эпидермальных кератиноцитов человека. Курс. Биол . 9, 361–365. doi: 10.1016/S0960-9822(99)80162-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вонг, Ю.К. и Хольцбаур, Э. Л. (2014). Оптинейрин представляет собой рецептор аутофагии для поврежденных митохондрий в опосредованной паркином митофагии, которая нарушена мутацией, связанной с БАС. Проц. Натл. акад. науч. США 111, E4439–E4448. doi: 10.1073/pnas.1405752111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йокота, С., Харагути, К.М., и Ода, Т. (2008). Индукция пероксисомальной лон протеазы в печени крыс после обработки ди-(2-этилгексил)фталатом. Гистохим.Клеточная биол. 129, 73–83. doi: 10.1007/s00418-007-0328-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йокота, С., Ода, Т., и Фахими, Х.Д. (2001). Роль 15-липоксигеназы в разрушении пероксисомальной мембраны и программируемой деградации пероксисом в нормальной печени крыс. J. Histochem. Цитохим. 49, 613–621. дои: 10.1177/002215540104

8

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йошида, Х., Каване К., Койке М., Мори Ю., Утияма Ю. и Нагата С. (2005). Фосфатидилсеринзависимое поглощение макрофагами ядер эритроидных клеток-предшественников. Природа 437, 754–758. doi: 10.1038/nature03964

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Юань Ю., Чжэн Ю., Чжан Х., Чен Ю., Ву Х., Ву Дж. и др. (2017). BNIP3L/NIX-опосредованная митофагия защищает от ишемического повреждения головного мозга независимо от PARK2. Аутофагия 13, 1754–1766.дои: 10.1080/15548627.2017.1357792

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, Дж., Лойд, М.Р., Рэндалл, М.С., Уодделл, М.Б., Кривацкий, Р.В., и Ней, П.А. (2012). Короткий линейный мотив в BNIP3L (NIX) обеспечивает митохондриальный клиренс в ретикулоцитах. Аутофагия 8, 1325–1332. doi: 10.4161/auto.20764

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, Дж., и Ней, П. (2009). Аутофагиезависимые и независимые механизмы митохондриального клиренса при созревании ретикулоцитов. Аутофагия 5, 1064–1065. doi: 10.4161/авто.5.7.9749

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhang, J., Randall, M.S., Loyd, M.R., Dorsey, F.C., Kundu, M., Cleveland, J.L., et al. (2009). Митохондриальный клиренс регулируется Atg7-зависимыми и независимыми механизмами во время созревания ретикулоцитов. Кровь 114, 157–164. doi: 10.1182/blood-2008-04-151639

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

КОЕ-Э — обзор | ScienceDirect Topics

Эритропоэз

У большинства видов млекопитающих каждый HSC производит примерно 2×10 7 эритроцитов в течение нескольких месяцев.Мультипотентные гемопоэтические предшественники дифференцируются в мегакариоцитарные/эритроидные предшественники (MEP), за которыми следуют эритроидные взрывообразующие единицы и колониеобразующие единицы (BFU-E и CFU-E). В культуре BFU-E требуется 7–9 дней для превращения в CFU-E, которым требуется 3–5 дней для развития в рубрибласты. Примерно за 5 дней и 5 митотических делений рубрибласты дифференцируются в прорубрициты, полихроматофильные рубрициты, метарубрициты и ретикулоциты. В норме на каждый рубрибласт приходится около 50 руброцитов и 113 ретикулоцитов.У большинства видов ретикулоциты созревают в костном мозге в течение 2–3 дней, прежде чем попадают в кровоток.

Эритропоэтин (ЭПО) представляет собой эволюционно консервативный гликопротеиновый гормон, имеющий структурную гомологию с гормонами роста и гемопоэтическими цитокинами класса 1. Являясь основным эритропоэтическим гормоном, он стимулирует выживание, пролиферацию и созревание эритроидных клеток. Во время развития печеночный ЭПО поддерживает эритропоэз в печени плода. После рождения специализированные почечные клетки, продуцирующие эритропоэтин и чувствительные к кислороду (REPOS), становятся основным источником продукции ЭПО.Клетки REPOS представляют собой перитубулярные, интерстициальные фибробластоподобные клетки, расположенные в кортикомедуллярном кислородном градиенте юкстамедуллярной коры почки. Снижение регионарных уровней кислорода в крови может вызвать увеличение продукции ЭПО в 150–1000 раз, пролиферацию клеток REPOS и стабилизацию мРНК ЭПО. Печень также может способствовать выработке ЭПО в ответ на гипоксию (до 50% от общего количества ЭПО у взрослых грызунов).

Рецептор ЭПО экспрессируется на низких уровнях на ранних эритроидных клетках-предшественниках (BFU-E), на высоких уровнях на поздних клетках-предшественниках (CFU-E) и на ранних коммитированных эритроидных клетках, а затем снижается по мере того, как клетки становятся все более дифференцированными.Рецепторы ЭПО также экспрессируются в эндотелиальной, нервной, мышечной, сердечно-сосудистой и почечной тканях, где он защищает от ишемии тканей, способствуя вазоконстрикции и стимулируя ангиогенез и регенерацию нервов. Сила и продолжительность импульсов ЭПО, экспрессия рецепторов и активность киназ по отношению к фосфатазам регулируют кинетику созревания эритроцитов (эритроцитов).

Терминальная дифференцировка эритроидных клеток требует жесткой регуляции синтеза ДНК, деления ядер, конденсации хроматина, цитокинеза, потери органелл и гемоглобинизации.Скорость клеточного деления и созревания хроматина обычно соответствует скорости синтеза гемоглобина. По мере накопления гемоглобина общая транскрипционная активность снижается, и клетки становятся меньше. Гем накапливается раньше и быстрее, чем глобин, и регулирует свой собственный синтез так же, как и глобин. Когда достигается определенный уровень несвободного гема, поглощение железа и клеточное деление прекращаются, а ядро ​​экструдируется. В ретикулоцитах мРНК глобина защищены от деградации комплексами мРНК-белок (мРНП) и продолжают транслироваться в течение 1 недели после экструзии ядра.Успешный продолжительный синтез гемоглобина зависит от выживания мРНК глобина (период полураспада 10–60 часов) и от стабилизации свободных цепей глобина белками, стабилизирующими гемоглобин (α-HSP). Синтез гемоглобина сохраняется с низкой скоростью в течение 3–4 дней, пока не достигнет конечной концентрации. Избыток свободного гема быстро экспортируется или расщепляется гемоксигеназой, чтобы свести к минимуму образование АФК.

Созревание ретикулоцитов происходит в костном мозге, селезенке и кровообращении. Молодые ретикулоциты обладают высокой скоростью метаболизма, синтетической функцией и хрупкостью.Созревающие ретикулоциты теряют органеллы, площадь поверхности и поверхностные белки за счет образования экзосом и образования пузырей по мере ремоделирования мембран и стабилизации цитоскелета.

Миграция ретикулоцитов из БМ в кровоток является результатом потери молекул поверхностной адгезии, малого размера, повышенной деформируемости, градиентов давления вдоль стенки синуса БМ и индуцированного ЭПО увеличения количества и размера эндотелиальных пор. Зрелость клеток, поступающих в кровоток, зависит от вида и возраста. Во время базального эритропоэза люди, собаки (агрегат), кошки (точечный) и грызуны в основном выделяют ретикулоциты, в то время как жвачные животные и лошади выделяют в кровоток зрелые эритроциты.Базальное количество ретикулоцитов высокое у молодых грызунов и существенно снижается по мере их взросления. В ответ на эритропоэтический стимул кошки выделяют агрегаты ретикулоцитов, жвачные животные выделяют ретикулоциты, а лошади выделяют большие эритроциты. Ответы ретикулоцитов у грызунов устойчивы. Ретикулоциты, высвобождаемые в ответ на эритропоэтическую стимуляцию, менее зрелые и имеют более длительный период циркулирования (3–5 дней против 1–1,5 дней). Резкие возрастные изменения количества ретикулоцитов могут происходить у свиней (увеличение в возрасте 3–7 дней, снижение примерно в 3 недели, увеличение в 8 недель и снижение примерно в 3-месячном возрасте).Нередки резкие изменения количества ретикулоцитов даже у 6-месячных мини-свиней.

Продолжительность жизни зрелых циркулирующих эритроцитов определяется эриптозом и клиренсом на основе старения и варьируется в зависимости от скорости основного обмена у каждого вида (таблица 13.2). Эриптоз в эритроцитах аналогичен апоптозу в ядерных клетках и характеризуется сморщиванием клеток, образованием пузырей, скремблированием фосфолипидной клеточной мембраны и экспрессией фосфатидилсерина на клеточной поверхности. Это связано с широким спектром заболеваний, а также вызвано осмотическим шоком, окислительным стрессом, истощением энергии, гипертермией и многими малыми молекулами.Старение эритроцитов включает рецептор-опосредованное удаление старых или поврежденных эритроцитов макрофагами селезенки и костного мозга, а также клетками Купфера печени.

Таблица 13.2. Нормальная срок службы клеток крови положения

9077
RBC (дни) тромбоцитов (дни) Neitrofhil (H)
MICE 30-52 3-5 12,5
крысы 42-69 3 3 9
60-80
60-70
60672
60676 -70 3 3
Cats 60-80
100-120 4-9 7
Swine 80-100 7 8 8
Овцы 114 4
Toat 125
Nonhuman Primates 85-105 6.5
9064 120 120 7-10 6,6 к до 5,4 дня
140-150

Таблица модифицировано из Haschek, WM, Rousseaux, CG, Wallig, MA (Eds.), 2013. Справочник по токсикологической патологии, третье изд. Academic Press, Таблица 50.4, с. 1879 г. с разрешения.

VEGF увеличивает эритропоэз за счет независимой от гипоксии индукции эритропоэтина в неканонических периваскулярных стромальных клетках | Журнал экспериментальной медицины

Недостаточный эритропоэз из-за повышенного спроса обычно компенсируется гипоксической активацией эритропоэтина (Epo).Здесь мы обнаружили сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) в качестве нового индуктора Эпо, способного увеличивать циркулирующий Эпо в нормоксических, неанемических условиях в ранее неизвестном резервуаре Эпо-продуцирующих клеток (ЭПК), что приводит к расширению пула эритроидных предшественников и сильный селезеночный эритропоэз. Индукция Epo с помощью VEGF происходит в почках, печени и селезенке в популяции клеток Gli1 + SMA + PDGFRβ + , что характерно для гладкомышечных клеток сосудов (VSMC), полученных из мезенхимальных стволовых клеток, подобных клеткам-предшественникам.Неожиданно, ингибирование передачи сигналов PDGFRβ , , но не передачи сигналов VEGF , , отменяло VEGF-индуцированный синтез Epo. Таким образом, мы представляем VEGF в качестве нового игрока в индукции Epo и периваскулярных клетках Gli1 + SMA + PDGFRβ + в качестве ранее неизвестного резервуара EPC, который можно использовать для увеличения синтеза Epo в таких обстоятельствах, как хроническое заболевание почек, где производство канонические EPC скомпрометированы.

Эритропоэз представляет собой тщательно организованный процесс, завершающийся образованием зрелых энуклеированных эритроцитов из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) посредством бипотентных мегакариоцитарно-эритроидных клеток-предшественников и все более дифференцированных эритроидных клеток-предшественников.В нормальных условиях костный мозг (КМ) является основным местом эритропоэза у взрослых, но в случаях повреждения КМ или повышенной потребности в продукции эритроцитов селезенка может запускать компенсаторный эритропоэз в процессе, известном как экстрамедуллярный эритропоэз (ЭМЭ). Увеличение общего эритропоэтического продукта во всех случаях требует увеличения продукции эритропоэтина (ЭПО).

Epo представляет собой плейотропный цитокин, стимулирующий и поддерживающий эритропоэз на нескольких уровнях.Он играет ключевую роль в направлении кроветворения в сторону эритроидного ростка (Grover et al., 2014), в расширении пула эритробластов (von Lindern et al., 2004) и в оказании антиапоптотического эффекта (Koury and Bondurant, 1990). Основным контролем синтеза Epo является его гипоксическая индукция, опосредованная стабилизацией и связыванием HIF2α (гипоксия-индуцируемый фактор 2α) с промотором Epo (см. Koury and Haase, 2015 для недавнего обзора регуляции Epo при гипоксии). Однако значительно меньше известно о регуляции Epo при нормоксии.

Перитубулярные интерстициальные фибробластоподобные клетки почек (Koury et al., 1988; Lacombe et al., 1988; Semenza et al., 1991; Maxwell et al., 1993; Paliege et al., 2010) и, в меньшей степени, , гепатоциты (Koury et al., 1991) являются основными продуцентами Эпо в условиях гипоксии. Размер пула Эпо-продуцирующих клеток (ЭПК) коррелирует с общим уровнем транскрипции Эпо и, соответственно, с общим уровнем циркулирующего Эпо (Obara et al., 2008; Кури и Хаазе, 2015). Отслеживание клонов продемонстрировало, что все EPC имеют общего предшественника стромальных клеток FoxD1 + и что модуляция пути HIF (т. е. стабилизация HIF2α посредством инактивации белка фон Хиппеля-Линдау) может рекрутировать несколько субпопуляций стромальных клеток в пул EPC, таких как клетки, продуцирующие ренин, и интерстициальные фибробласты (Koury, Haase, 2015; Kobayashi et al., 2016). Хотя гладкомышечные клетки почечных сосудов (ГМКС) также происходят из стромальных клеток-предшественников FoxD1 + , они ранее не были вовлечены в продукцию Epo.

Повреждение EPC из-за фиброза приводит к неадекватной продукции Epo, что приводит к недостаточному эритропоэзу. Ярким примером является анемия, связанная с хронической болезнью почек (ХБП), которая возникает в результате повреждения EPC и их преобразования в миофибробласты SMA + (Asada et al., 2011; Souma et al., 2013). Это вызвало попытки восстановить функциональность поврежденных EPC, например, посредством манипуляций с HIF-путем, предназначенных для имитации нативной гипоксической реакции (Kurt et al., 2015; Чанг и др., 2016; Сума и др., 2016). Показанная здесь альтернативная возможность заключается в рекрутировании альтернативных типов клеток в канонический пул EPC независимо от пути HIF. Привлекательными типами клеток-кандидатов в этом отношении являются почечные мезенхимальные и стромальные клетки, происходящие от предшественника, общего с таковым канонических EPC, но ранее не приписываемого продукции Epo, такого как VSMC.

Gli1 представляет собой транскрипционный фактор цинкового пальца, первоначально характеризованный для глиобластомы, который был недавно идентифицирован как маркер PDGFRβ + мезенхимальных стволовых клеток (МСК), подобных периваскулярным клеткам, которые локализуются в нише перицитов и обладают потенциалом трехлинейной дифференцировки в хондроциты, остеобласты, и адипоциты (Zhao et al., 2014; Краманн и др., 2015, 2016). Было показано, что при повреждении органов и неоваскуляризации во многих органах, включая сердце и почки, резидентные клетки Gli1 + размножаются и становятся миофибробластами или VSMC, мигрируя из адвентиции в медийные и неоинтимальные слои сосудистой системы (Kramann et al., 2015). , 2016).

Здесь мы обнаружили, что фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A) способен увеличивать продукцию Epo независимо от гипоксии.VEGF-A представляет собой секретируемый фактор роста, в основном известный своей ангиогенной активностью; тем не менее, VEGF обладает многими дополнительными активностями как по отношению к сосудистой системе, так и вне ее (см. Senger, 2010 для обзора множественных функций VEGF). Несосудистые функции VEGF обычно опосредованы рецепторами VEGF, экспрессируемыми множеством несосудистых клеток, включая HSC и различные клетки миелоидного ряда (Hattori et al., 2001; Gerber et al., 2002; Xue et al., 2009; Rehn). и др., 2014). Это также может объяснить очевидные эффекты VEGF на множественные процессы гемопоэтического каскада (Bautz et al., 2000; Черви и др., 2007 г.; Хуанг и др., 2007 г.; Дрогат и др., 2010). Подобно Epo, VEGF может индуцироваться гипоксией через ось HIF/VHL, где он улучшает тканевую перфузию, способствуя неоваскуляризации (Shweiki et al., 1992; Forsythe et al., 1996). Поэтому неудивительно, что VEGF и Epo часто совместно индуцируются в тканях, испытывающих гипоксию, особенно в гипоксических опухолях. В то время как при некоторых видах рака наблюдаемая спленомегалия и EME коррелируют с повышенными уровнями как циркулирующего VEGF, так и Epo (Baccarani et al., 1978; Сюэ и др., 2009 г.; Пинчевски и Пападимитриу, 2011 г.; Feng et al., 2013), причинно-следственная связь между ними не изучалась.

Мы предоставили первое доказательство того, что VEGF является мощным индуктором Эпо, приводящим к общему увеличению продукции эритроцитов независимо от гипоксии. Кроме того, мы показываем, что VEGF-управляемая продукция Epo происходит в ранее не охарактеризованной периваскулярной популяции EPC и опосредована неканоническим способом передачи сигнала VEGF, зависящим от рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGFRβ).

Чтобы определить, может ли VEGF увеличивать циркулирующие уровни Epo независимо от гипоксии, мы использовали трансгенную систему для условной и обратимой индукции VEGF у взрослых мышей. Вкратце, VEGF индуцировался при изъятии тетрациклина (Tet) из питьевой воды у битрансгенных мышей, у которых гепатоцит-специфический, Tet-регулируемый белок-трансактиватор управляет экспрессией основной секретируемой изоформы VEGF VEGF-A 164 (см. Материалы и методы для детали эксперимента).Печеночный источник эктопического VEGF, действующий под промотором обогащенного печенью белка-активатора (LAP), был выбран для обеспечения постоянно высоких устойчивых уровней циркулирующего VEGF (Dor et al., 2002). VEGF индуцировали в возрасте 6 недель, и его уровни в крови контролировали еженедельно с помощью VEGF-специфического ELISA. Было обнаружено, что устойчивые уровни циркулирующего VEGF варьируются у мышей в диапазоне 300–1100 пг/мл, при этом у большинства циркулирующие уровни находятся в диапазоне 600–1000 пг/мл. Индуцированный VEGF в этой системе доступен для всех удаленных органов и может быть изъят по желанию путем повторного добавления Tet в питьевую воду.

Как показано на фиг. 1А, VEGF дозозависимо повышал уровни Epo в плазме. При более высоких уровнях VEGF уровни Epo в плазме достигали более чем в 10 раз более высоких уровней по сравнению с неиндуцированными контрольными однопометниками. Важно отметить, что для поддержания этих повышенных уровней циркулирующего ЭПО требовалась постоянная передача сигналов VEGF, о чем свидетельствует его снижение в течение 1-2 недель после отмены VEGF (рис. 1В). Чтобы определить относительный вклад различных органов в общий циркулирующий VEGF-индуцированный Эпо, обе мРНК Эпо (фиг.1C) и белок Epo (рис. 1D) измеряли в гомогенатах тканей органов, известных как продуценты Epo, а именно почек, печени и селезенки. Индуцированная VEGF продукция Epo в почках отражалась в резком, почти 20-кратном увеличении мРНК Epo и, соответственно, в аналогичном увеличении белка Epo. В печени и селезенке также наблюдалось более скромное, но существенное четырех-пятикратное увеличение продукции ЭПО.

Мы предположили, что VEGF передает сигналы Epo-продуцирующим SMA + периваскулярным стромальным клеткам через свой основной сигнальный рецептор, Flk1/VEGFR2.Однако Flk1/VEGFR2 не обнаруживался на периваскулярных клетках SMA + с использованием репортерной мыши с нокаутом Flk1/VEGFR2-GFP (рис. 5, A-C). Чтобы дополнительно изучить посредническую роль канонических рецепторов VEGF, мы измерили уровни Epo в плазме у мышей, индуцированных VEGF, получавших нейтрализующее VEGFR1 антитело MF1 и нейтрализующее VEGFR2 антитело DC101 (Eli Lilly & Co.). Вкратце, соответствующие антитела вводили внутрибрюшинно. в дозе 40 мг/кг каждые 48 ч, начиная с 3 недели после индукции VEGF, а через неделю брали плазму для анализа (рис.5 Д). Индуцированный VEGF Epo не подвергался влиянию нейтрализации VEGFR1 или VEGFR2, что исключает их участие в передаче сигнала VEGF к периваскулярным клеткам SMA + (рис. 5, E и F).

Предыдущие исследования показали, что VEGF может связываться и передавать сигналы непосредственно PDGFR в различных условиях in vitro, в том числе в МСК (Ball et al., 2007), и может конкурировать с опосредованной PDGFR передачей сигналов в стекловидном теле глаза (Pennock and Kazlauskas, 2012). ).Поэтому мы исследовали возможность передачи сигналов VEGF через PDGFRβ периваскулярным EPC в почках, печени и селезенке. Действительно, иммуноокрашивание показало, что VEGF индуцирует фосфорилирование PDGFRβ, особенно в периваскулярных клетках SMA + во всех трех органах (фиг. 6А). Примечательно, что это фосфорилирование PDGFRβ требовало продолжения передачи сигналов VEGF и прекращалось при деиндукции VEGF (режим ON-OFF; рис. S3). Чтобы определить, действительно ли PDGFRβ необходим для передачи сигналов VEGF на эти EPC, мы использовали подход нейтрализации PDGFRβ in vivo.Для изучения роли рецепторов VEGF использовали экспериментальный протокол, аналогичный описанному выше, за исключением того, что антитела, нейтрализующие рецептор VEGF, заменили антителами, нейтрализующими PDGFRβ (1B3; Eli Lilly & Co.) (фиг. 6В). Результаты показали, что блокада PDGFRβ сводила на нет экспрессию мРНК VEGF-индуцированного Epo в почках, печени и селезенке (рис. 6, C-E), а также почти не отражалась в дополнительном увеличении циркулирующего VEGF-индуцированного Epo в течение периода лечения 1B3 (рис. 6 F). В соответствии с нашей идентификацией периваскулярных клеток SMA + как ЭПК, рекрутированных VEGF (рис.2 и 3), блокада PDGFRβ приводила к уменьшению доли периваскулярных клеток SMA + , продуцирующих ЭПО, до базального неиндуцированного уровня (рис. 6, Ж и З). Хотя наши данные демонстрируют четкую потребность в PDGFRβ для опосредования VEGF-индуцированной повышающей регуляции Epo, мы не можем различить возможности прямой и непрямой передачи сигналов.

Затем мы хотели определить, приводит ли значительное увеличение уровней циркулирующего Epo, индуцированное VEGF, к усилению эритропоэза.Таким образом, мы исследовали эритропоэз у мышей с возрастающими уровнями циркулирующего VEGF по сравнению с эритропоэзом у неиндуцированных контрольных однопометников. В качестве предварительного показателя активного эритропоэза мы измерили ретикулоцитарный индекс при повышении уровня VEGF в плазме, демонстрируя дозозависимое увеличение ретикулоцитарного индекса в циркулирующей крови при увеличении VEGF (рис. 7А).

В качестве более прямого считывания эритропоэза мы провели количественную оценку эритробластов, идентифицированных как клетки, дважды положительные по панэритроидному поверхностному маркеру Ter119 и маркеру зародышеобразования DRAQ5 с помощью FACS (рис.7 Б). Поскольку селезенка также является потенциальным местом эритропоэза, которое при определенных обстоятельствах может вносить существенный вклад в общий эритропоэтический выброс при ЭМЭ, мы включили в этот анализ как костный мозг, так и селезенку. Было обнаружено, что общее количество эритробластов BM было лишь умеренно увеличено и только при самом высоком диапазоне уровней циркулирующего VEGF (фиг. 7C). Однако в селезенке общее количество эритробластов резко увеличивалось с повышением уровня VEGF, при этом почти четырехкратное увеличение происходило в диапазоне 700–1000 пг/мл плазмы VEGF, что приводило общее количество эритробластов к значительно более высокому уровню. чем у контрольных мышей (рис.7 Д). Чтобы непосредственно визуализировать текущий эритропоэз, срезы подвергали тройному иммуноокрашиванию с маркером эритроидного происхождения Ter119, маркером пролиферации Ki67 и ядерным красителем DAPI для пролиферирующих (тройной положительный) и непролиферирующих (Ki67 , двойной положительный) эритробластов. Как показано на фиг. 7 (E и F) для селезенки, VEGF вызывал сильное увеличение эритробластов in situ в селезенке.

Чтобы очертить этапы эритропоэтического каскада, на которых может действовать VEGF-индуцированный Epo, мы исследовали профиль дифференцировки эритроидных предшественников в BM и селезенке с использованием анализа на основе FACS, описанного Koulnis et al.(2011). В этой процедуре популяция клеток Ter119 hi дополнительно сортируется в соответствии с размером (прямой разброс) и статусом активации (экспрессия CD71) и делится на субпопуляции эритроидных предшественников EryA, EryB и EryC, соответствующие порядку повышенной дифференцировки (рис. 8 А). В обоих органах дозозависимое увеличение VEGF-индуцированных уровней ЭПО в плазме приводило к увеличению относительной частоты ранних эритроидных предшественников и, наоборот, к снижению относительной частоты поздних эритроидных предшественников (см.8В для репрезентативного примера и фиг.8С для количественного определения). Эти результаты показывают, что субпопуляция эритроидных предшественников, наиболее размножающаяся под действием VEGF, представляет собой фракцию EryA, состоящую в основном из базофильных эритробластов, фракция, которая, как ранее было показано, очень чувствительна к Epo для ее экспансии (Vandekerckhove et al., 2009).

В этом исследовании представлен VEGF в качестве ранее неизвестного индуктора Epo и периваскулярных клеток Gli1 + SMA + PDGFRβ + в качестве ранее неизвестного резервуара EPC.Это также показывает, что VEGF-индуцированный Epo этой субпопуляцией EPC действует, чтобы увеличить эритропоэтический выброс, комбинированный результат бескомпромиссного эритропоэза BM и индуцированного EME селезенки. Сильное увеличение уровня Epo в плазме, вызванное VEGF (более чем в 10 раз превышающее физиологические уровни), является результатом его повышенной продукции тремя различными органами: почками, печенью и селезенкой. При нормализации к массе ткани почки явно являются органом, наиболее чувствительным к VEGF в отношении повышающей регуляции Epo. Однако, учитывая гораздо больший размер печени, общий вклад последней в циркулирующий ЭПО также весьма значителен.VEGF индуцирует Epo дозозависимым образом и проявляется уже при относительно низких дозах 200-400 пг/мл циркулирующего VEGF, которые лишь в два-три раза превышают нормальные уровни VEGF в плазме. Примечательно, что VEGF-индуцированная активация Epo в нашей экспериментальной системе происходит на фоне беспрепятственного эритропоэза и без признаков гипоксии или анемии, что указывает на то, что это не компенсаторный ответ на эритропоэтический стресс.

Что касается того, играет ли VEGF роль в гомеостатической продукции Epo, ранее было показано, что VEGF негативно регулирует синтез Epo гепатоцитами (но не почечными клетками) с использованием нескольких стратегий ингибирования VEGF, которые усиливают синтез Epo в печени (Tam et al., 2006). Напротив, мы не наблюдали увеличения уровней циркулирующего Эпо за счет системного ингибирования VEGF с использованием мыши Tet-sFlt1/LAP tTA с ловушкой VEGF (рис. S1). Возможное объяснение этого несоответствия заключается в том, что некоторые стратегии ингибирования VEGF (например, нейтрализация VEGFR2 с помощью mAb DC101) могут приводить к временному увеличению циркулирующего VEGF, что, в свою очередь, может индуцировать Epo (Bocci et al., 2004). Кроме того, Там и соавт. (2006) сосредоточились на гепатоцитах как продуцентах Epo, тогда как здесь было показано, что VEGF регулирует Epo в периваскулярной субпопуляции EPC в почках, печени и селезенке.Интересно, что недавно было показано, что возникающая в результате гипоксия, связанная с некоторыми стратегиями ингибирования VEGF, может также индуцировать почечный Epo как нецелевой эффект (Nakamura et al., 2017), предполагая, что индукция Epo при ингибировании VEGF может быть функцией степени результирующей системной гипоксии при любой заданной стратегии ингибирования VEGF. Наши результаты приводят нас к заключению, что хотя повышенный уровень VEGF на уровнях, соответствующих патологическим состояниям, явно способен увеличивать продукцию негипоксического ЭПО, он необязателен для гомеостатической продукции ЭПО.

Наши данные о субпопуляции EPC, вовлеченной в VEGF-индуцированную продукцию Epo, следует обсудить со ссылкой на известные EPC в других контекстах. Идентичность почечных клеток, продуцирующих Epo в условиях гипоксии, основанная на гибридизации in situ и иммуноокрашивании, несколько противоречива. Подход к генетической маркировке с использованием мышей Epo-GFP в условиях анемии подтвердил представление о том, что почечные перитубулярные интерстициальные фибробластоподобные клетки коры и наружного мозгового вещества являются основными продуцентами Epo при гипоксии, тогда как интеркалированные клетки собирательных трубочек и проксимальных и дистальных канальцев являются основными продуцентами физиологического ЭПО при нормоксии (Pan et al., 2011; Нагаи и др., 2014). Однако следует отметить, что «перитубулярные интерстициальные фибробластоподобные клетки» — это широкий термин, охватывающий гетерогенную группу почечных интерстициальных клеток, которые напоминают фибробласты, и что прежняя путаница в отношении точной идентичности почечных ЭПК, вероятно, связана с недооценкой гетерогенности. этого клеточного пула. В соответствии с этой идеей недавно было показано, что почечные ЭПК, вероятно, происходят от общего стромального предшественника FoxD1 + , способного генерировать несколько подтипов интерстициальных клеток (Kobayashi et al., 2016). Показано, что ряд клеток, способных продуцировать Epo в условиях гипоксии, включает также астроциты (Weidemann et al., 2009) и остеобласты (Rankin et al., 2012).

Что касается EPC под действием VEGF, мы идентифицировали как классические EPC, так и уникальную популяцию периваскулярных стромальных клеток SMA + , напоминающих VSMC (рис. 5). Мы отмечаем, что последняя субпопуляция EPC, как ранее не сообщалось, продуцирует Epo, в отличие от других субпопуляций стромальных клеток, которые либо продуцируют Epo в условиях гипоксии, либо могут фармакологически манипулировать ингибированием PHD2 для индукции Epo (Kobayashi et al., 2016). Учитывая, что во всех субпопуляциях ЭПК VEGF индуцирует ЭПО даже в условиях нормоксии, в сочетании с данными о том, что общий уровень продукции ЭПО коррелирует с размером пула ЭПК (Obara et al., 2008; Koury and Haase, 2015), VEGF, по-видимому, высокоэффективный индуктор продукции ЭПО.

Используя отслеживание клонов, мы показываем, что значительная часть Epo-экспрессирующих периваскулярных стромальных клеток под действием VEGF является потомками Gli1 + PDGFRβ + MSC-подобных клеток, локализованных в нише перицитов.Поскольку рекомбинация не является 100%, мы предполагаем, что процент VEGF-индуцированных EPC, которые мы идентифицировали как потомков Gli1 + , вероятно, занижен. Примечательно, что МСК-подобные клетки-предшественники могут секретировать факторы, способствующие регенеративному микроокружению при повреждении органа (Caplan and Correa, 2011). С другой стороны, было показано, что клетки Gli1 + вызывают кальцификацию сосудов при активации при ХБП и способствуют фиброзу, вызванному повреждением (Kramann et al., 2015, 2016).На фоне фиброза, связанного с ХБП, клетки Gli1 + разрастаются и приобретают СМА (Kramann et al., 2015). Интересно, что приобретение СМА считается отличительной чертой конверсии миофибробластов, связанной с потерей способности продуцировать ЭПО поврежденными почечными ЭПК (Asada et al., 2011; Kramann and Humphreys, 2014), хотя при VEGF периваскулярные ЭПК экспрессируют СМА, сохраняя при этом Эпо- производственная способность. В моделях повреждения органов и последующего ангиогенеза клетки Gli1 + мигрируют из адвентиции в медиальный слой и неоинтиму и расширяются, приобретая фенотип, подобный СГМК (Kramann et al., 2016). Мы наблюдаем подобное явление при индукции VEGF, и мы предполагаем, что эти клетки рекрутируются в пул EPC с помощью VEGF.

В настоящее время предпринимаются усилия по предотвращению развития анемии в моделях ХЗП путем восстановления способности продуцировать Epo в трансформированных миофибробластах SMA + или индукции альтернативных эктопических клеточных популяций для продукции Epo (Bussolati et al., 2013; Kurt et al. др., 2015; Чанг и др., 2016; Сума и др., 2016). Например, генетическая инактивация пролилгидроксилаз HIF для активации пути HIF была успешно использована для восстановления продукции Epo миофибробластами, трансформированными SMA + (Souma et al., 2016), а также для рекрутирования как ренин-экспрессирующих, так и мезангиальных клеток. клеток в пул EPC (Kurt et al., 2015). Наши результаты предлагают другой подход к компенсации дефицита Epo, а именно использование VEGF для рекрутирования периваскулярных клеток Gli1 + SMA + PDGFRβ + в пул EPC.

На вопрос о том, как VEGF взаимодействует с периваскулярными клетками SMA + Gli1 + PDGFRβ + , предыдущие исследования показали, что VEGF может способствовать ассоциации между эндотелиальными клетками и клетками Gli1 + (Kramann et al., 2015 ), что VEGF может регулировать мобилизацию МСК и рекрутирование в места неоваскуляризации, и что передача сигналов VEGF к МСК, лишенным VEGFR, опосредуется рецепторами PDGF посредством прямого фосфорилирования тирозина, индуцированного VEGF (Ball et al., 2007). Эти результаты согласуются с нашим наблюдением, что VEGF-индуцированная активация Epo в клетках Gli1 + SMA + PDGFRβ + опосредуется не каноническими рецепторами VEGF, а скорее PDGFRβ. Этот вывод также согласуется с исследованием с использованием мышей с опухолями, показывающим, что передача сигналов PDGF-BB опухолевого происхождения через PDGFRβ может активировать промотор Epo и индуцировать эктопическую продукцию Epo в стромальных клетках селезенки в условиях нормоксии (Xue et al., 2011). . Хотя наши результаты ясно показывают, что PDGFRβ необходим для VEGF-индуцированного рекрутирования этой конкретной популяции EPC, и указывают на прямой механизм действия, возможность того, что VEGF косвенно сигнализирует PDGFRβ посредством повышающей регуляции PDGF-BB, канонического лиганда PDGFRβ, должны быть проверены и не могут быть исключены.Интересно, что PDGFRβ отрицательно регулирует эктопический эритропоэз в сосудах плацентарного лабиринта по отношению к продукции Epo плацентарными трофобластами, демонстрируя многочисленные роли PDGFRβ в регуляции Epo, зависящие от контекста (Chhabra et al., 2012).

Мы показали, что устойчивый эритропоэз может быть установлен вне костного мозга просто путем повышения уровня циркулирующего VEGF в допустимом диапазоне (300–1000 пг/мл).Примечательно, что VEGF-индуцированный ЭМО повышает общий эритропоэтический выброс, потому что, в отличие от стресс-индуцированного ЭМО, он не происходит за счет нарушения эритропоэза костного мозга и происходит в нормоксических условиях. Наше наблюдение, что EME зависит от дозы VEGF, с дефектом дифференцировки, приводящим к неэффективному эритропоэзу, происходящему при чрезмерно высоких уровнях циркулирующего VEGF (≥1200 пг/мл) в течение длительного периода времени (данные не показаны), может объяснить несоответствие почему в некоторых случаях сверхэкспрессия VEGF приводит к усилению эритропоэза (Cerdan et al., 2004; Черви и др., 2007 г.; Сюэ и др., 2009 г.; Rehn et al., 2014), тогда как в других случаях наблюдался дефект эритроидной дифференцировки, приводящий к анемии (Drogat et al., 2010). Мы предполагаем, что когда уровни циркулирующего VEGF находятся между 300 и 1000 пг/мл при патологических сценариях, как это наблюдается при многих видах рака (Kraft et al., 1999), VEGF может усиливать эритропоэз, но при уровнях VEGF, превышающих этот порог, который часто наблюдаемый при далеко зашедшем метастатическом заболевании, повышенный уровень VEGF может способствовать развитию анемии (Salven et al., 1997). Точно так же наши результаты могут объяснить корреляцию, описанную в клинической литературе, между уровнями VEGF в сыворотке, EME и неэффективным эритропоэзом (Panteli et al., 2007; Maktouf et al., 2011; Prakash et al., 2012).

Рекомбинантный эритропоэтин широко используется для лечения анемии, но его использование у онкологических больных с анемией остается спорным. Хотя было показано, что введение рекомбинантного ЭПО улучшает течение анемии, прогрессирование заболевания и долгосрочная выживаемость ухудшаются, когда пациенты с метастатическим раком лечатся ЭПО (Leyland-Jones et al., 2005; Spivak, 2005), что вызывает опасения, что Epo является протуморогенным и проангиогенным. Наше обнаружение того, что повышенный уровень VEGF индуцирует Epo, повышает вероятность того, что перекрестные помехи VEGF-Epo могут играть усиливающую роль в пролиферации раковых клеток и опухолевом ангиогенезе в гипоксических опухолях, в которых VEGF и Epo индуцируются совместно. Помимо тканевой гипоксии существуют также обстоятельства, при которых VEGF может усиливать Epo. Например, мы подозреваем, что гормонально индуцированный VEGF во время беременности может играть роль в кажущемся транзиторном увеличении EME селезенки.

Эритропоэз представляет собой сложный многоэтапный процесс, в котором Epo играет фундаментальную роль на ранней стадии. Наш анализ эритроидной дифференцировки показывает, что VEGF действительно действует, предпочтительнее размножая базофильные эритробласты, субпопуляцию эритроидных предшественников, высоко реагирующую на Epo. Тем не менее, объяснение того, как VEGF как отдельно индуцируемый фактор может управлять всеми подпроцессами продуктивного EME, включая мобилизацию HSC, экстрамедуллярную задержку, создание правильной эритропоэтической ниши и обеспечение комплементарных эритропоэтических факторов, в настоящее время плохо изучено и является предметом продолжающихся исследований. в нашей лаборатории.

Из печени, селезенки и почки вырезали

парафиновых среза толщиной 5 мкм. Извлечение антигена проводили с помощью цитратного буфера (pH 6; Zymed Laboratories) в скороварке. Замороженные срезы готовили путем фиксации в 4% параформальдегиде с последующей обработкой 30% сахарозой и заливали в компаунд с оптимальной температурой резки перед вырезанием срезов размером 10–12 мкм на криостате Leica CM1950.

Иммунофлуоресценцию проводили с использованием как парафиновых, так и замороженных срезов VEGF-LAP и контрольных образцов печени, селезенки и почек.Срезы блокировали в 1% BSA и 0,5% Triton X-100. Первичные антитела включали кроличьи антитела к Эпо (1:50, H-162, sc-7956; Санта-Крус), мышиные антитела к Эпо (1:50, 7D10, sc-80995; Санта-Крус), кроличьи SMA (1:200, ab32575; Abcam), СМА мыши (1:200, ab7817; Abcam), фосфо-PDGFRβ кролика (1:50, фосфо Y1021, ab62437; Abcam), GFP кролика (1:200, G10362; Invitrogen), CD68 мыши (1:200 , KP1, ab955; Abcam), крыса CD73 (1:50, 14-0731; eBioscience), крыса Ter119 (1:100, ab

; Abcam), кролик Ki67 (1:200, SP6, RM9106S; Thermo Scientific), крыса PDGFRβ (1:00, 14-1402, APB5; eBioscience) и VCAM1 кролика (1:50, EPR5047, ab134047; Abcam).Лектины и красители включали DRAQ5 (1:1000, 65-0880-92; eBioscience), биотинилированный GSLI-изолектин B4 (1:10, B-1205; Vector Laboratories), родамин DBA (1:100, RL-1032; Vector Laboratories). ) и флуоресцеин LTL (1:100, FL-1321; Vector Laboratories). Срезы инкубировали в первичных антителах в течение ночи и разводили в 1% BSA и 0,5% Triton X-100 при 4°C. Пимонидазол (60 мг/кг Hypoxyprobe; Chemicon) вводили внутрибрюшинно. за 30 мин до умерщвления животных. Флуоресцентные вторичные антитела включали ослиные антимышиные, кроличьи и крысиные антитела, конъюгированные с AF488, AF647, Cy3 и экстравидином (Лаборатория Джексона), используемые в соотношении 1:200.Срезы монтировали с помощью монтажной среды Permafluor, содержащей DAPI (Thermo Fisher Scientific). Конфокальную микроскопию выполняли с использованием Olympus FV-1000 с использованием объективов 20×, 40× и 80× с одноплоскостным или Z-стеком. Конфокальные изображения анализировали с помощью FV10-ASW 3.0 Viewer и ImageJ (Национальный институт здравоохранения).

Мы благодарим Аласдера Руни и Александра Медвинского за использование модели мыши VEGR2/ Flk-1 GFP/+ и за великодушную подготовку образцов мыши VEGR2/ Flk-1 GFP/+ для секционирования и иммуноокрашивание.Мы благодарны Шмуэлю Бен-Сассону и Майклу Бергеру за полезные беседы и рекомендации относительно проекта.

Работа выполнена при поддержке Израильского научного фонда (грант 624/16 Э. Кешет и М. Грюневальд).

С. С. Оладипупо и С. Айер работают в компании Eli Lilly & Co. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Вклад авторов: А. К. Гринвальд разработал исследование, провел эксперименты, проанализировал данные и написал статью. T. Licht участвовал в создании мыши Gli1-CreERT2;Ai9 TdTomato/Tet VEGF164-LAP tTa и выполнял визуализацию, исследования на животных и анализ данных. С. Кумар проводил опыты. С. С. Оладипупо и С. Айер предоставили реагенты и участвовали в разработке и анализе экспериментов по ингибированию PDGFRβ in vivo, а также в написании статьи.М. Грюневальд разработал исследование, провел эксперименты, проанализировал данные и участвовал в написании статьи. Э. Кешет разработал исследование, проанализировал данные и написал статью.

Vegf регулирует развитие эмбриональных эритроидных клеток посредством модуляции Gata1 | Кровь

В этом исследовании мы генетически исследовали влияние потери Vegf и Flk1 , а также приобретения Vegf 164 на дифференцировку эритроидного ростка in vivo. Vegf 31 и Flk1 32 были условно делетированы в предшественниках эритроидных клеток с использованием линии EpoR-iCre. 28 В дополнение к этим исследованиям изоформа Vegf 164 29,30 также была сверхэкспрессирована конститутивно или индуцибельно в этих предшественниках.

Модуляция Vegf, специфичная для эритроидного ряда, выявила важную роль этого фактора роста во время как примитивного, так и дефинитивного эмбрионального эритропоэза.Сверхэкспрессия Vegf на ранних стадиях эритропоэза приводила к уменьшению количества эритроидных клеток в островках крови YS. Этот дефект эритропоэза у эмбрионов +Vegf164 Eryth был связан с задержкой роста и гибелью на E10.5. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия Vegf блокирует потенциал дифференцировки как примитивных, так и дефинитивных эритроидных предшественников между стадиями BFU-E и CFU-E. Этот блок эритропоэза был связан со снижением экспрессии Gata1, Fog1 и их генов-мишеней, участвующих в эритроидной дифференцировке.Более того, делеция Vegf в той же линии привела к дозозависимому увеличению экспрессии некоторых из этих генов и усилению дифференцировки эритроидных предшественников в анализах образования колоний YS. Несколько исследований показали, что у мутантных мышей, лишенных Gata1 , отсутствуют функциональные примитивные эритроциты, и они умирают в период от E10.5 до E11.5, 24,37  , что указывает на то, что интактные примитивные эритроциты необходимы для выживания эмбриона после E11.5. Подобно этим мутантам, эмбрионы +VEGF164 Eryth погибают примерно на этой стадии с дефектами как примитивной, так и дефинитивной эритроидной дифференцировки.В совокупности эти данные указывают на функциональную связь между уровнями эритроидного Vegf и экспрессией Gata1. Более того, через 2 дня индукции Vegf 164 у всех эмбрионов +VEGF164 Eryth-Dox было обнаружено сниженное количество эритроцитов в эмбрионе, связанное с аналогичным блоком эритроидной дифференцировки в печени плода, как это наблюдалось в E10.5 + VEGF164 Эрит YSs. Этот блок эритропоэза в печени плода также коррелирует со снижением экспрессии Gata1 и Fog1, демонстрируя, что негативные эффекты Vegf на эритропоэз не ограничиваются YS.Соответственно, аналогичные Gata1-связанные блоки развития эритроидов наблюдались у эмбрионов Xenopus , инъецированных Vegf. 43  Таким образом, повышенная экспрессия Vegf оказывает эволюционно законсервированное негативное влияние на эритропоэз. Однако эффекты Vegf не ограничиваются модуляцией экспрессии Gata1, так как другие гемопоэтические транскрипционные факторы, такие как Runx1 и Tal1, также модулируются гиперэкспрессией эритроидного Vegf. Действительно, уровни экспрессии Runx1 и Tal1, соответственно, увеличивались и уменьшались у эмбрионов +VEGF164 Eryth , но оставались неизменными у эмбрионов VEGF ΔEpoR-iCre и +VEGF164/hGata2 Eryth YS.Эти факторы транскрипции также могут быть вовлечены в негативные эффекты избыточной экспрессии Vegf на дифференцировку эритроидов и специфические изменения в некоторых, но не во всех исследованных генах-мишенях Gata1. Необходимы дополнительные исследования, чтобы установить предполагаемую роль, которую эти факторы транскрипции играют в индуцированных Vegf дефектах эритропоэза.

Недавно Ferreira et al. продемонстрировали, что регуляция уровней фактора Gata более важна, чем их идентичность, спасая эмбриональную летальность, вызванную делецией Gata1 с трансгеном Gata2, экспрессируемым под контролем промотора Gata1 . 41 Кроме того, несколько исследований показали, что Gata2 отвечает за индукцию Gata1 на стадии BFU-E, что позволяет дифференцироваться в предшественники CFU-E. 18,26,27 Соответственно, мы обнаружили, что уровни экспрессии Gata1 в +hGata2 Eryth YS были повышены. Кроме того, Suzuki et al показали, что клетки Gata 1,05 , которые экспрессируют Gata1 примерно на 5% от контрольного уровня на протяжении всего гемопоэтического развития, 44  , не смогли дифференцироваться до стадии CFU-E и блокируются на стадии BFU-E. сцена. 27 Таким образом, чтобы преодолеть снижение уровней Gata1, наблюдаемое у YS +Vegf164 Eryth , и попытаться спасти блок эритроидной дифференцировки, вызванный сверхэкспрессией Vegf, мы экспрессировали hGata2 специфически в эритроидной линии эмбрионов +Vegf164 Eryth . В E10.5 YS этих двойных мутантных эмбрионов уровень экспрессии Gata1 сравним с таковым, наблюдаемым у контрольных эмбрионов. Интересно, что анализы колониеобразующих клеток, проведенные на предшественниках +VEGF164/hGata2 Eryth YS, показали восстановление блока дифференцировки как примитивных, так и дефинитивных эритроидных предшественников, индуцированного сверхэкспрессией Vegf.Это говорит о том, что негативные эффекты Vegf на эритроидную дифференцировку проявляются посредством подавления экспрессии Gata1.

Специфическая Vegf эксперименты по потере функции во время примитивного и дефинитивного эритропоэза показали нормальную и повышенную дифференцировку эритроидных предшественников, соответственно. Мыши с потерей функции VEGF ΔEpoR-iCre дожили до взрослого возраста без каких-либо явных фенотипических аномалий.Таким образом, мы можем предположить, что Vegf из других источников, таких как внеэмбриональная висцеральная энтодерма YS 7 , может действовать на эритроидные клетки паракринным образом и что аутокринные источники Vegf из эритроидных клеток не являются абсолютно необходимыми для нормального эритропоэза, но должны быть строго контролируется и может служить для тонкой настройки развития эритроидных клеток. Соответственно, недавняя публикация показала, что отсутствие висцеральной энтодермы в дифференцирующихся эмбриоидных телах (EBs) не препятствует появлению дефинитивных предшественников из EBs при добавлении Vegf. 45 

Для определения клеточных автономных эффектов аутокринных уровней Vegf на пролиферативные и дифференцировочные способности эритроидных клеток-предшественников Flk1 был специально делетирован в эритроидном ростке в начале дифференцировки предшественников. Потеря Flk1 не приводила к каким-либо очевидным эффектам на экспрессию мРНК Gata1 или к каким-либо изменениям в дифференцировке эритроидных предшественников. Ранее мы продемонстрировали, что делеция Flk1 у остеохондропредшественников может частично восстанавливать Vegf-опосредованное избыточное костеобразование. 29 Учитывая тот факт, что эритроид-специфическая делеция Flk1 не может спасти индуцированное Vegf снижение экспрессии мРНК Gata1, блокаду эритропоэза или летальность, наши данные предполагают, что Flk1 не опосредует эффекты Vegf на эту линию. Более того, этот рецептор не обязательно необходим клеточно-автономным образом для самой эритроидной дифференцировки. Т.о., действие Flk1, скорее всего, ограничивается гарантией того, что мезодермальные предшественники помещаются в правильную среду для ответа на соответствующие сигналы для гематопоэза 10 и для генерации коммитированных эритроидных предшественников. 46  Наши данные согласуются с предыдущими отчетами, которые продемонстрировали наличие дефинитивных эритроцитов в Flk1 -/- EB. 47  Предыдущие исследования предполагают, что экспрессия Flt1, в отличие от Flk1, увеличивается с созреванием гемопоэтических клеток 48  и экспрессируется на стадии BFU-E, тогда как Flk1 нет. 49  Кроме того, делеция тирозинкиназного домена Flt1 приводит к уменьшению числа предшественников BFU-E. 50  Таким образом, мы предполагаем, что этот рецептор может быть ответственным за клеточно-автономные эффекты Vegf на дифференцировку эритроидов. Наши данные in vivo немного расходятся с предыдущими исследованиями, показывающими, что при добавлении экзогенного Vegf к дифференцирующимся эмбриоидным телам количество эритроидных колоний увеличивается и что эти предшественники, по-видимому, обладают большей способностью к самообновлению. Однако эффект Vegf на пролиферацию и дифференцировку эритроидных клеток был получен, когда среда была обогащена дополнительными цитокинами, такими как BMP4, который не использовался в этих исследованиях, который является мощным индуктором мезодермальных предшественников Flk1 и Flk1+. 46  Кроме того, как в HSC 14  , так и в зрелом эндотелии сосудов мыши 15  важность аутокринной передачи сигналов Vegf важна для выживания клеток посредством сигнальных путей, отличных от тех, которые вызываются неклеточной автономной паракринной стимуляцией Vegf. Здесь мы предполагаем, что в пределах эритроидного клона аутокринный Vegf строго контролируется и может служить для точной настройки развития эритроидных клеток посредством изменений уровней Gata1 и генов-мишеней Gata1 (Рис. 7).Это может вызывать другие реакции в развитии эритроидного ряда, чем экзогенно добавленные или паракринные Vegf.

Кроме того, наши исследования показывают, что повышенный уровень Vegf, исходящий от эритроидных предшественников, приводит к незначительным, но значимым изменениям экспрессии экспрессии Ihh/PTCH во время примитивного эритропоэза на ст. E8.5, задержке созревания сосудов при развивающемся YS и значительным изменениям сердечно-сосудистого развития. на Е10.5. У спасенных эмбрионов +VEGF164/hGATA2 Eryth экспрессия Ihh/Ptch нормализовалась на ст. E8.5, но пороки развития сердца все еще наблюдались на ст. E11.5, хотя и не столь драматично у эмбрионов +VEGF164 Eyrth . Это говорит о том, что восстановленный эритропоэз и/или нормализованная экспрессия Ihh/Ptch в среде YS у эмбрионов +VEGF164/hGata2 Eryth могут частично улучшить этот вторичный дефект на E10.5 и E11.5 (рис. 1Е и дополнительная рис. 5). Сердечно-сосудистые дефекты и сроки летальности на E12.5, связанные с умеренной гиперэкспрессией erythroid Vegf во время развития, согласуются с предыдущими данными, показывающими, что умеренное 2-3-кратное увеличение уровней Vegf у гиперморфных эмбрионов может приводить к сердечно-сосудистым дефектам, сходным с описанными здесь. 3,4,17  Кроме того, мы показали, что уровни Bmp4 значительно снижены в сердцах VEGF164 Eryth и +VEGF164/hGATA2 Eryth и могут способствовать возникновению кардиальной подушки, перегородки и наблюдаемых дефектов миокарда в этом исследовании. 42  В целом, эти данные свидетельствуют о том, что модуляция уровней Vegf специфически в эритроидном ростке может косвенно модулировать окружающую среду тканеспецифическим образом, и эти изменения могут косвенно вносить синергетический вклад в наблюдаемые аутокринные дефекты экспрессии Gata1 и его мишеней, что приводит к дефекты эритропоэза, наблюдаемые в этом исследовании (рис. 7).

Таким образом, мы продемонстрировали, что измененные уровни аутокринного Vegf могут влиять на дифференцировку эритроцитов посредством модуляции экспрессии ключевого гемопоэтического транскрипционного фактора Gata1.Дополнительные исследования потребуются для дальнейшего определения функциональной роли Vegf в его способности модулировать уровни Gata1 и их влияния на физиологический эритропоэз у взрослых, а также изменений, наблюдаемых во время противоопухолевой терапии против Vegf.

Электронная версия этой статьи содержит дополнение данных.

Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет платы за страницу.Поэтому и исключительно для того, чтобы указать на этот факт, эта статья настоящим помечена как «реклама» в соответствии с разделом 1734 18 USC.

Трехмерная модель эритропоэза in vitro воспроизводит эритроидную недостаточность при миелодиспластических синдромах

  • Hattangadi SM, Wong P, Zhang L, Flygare J, Lodish HF. От стволовых клеток к эритроцитам: регуляция эритропоэза на нескольких уровнях с помощью множества белков, РНК и модификаций хроматина. Кровь. 2011; 118:6258–68.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Palis J. Примитивный и дефинитивный эритропоэз у млекопитающих. Фронт Физиол. 2014;5:1–9.

    Google ученый

  • An X, Mohandas N. Эритробластные островки, терминальная эритроидная дифференцировка и созревание ретикулоцитов. Int J Гематол. 2011;93:139–43.

    ПабМед Google ученый

  • Корольнек Т., Хамза И.Макрофаги и транспортировка железа при рождении и гибели эритроцитов. Кровь. 2015;125:2893–7.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бессис М. Эритробластический островок, функциональное единство костного мозга. Преподобный Гематол. 1958; 13:8–11.

    КАС пабмед Google ученый

  • Platzbecker U, Hofbauerb LC, Ehningera G, Höliga K. Клинические, качественные и экономические последствия хронической анемии и трансфузионной поддержки у пациентов с миелодиспластическими синдромами.Лейк Рез. 2012; 36: 525–36.

    ПабМед Google ученый

  • Malcovati L, Papaemmanuil E, Bowen DT, Boultwood J, Della Porta MG, Pascutto C, et al. Клиническое значение мутаций SF3B1 при миелодиспластических синдромах и миелодиспластических/миелопролиферативных новообразованиях. Кровь. 2011; 118:6239–46.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Папаэммануил Э., Каззола М., Боултвуд Дж., Малковати Л., Вьяс П., Боуэн Д. и другие.Соматическая мутация SF3B1 при миелодисплазии с кольцевыми сидеробластами. New Engl J Med. 2011; 365:1384–95.

    КАС пабмед Google ученый

  • Йошида К., Санада М., Сираиси Ю., Новак Д., Нагата Ю., Ямамото Р. и др. Частые мутации механизма сплайсинга при миелодисплазии. Природа. 2011; 478: 64–9.

    КАС Google ученый

  • Арбер А., Орази А., Хассерджян Р., Тиле Дж., Боровиц М.Дж., Ле Бо М.М. и др.Пересмотренная в 2016 г. классификация миелоидных новообразований и острого лейкоза Всемирной организации здравоохранения. Кровь. 2016;127:2391–405.

    КАС Google ученый

  • Конте С., Катаяма С., Вестерлунд Л., Карими М., Димитриу М., Янссон М. и др. Аберрантный сплайсинг генов, участвующих в синтезе гемоглобина, и нарушение терминального созревания эритроидов при рефрактерной анемии с мутацией SF3B1 с кольцевыми сидеробластами. Br J Гематол . 2015;171:478–90.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Муфтий Г.Дж., Беннетт Дж.М., Гоасген Дж., Бейн Б.Дж., Бауманн И., Брюннинг Р. и др. Диагностика и классификация миелодиспластического синдрома: консенсусные предложения Международной рабочей группы по морфологии миелодиспластического синдрома (IWGM-MDS) по определению и подсчету миелобластов и кольцевых сидеробластов. Гематология. 2008;93:1712–7.

    ПабМед Google ученый

  • Patnaik MM, Hanson CA, Sulai NH, Hodnefield JM, Knudson RA, Ketterling RP, et al.Прогностическое значение процента кольцевых сидеробластов при миелодиспластических синдромах, определенных Всемирной организацией здравоохранения, без избытка бластов. Кровь. 2012;119:5674–7.

    КАС пабмед Google ученый

  • Каццола М., Инверницци Р., Бергамаски Г., Леви С., Корси Б., Травальино Э. и др. Экспрессия митохондриального ферритина в эритроидных клетках пациентов с сидеробластной анемией. Кровь. 2003; 101:1996–2000.

    КАС пабмед Google ученый

  • Тегеранчи Р., Фадил Б., Форсблом А.М., Кристенссон Б., Самуэльссон Дж., Животовский Б. и др.Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ингибирует спонтанное высвобождение цитохрома с и митохондриально-зависимый апоптоз гемопоэтических предшественников миелодиспластического синдрома. Кровь. 2003; 101:1080–6.

    КАС пабмед Google ученый

  • Тегеранчи Р., Инверницци Р., Грандьен А., Животовский Б., Фадил Б., Форсблом А.М. и др. Аберрантное распределение митохондриального железа и остановка созревания характеризуют ранние эритроидные предшественники при миелодиспластических синдромах низкого риска.Кровь. 2005; 106: 247–53.

    КАС пабмед Google ученый

  • Мортера-Бланко Т., Димитриу М., Уолл П., Карими М., Элварсдоттир Э., Конте С. и др. Мутации, инициирующие SF3B1, при МДС с кольцевыми сидеробластами нацелены на лимфомиелоидные гемопоэтические стволовые клетки. Кровь. 2017; 130:881–90.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Song Y, Rongvaux A, Taylor A, Jiang T, Tebaldi T, Balasubramanian K, et al.Высокоэффективная и достоверная модель ксенотрансплантации пациентов с МДС для доклинических исследований. Нац коммун. 2019;10:366.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Thanopoulou E, Cashman J, Kakagianne T, Eaves A, Zoumbos N, Eaves C. Приживление мышей NOD/SCID-2 с нулевым микроглобулином с многолинейными опухолевыми клетками от пациентов с миелодиспластическим синдромом. Кровь. 2004; 103:4285–93.

    КАС пабмед Google ученый

  • Nilsson L, Astrand-Grundström I, Anderson K, Arvidsson I, Hokland P, Bryder D, et al.Вовлечение и функциональное нарушение пула гемопоэтических стволовых клеток CD34(+)CD38(-)Thy-1(+) при миелодиспластических синдромах с трисомией 8. Кровь. 2002; 100: 259–67.

    КАС пабмед Google ученый

  • Мупо А., Сейлер М., Сатиасилан В., Панс А., Ян И., Агравал А. и др. Гемопоэтически специфичные мыши с нокаутом Sf3b1-K700E демонстрируют дефект сплайсинга, наблюдаемый при МДС человека, но у них развивается анемия без кольцевых сидеробластов. Лейкемия. 2017;31:720–7.

    КАС пабмед Google ученый

  • Obeng EA, Chappell RJ, Seiler M, Chen MC, Campagna DR, Schmidt PJ, et al. Физиологическая экспрессия Sf3b1K700E вызывает нарушение эритропоэза, аберрантный сплайсинг и чувствительность к терапевтической модуляции сплайсосом. Раковая клетка. 2016;30:404–17.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бланко ТМ, Манталарис А, Бисмарк А, Паноскальцис Н.Разработка трехмерного каркаса для биомимикрии ex vivo острого миелоидного лейкоза человека. Биоматериалы. 2010;31:2243–51.

    КАС пабмед Google ученый

  • Mortera-Blanco T, Mantalaris A, Bismarck A, Aqel N, Panoskaltsis N. Долговременная безцитокиновая экспансия мононуклеарных клеток пуповинной крови в трехмерных каркасах. Биоматериалы. 2011;32:9263–70.

    КАС пабмед Google ученый

  • Claessens Y-E, Bouscary D, Dupont M-J, Picard F, Melle J, Gisselbrecht S, et al.In vitro пролиферация и дифференцировка эритроидных предшественников у пациентов с миелодиспластическими синдромами: свидетельство Fas-зависимого апоптоза. Кровь. 2002; 99: 1594–601.

    КАС пабмед Google ученый

  • Freyssinier JM, Lecoq-Lafon C, Amsellem S, Picard F, Ducrocq R, Mayeux P, et al. Очистка, амплификация и характеристика популяции эритроидных предшественников человека. Бр Дж Гематол. 1999; 106: 912–22.

    КАС пабмед Google ученый

  • Никпур М., Шаренберг С., Лю А., Конте С., Карими М., Мортера-Бланко Т. и др. Транспортер ABCB7 является медиатором фенотипа приобретенной рефрактерной анемии с кольцевыми сидеробластами. Лейкемия. 2013;27:889–96.

    КАС пабмед Google ученый

  • Бирнс С., Терри Ли И., Мейер Э.Р., Рабель А., Сакс Д.Б., Миллер Д.Л.Дозозависимая дифференцировка железа и энуклеация эритробластов человека в бессывороточной среде. J Tissue Eng Regen Med. 2013;10:E84–89.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Понка П., Шефтель А. Метаболизм эритроидного железа. В кн.: Физиология и патофизиология железа у человека, питание и здоровье. Человеческая пресса; 2012. с. 191–209.

  • Safinia L, Datanb N, Höhseb M, Mantalarisa A, Bismarcka A. К методологии эффективной модификации поверхности пористых полимерных каркасов.Биоматериалы. 2005; 26:7537–47.

    КАС пабмед Google ученый

  • Мальковати Л., Карими М., Папаеммануил Э., Амбаглио И., Ядерстен М., Янссон М. и др. Мутация SF3B1 идентифицирует отдельную подгруппу миелодиспластического синдрома с кольцевыми сидеробластами. Кровь. 2015;126:233–41.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Файтова М., Коварикова А., Петер Швец П., Канкури Э., Седлак Дж.Иммунофенотипический профиль ядерных эритроидных предшественников при созревании в регенерирующем костном мозге. Лейк-лимфома. 2013;54:2523–30.

    КАС пабмед Google ученый

  • Ji P, Jayapal SR, Lodish HF. Для энуклеации культивируемых эритробластов плода мыши требуются Rac GTPases и mDia2. Nat Cell Biol. 2008; 10: 314–21.

    КАС пабмед Google ученый

  • Кори А.Х., Оуэн Т.С., Барлтроп Дж.А., Кори Дж.Г.Использование водорастворимого тетразолия/формазана для анализа роста клеток в культуре. Раковая коммуна. 1991; 3: 207–212.

    КАС пабмед Google ученый

  • Buesche G, Teoman H, Giagounidis A, Göhring G, Schlegelberger B, Ganser A, et al. Нарушение образования эритробластных островков связано с эритроидной недостаточностью и неблагоприятным прогнозом у значительной части больных с миелодиспластическими синдромами. Гематология.2016; 101:e177–81.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хан И, Чжан Г, Ван Х, Фу Р, Син Л, Ли Л и др. GDF11 повышен у пациентов с миелодиспластическим синдромом. Int J Clin Exp Pathol. 2016;9:6031–8.

    КАС Google ученый

  • Zhou L, McMahon C, Bhagat T, Alencar C, Yu Y, Fazzari M, et al. Снижение SMAD7 приводит к гиперактивации передачи сигналов TGF-b при МДС, которая может быть обращена вспять с помощью специфического ингибитора киназы рецептора I TGF-b.Рак Рез. 2011;71:955–63.

    КАС пабмед Google ученый

  • Zhou L, Nguyen AN, Sohal D, Ma JY, Pahanish P, Krishna Gundabolu K, et al. Ингибирование киназы TGF-рецептора I способствует гемопоэзу при МДС. Кровь. 2008; 112:3434–43.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Зермати Ю., Фихельсон С., Валенси Ф., Фрейсинье Ж.М., Руйе-Фессард П., Крамер Э. и др.Трансформирующий фактор роста ингибирует эритропоэз, блокируя пролиферацию и ускоряя дифференцировку эритроидных предшественников. эксп Гематол. 2000; 28:885–94.

    КАС пабмед Google ученый

  • Кристал Г., Лейн В., Драговска В., Такахаши С., Аппель Дж., Гонтье А. и др. Трансформирующий фактор роста β1 является индуктором эритроидной дифференцировки. J Эксперт Мед. 1994; 180:851–60.

    КАС пабмед Google ученый

  • Хино М., Тодзё А., Миядзоно К., Урабе А., Такаку Ф.Влияние трансформирующих факторов роста типа β на гемопоэтические клетки-предшественники. Бр Дж Гематол. 1988; 70: 143–147.

    КАС пабмед Google ученый

  • Suragani RN, Cadena SM, Cawley SM, Sako D, Mitchell D, Li R, et al. Трансформирующий лиганд-ловушка суперсемейства фактора роста ACE-536 корректирует анемию, стимулируя эритропоэз на поздних стадиях. Нат Мед. 2014;20:408–14.

    КАС пабмед Google ученый

  • Ван К., Удупа В.К., Липшиц Д.А.Данные, свидетельствующие о стимулирующей роли интерлейкина-10 в эритропоэзе in vitro. J Cell Physiol. 1996; 166: 305–10.

    КАС пабмед Google ученый

  • Johnson CS, Keckler DJ, Topper MI, Braunschweiger PG, Furmansk P. Гематопоэтические эффекты рекомбинантного интерлейкина-la у мышей in vivo: стимуляция гранулоцитарных, моноцитарных, мегакариоцитарных и ранних эритроидных клеток-предшественников, подавление поздней стадии эритропоэза , и устранение эритроидной супрессии с помощью эритропоэтина.Кровь. 1989; 73: 678–83.

    КАС пабмед Google ученый

  • Ривелла С. Неэффективный эритропоэз и талассемии. Карр Опин Гематол. 2009; 16: 187–94.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Dussiot M, Maciel TT, Fricot A, Chartier C, Negre O, Veiga J, et al. Лиганд-ловушка рецептора активина IIA корректирует неэффективный эритропоэз при бета-талассемии.Нат Мед. 2014;20:398–407.

    КАС пабмед Google ученый

  • Medyouf H, Mossner M, Jann JC, Nolte F, Raffel S, Herrmann C, et al. Миелодиспластические клетки у пациентов перепрограммируют мезенхимальные стромальные клетки, чтобы создать нишу трансплантируемых стволовых клеток. Клеточная стволовая клетка. 2014; 14:824–37.

    КАС пабмед Google ученый

  • Лазар-Карстен П., Дорн И., Мейер Г., Линднер У., Дриллер Б., Шленке П.Влияние белков внеклеточного матрикса и мезенхимальных стволовых клеток на созревание эритропоэтических клеток. Вокс Санг. 2011;101:65–76.

    КАС пабмед Google ученый

  • Iancu-Rubina C, Mosoyana G, Wanga J, Krausb T, Sungc V, Hoffmana R. Опосредованное стромальными клетками ингибирование эритропоэза может быть ослаблено с помощью Sotatercept (ACE-011), ловушки лиганда рецептора активина типа II. эксп Гематол. 2013;41:155–66.

    Google ученый

  • Гриффит Л.Г., Шварц М.А.Захват сложной трехмерной физиологии тканей in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006; 7: 211–24.

    КАС пабмед Google ученый

  • Северн К.Э., Маседо Х., Игл М.Дж., Руни П., Манталарис А., Той А.М. Полиуретановые каркасы, засеянные клетками CD34+, поддерживают ранние стволовые клетки, а также способствуют длительному выходу гемопоэтических клеток-предшественников. Научный доклад 2016; 6: 1–12.

    Google ученый

  • Идентификация стадий дифференцировки эритроидов в костном мозге и субпопуляциях эритроцитов в кровообращении, которые преимущественно теряются при аутоиммунной гемолитической анемии у мышей

    Abstract

    Повторные еженедельные инъекции крысиных эритроцитов вызывали аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА) у мышей C57BL/6 через 5–6 недель.С помощью метода двойного биотинилирования in vivo (DIB), недавно разработанного в нашей лаборатории, отслеживали оборот когорт эритроцитов разных возрастных групп во время АИГА. Результаты свидетельствуют о значительном снижении доли ретикулоцитов, молодых и средних возрастных групп эритроцитов, но достоверном увеличении доли старых эритроцитов в кровообращении. Связывание аутоантител было относительно выше для молодых эритроцитов, и в этих клетках также наблюдались более высокие уровни внутриклеточных активных форм кислорода (АФК).Эритропоэтическую активность в костном мозге и селезенке мышей, индуцированных АИГА, исследовали путем наблюдения за относительной долей эритроидных клеток на разных стадиях дифференцировки в этих органах. Клетки на разных стадиях дифференцировки подсчитывали проточной цитометрией путем двойного окрашивания моноклональными антителами против Ter119 и против рецептора трансферрина (CD71). Эритроидные клетки в костном мозге значительно снизились у мышей, индуцированных АИГА, причем больше всего пострадал эритробласт C (снижение на 50%).Эритробласт C также регистрировал высокий уровень внутриклеточных АФК наряду с повышенным уровнем мембраносвязанных аутоантител. В селезенке такого снижения не наблюдалось. Предложена модель АИГА, указывающая на то, что связывание аутоантител может быть недостаточным условием для разрушения эритроидных клеток в костном мозге и в кровотоке. Последняя стадия эритропоэтической дифференцировки в костном мозге и ранние стадии эритроцитов в кровотоке особенно подвержены удалению при АИГА.

    Образец цитирования: Чаттерджи С., Бхардвадж Н., Саксена Р.К. (2016)Идентификация стадий дифференцировки эритроидов в костном мозге и субпопуляциях эритроцитов в кровообращении, которые преимущественно теряются при аутоиммунной гемолитической анемии у мышей. ПЛОС ОДИН 11(11): e0166878. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878

    Редактор: Нупур Гангопадхьяй, CCAC, США

    Получено: 20 мая 2016 г.; Принято: 4 ноября 2016 г .; Опубликовано: 21 ноября 2016 г.

    Авторские права: © 2016 Chatterjee et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

    Финансирование: Работа финансировалась за счет двух исследовательских грантов Департамента науки и технологий по гранту №.SR/SO/HS-0261/2012 к РКС. SC получил стипендию старшего научного сотрудника Совета по научным и промышленным исследованиям (CSIR), Нью-Дели.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Аутоиммунная гемолитическая анемия (АИГА) — одно из первых выявленных аутоиммунных заболеваний человека [1], характеризующееся продукцией аутореактивных аутоантител против эритроцитов, что может привести к быстрому и глубокому снижению количества эритроцитов и концентрации гемоглобина в крови [2–5].Патогенез АИГА включает два основных механизма: , а именно , эритрофагоцитоз эритроцитов, покрытых аутоантителами, макрофагами в ретикуло-эндотелиальной системе печени и селезенки [6,7] и опосредованный комплементом лизис эритроцитов после связывания аутоантител IgM [8]. . АИГА широко изучалась в основном для понимания ее патогенеза, клинических особенностей и прогноза [3,6,9,10]. Однако модуляция эритропоэтического гомеостаза и картина оборота циркулирующих эритроцитов плохо изучены.Также неизвестно, влияет ли возраст эритроцитов в кровотоке на их восприимчивость к элиминации у мышей с АИГА.

    Эритроидная линия дифференцировки в костном мозге и селезенке начинается с ранних проэритробластов-предшественников, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток. Проэритробласты далее дифференцируются на последовательных стадиях , а именно эритробластов A, B и C [11,12]. Эти четыре стадии эритроидной дифференцировки в костном мозге и селезенке можно перечислить с помощью проточного цитометрического анализа клеток костного мозга и селезенки, окрашенных антителами Ter-119 и CD71.Эритроидные клетки выделяются из костного мозга и селезенки в виде ретикулоцитов, которые быстро (в течение 1–2 дней) дифференцируются в зрелые эритроциты крови [11,12]. Средний период полураспада эритроцитов крови у мышей составляет около 60 дней. Было трудно подсчитать и изучить в какой-либо момент времени доли эритроцитов различных возрастных групп в кровообращении. Однако недавно разработанная в нашей лаборатории новая методика двойного биотинилирования in vivo (методика ДИБ) эритроцитов позволила одновременно подсчитывать и изучать в кровотоке эритроциты разных возрастных групп [13–19].Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить полный жизненный цикл эритроидных клеток, включая различные стадии дифференцировки в костном мозге и селезенке, а также эритроциты разных возрастных групп в кровообращении, чтобы определить стадии, которые преимущественно разрушаются при аутоиммунной гемолитической анемии. . Для достижения поставленной цели были изучены изменения, происходящие у мышей с АИГА в (а) относительном соотношении клеток на разных стадиях эритроидной дифференцировки в костном мозге и селезенке, а также относительном соотношении ретикулоцитов и эритроцитов разных возрастных групп. в кровообращении и (б) связывание аутоантител и образование активных форм кислорода (АФК) в клетках на разных стадиях эритроидного жизненного цикла в костном мозге, селезенке и крови.Наши результаты показывают, что в то время как аутоантитела связываются с клетками на всех стадиях эритропоэза в костном мозге и селезенке, а также с циркулирующими зрелыми эритроцитами, снижение относительной пропорции было ограничено только поздними стадиями эритроидной дифференцировки в костном мозге и более молодыми эритроцитами в кровообращении, что позволяет предположить, что эти эритроидные популяции могут преимущественно исчезать при АИГА.

    Материалы и методы

    Животные

    Инбредные самцы мышей C57BL/6 (возраст 8–12 недель, масса тела 20–25 г) и самки крыс Wistar (возраст 2 месяца, масса тела 250–300 г) использовались на протяжении всего исследования.Животных разводили и содержали в безмикробной среде в помещении для животных в Университете Джавахарлала Неру (JNU), Нью-Дели, или получали из Национального института питания (NIN), Хайдарабад. Животных помещали в блоки с кондиционированием воздуха с положительным давлением (25°C, относительная влажность 50%) и содержали при 12-часовом цикле свет/темнота. Вода и корм для мышей предоставлялись вволю . Все экспериментальные протоколы проводились в строгом соответствии со Стандартными операционными процедурами (СОП) для Институционального комитета по этике животных (IAEC) CPCSEA (Комитет с целью контроля и надзора за экспериментами на животных), Министерства окружающей среды, лесов и климата. Изменение, правительство Индии (http://www.moef.nic.in/sites/default/files/SOP_CPCSEA_inner_page%20%281%29.pdf). Исследование было должным образом одобрено Институциональным комитетом по этике животных Университета Джавахарлала Неру (код утвержденного проекта IAEC: 35/2012). Все мыши были случайным образом распределены по экспериментальным группам. Эксперименты были спланированы таким образом, чтобы использовать минимальное количество мышей.

    Для анализа эритроцитов крови еженедельно брали 20–25 мкл крови из хвостовой вены в указанные моменты времени. Для получения клеток костного мозга и селезенки мышей подвергали эвтаназии путем удушения CO 2 перед извлечением органов.

    Реагенты и другие расходные материалы

    Biotin-X-NHS (эфир N-гидроксисукцинимида биотина) был получен от Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Стрептавидин-аллофикоцианин (SAv-APC), крысиные антимышиные Ter-119-APC, крысиные антимышиные CD71-фикоэритрин (PE), крысиные антимышиные CD71-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) моноклональные антитела, антимышиные CD16/CD32 очищенные поликлональные антитела козы против мышиных IgG/IgM-FITC и рекомбинантные белки аннексина V-PE и аннексина V-FITC были приобретены у BD Biosciences (Сан-Диего, Калифорния, США) или у Affymetrix eBioscience (Сан-Диего, Калифорния, США). ).Коза F(ab’) 2 поликлональные антитела против мышиного IgG-PE, крысиные IgG1κ-PE, крысиные IgG1κ-FITC, крысиные IgG2aκ-PE и крысиные IgG2bκ-APC изотипические контроли и 7-аминоактиномицин D (7AAD) были закуплены от Affymetrix eBioscience (Сан-Диего, Калифорния, США). 5 (и 6)-хлорметил-2,7-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (CM-H 2 DCFDA) был приобретен у Molecular Probes (Юджин, Орегон, США). Фетальную бычью сыворотку (FBS) получали от Hyclone (Южный Логан, Юта, США). RPMI был получен от Sigma-Aldrich (St.Луис, Миссури, США). HEPES, диметилформамид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и другие аналитические реагенты были получены от Sigma-Aldrich (Индия). Монтажная среда Fluoromount G была приобретена у G Biosciences (Сент-Луис, Миссури, США). Все остальные химикаты были закуплены на месте и имели аналитическую чистоту.

    Индукция аутоиммунной гемолитической анемии у мышей

    Экспериментальную аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА) индуцировали у мышей в соответствии с моделью Playfair и Clarke с повторными инъекциями крысиных эритроцитов [20–23].Эритроциты крысы, полученные из хвостовой вены, промывали 3 раза в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) и доводили до концентрации 1×10 9 клеток/мл. Мышам еженедельно вводили 2×10 8 крысиных эритроцитов внутрибрюшинно. Образцы крови (20–25 мкл) мышей собирали в PBS, содержащем 5 мМ ЭДТА, в разные моменты времени из хвостовой вены. Количество эритроцитов и уровень гемоглобина оценивали с помощью электронного гематологического счетчика частиц (MS4Se, Melet Schloesing Laboratories, Chaussée Jules César, Осни, Франция).Связанные с мембраной аутоантитела выявляли путем окрашивания эритроцитов анти-мышиным IgG/IgM-FITC или F(ab’) 2 -анти-мышиным IgG-PE с последующей проточной цитометрией [24,25].

    Двойной

    Метод биотинилирования in vivo (DIB)

    Двойное биотинилирование (DIB) эритроцитов in vivo проводили, как описано ранее [13–19]. Техника DIB включает два этапа биотинилирования циркулирующих эритроцитов внутривенно ( i , v .) введение сложного эфира биотина-X-NHS (BXN) через хвостовую вену мышей. На первом этапе высокоинтенсивного биотинилирования in vivo три раза в день i . против . вводили инъекции биотина (1 мг BXN, растворенного в 20 мкл ДМФА и 250 мкл PBS), а затем через 30 дней проводили низкоинтенсивное биотинилирование однократной более низкой дозой (0,6 мг BXN, растворенного в 12 мкл DMF и 250 мкл). мкл PBS). Это низкоинтенсивное биотинилирование маркирует свежие эритроциты, которые были выпущены в кровоток в течение 30-дневного периода после первого этапа биотинилирования.В любой момент времени после второго этапа биотинилирования интенсивность биотина на циркулирующих эритроцитах можно было проанализировать с помощью проточной цитометрии с использованием стрептавидина, связанного с соответствующим флуорохромом, как описано ранее [13–15]. Биотин отрицательные эритроцитов в циркуляции будут представлять свежие и самые молодые эритроциты, высвобождаемые в кровь после второй стадии биотинилирования. Биотин low эритроцитов будет представлять когорту эритроцитов, высвобождаемых в кровоток между первой и второй стадиями биотинилирования, а биотин high эритроцитов будет представлять популяцию старых остаточных эритроцитов, которые присутствовали в крови во время первой стадии биотинилирования. 18].График биотинилирования устанавливался таким образом, чтобы в предполагаемое время анализа (т. е. после 5–6 инъекций) циркулирующие эритроциты представляли собой очень молодую когорту биотин- отрицательных эритроцитов (возраст менее 6 или 13 дней, в зависимости от дня умерщвления) и очень старая когорта эритроцитов с высоким содержанием биотина (старше 36 или 43 дней, в зависимости от дня умерщвления) вместе с когортой эритроцитов среднего возраста с низким содержанием биотина . Принцип техники DIB резюмирован на S1 рис.

    Эритроидная дифференцировка в костном мозге и селезенке

    Для получения клеток костного мозга и селезенки мышей подвергали эвтаназии путем удушения CO 2 перед извлечением органов. Клетки костного мозга (BM) вымывали из бедренной и большеберцовой костей с помощью иглы с марлей 25 и ресуспендировали в среде RPMI с 10% FBS. Суспензии одиночных клеток клеток селезенки готовили путем осторожного перемешивания селезенки в небольшом объеме PBS. Клетки селезенки и костного мозга процеживали через мелкое сито, осаждали центрифугированием и ресуспендировали при желаемой концентрации в RPMI с 10% FBS.Для разграничения эритроидных предшественников на разных стадиях дифференцировки свежеприготовленные суспензии одиночных клеток из костного мозга или селезенки сначала инкубировали с моноклональными антителами к CD16/32 (Fc-блок, 1 мкг/10 6 клеток в 50 мкл PBS + 2% FBS) в течение 10 минут с последующим окрашиванием антимышиным CD71-PE/FITC и антимышиным Ter-119-APC в течение 20 минут при 4°C [19, 26–27].

    Измерение внутриклеточных активных форм кислорода (АФК)

    Уровень

    межклеточных активных форм кислорода (АФК) оценивали, как описано ранее [19, 28–30].Вкратце, эритроциты периферической крови и первичные клетки костного мозга и селезенки промывали и ресуспендировали в предварительно нагретом PBS с добавлением 2% FBS и инкубировали с CM-H 2 DCFDA (5(и 6-)-хлорметил-2,7 -дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат) окрашивают (5 мкМ) в темноте в течение 30 минут при 37°С в атмосфере 5% СО 2 на воздухе. Окислительное превращение CM-H 2 DCFDA в его флуоресцентный продукт с помощью АФК сразу измеряли с помощью проточной цитометрии [19, 28, 30].Внутриклеточную генерацию АФК в различных субпопуляциях эритроцитов и клеток-предшественников эритроидного ряда определяли путем гейтирования клеток на основе биотиновой метки и окраски CD71 или Ter119 и окраски CD71 соответственно. В этих закрытых популяциях регистрировали сигналы флуоресценции АФК (MFI).

    Проточный цитометрический анализ

    Кровь мышей собирали в PBS, содержащем 5 мМ ЭДТА, и промывали 3 раза ледяным физиологическим раствором, содержащим буфер HEPES (10 мМ, pH-7,4) и 2% FBS. Меченые биотином эритроциты (1×10 6 ) окрашивали ex vivo стрептавидином-APC и анти-мышиным CD71-PE/FITC в темноте в течение 30 минут для идентификации разных возрастных когорт эритроцитов, как описано ранее [13]. ,18].Для подсчета уровня мембраносвязанных аутоантител в различных субпопуляциях циркулирующих эритроцитов клетки (1×10 6 ) окрашивали совместно с анти-мышиным IgG/IgM-FITC вместе со стрептавидином-APC и анти-мышиным CD71-PE. . Для определения других маркеров эти меченные DIB эритроциты окрашивали соответствующими антителами/красителями и оценивали их соответствующую экспрессию в субпопуляциях эритроцитов путем гейтирования клеток на основе биотиновой метки и окрашивания CD71.

    Для подсчета эритроидных клеток на разных стадиях дифференцировки в КМ и селезенке использовали методику двойного окрашивания анти-мышиным CD71 и анти-мышиным Ter119, как описано ранее [19,26,27].Кратковременно приготовленные суспензии одиночных клеток (1×10 6 ) из костного мозга или селезенки инкубировали с антителом против CD16/CD32 мыши (Fc-блок, 1 мкг/10 6 клеток в 50 мкл PBS + 2% FBS) в течение 10 мин с последующим окрашиванием антимышиным CD71-PE и антимышиным Ter-119-APC в течение 20 мин в темноте при 4°С. Для определения других маркеров эти эритроидные клетки окрашивали соответствующими антителами/красителями и оценивали их соответствующую экспрессию в эритроидных предшественниках путем гейтирования клеток на основе окрашивания CD71 и Ter119.Для выявления аутоантител, связанных с эритроидными клетками, для блокирования использовали крысиную сыворотку вместо мышиной сыворотки, и клетки окрашивали F(ab’) 2 против мышиных IgG-PE вместе с антимышиными CD71-FITC и антимышиными Тер-119-АПК в течение 20 мин в темноте при 4°С.

    Все окрашенные клетки промывали и сразу же анализировали на проточном цитометре. Для всего проточного цитометрического анализа 7AAD использовали в качестве красителя жизнеспособности, а иммунофенотипирование проводили на живых клетках 7AAD -ve с гейтом.Для эритроцитов было зарегистрировано не менее 10 000 событий, а для анализа эритроидных субпопуляций в КМ и селезенке – 50 000 событий. Все проточные цитометрические анализы выполнялись на проточном цитометре BD FACSCalibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США) с использованием программного обеспечения Cell Quest или на проточном цитометре BD FACSVerse (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США) с использованием программного обеспечения FACSuite. для приобретения и анализа.

    Флуоресцентная микроскопия

    Кровь мышей собирали в PBS, содержащем 5 мМ ЭДТА, и промывали 3 раза ледяным физиологическим раствором, содержащим буфер HEPES (10 мМ, pH-7.4) и 2% ФБС. Свежевыделенные эритроциты окрашивали моноклональными антителами козы F(ab’) 2 против IgG-PE мыши в темноте в течение 30 мин и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в PBS, содержащем 1 мМ EGTA и 2,5 мМ MgCl 2 для 30 мин при комнатной температуре. Фиксированные эритроциты наслаивали на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином (PLL), и оставляли для прилипания на 30 минут в темноте. После инкубации покровные стекла, содержащие эритроциты, промывали в PBS, монтировали на предметные стекла с использованием монтажной среды (Fluoromount) и хранили при 4°C в темноте до анализа.Изображения собирали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FLUOVIEW FV1000 с использованием программного обеспечения Olympus FLUOVIEW (Ver.1.7a).

    Статистический анализ

    Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента и ANOVA проводили с использованием программного обеспечения SigmaPlot. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Уровень p <0,05 был принят как статистически значимый.

    Результаты

    Индукция аутоиммунной гемолитической анемии у мышей

    АИГА индуцировали у мышей путем многократного введения крысиных эритроцитов.Мышам вводили ( i . p ) крысиные эритроциты еженедельно и контролировали количество эритроцитов в крови и уровни гемоглобина у контрольных мышей и мышей, получавших крысиные эритроциты (REA). В каждый момент времени среднее количество эритроцитов в крови у контрольных мышей принимали за сто и определяли относительные изменения количества эритроцитов в крови у мышей REA. Результаты, представленные на фиг. 1, панели А и В, показывают, что у мышей REA после 5-недельного введения крысиных эритроцитов наблюдалась значительная анемия.Снижение количества эритроцитов в крови на 10% (p<0,001) было отмечено через 5 и 6 недель (рис. 1, панель А). Точно так же значительное снижение уровня гемоглобина в крови было отмечено у мышей REA после 5-недельного введения крысиных эритроцитов, снижение составило около 15% (p = 0,013) через 6 недель (рис. 1, панель B). Присутствие связанных с эритроцитами аутоантител на эритроцитах крови у мышей REA выявляли путем окрашивания эритроцитов, полученных из крови, поликлональными антителами против Ig мыши, конъюгированными с FITC, с последующим проточным цитометрическим анализом (рис. S2).Резкое увеличение (до 40%, p<0,001) средней интенсивности флуоресценции (MFI) связанного аутоантитела наблюдалось в эритроцитах мышей REA через 5 и 6 недель (рис. 1, панель C).

    Рис. 1. Индукция аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) у мышей.

    Мышам вводили еженедельно 2×10 8 крысиных эритроцитов внутрибрюшинно. Образцы крови от контрольных мышей и мышей, которым вводили крысиные эритроциты (REA), собирали в разные моменты времени и анализировали на автоматическом счетчике клеток.Относительные изменения количества эритроцитов и содержания гемоглобина у мышей REA за период 6 недель представлены на панелях А и В соответственно ( p = 0,001 для эритроцитов и p = 0,013 для гемоглобина после 5–6 инъекций, АНОВА). Наличие аутоантител против мышиных эритроцитов оценивали путем окрашивания эритроцитов антимышиным IgG/IgM-FITC после проточной цитометрии. Относительное связывание аутоантител (MFI) с эритроцитами за период 4 недели, с 3 rd до 6 th нед, ( p< 0.001, ANOVA) представлен на панели C. Каждая точка на графике представляет собой среднее ± SEM наблюдений. n = 10 контрольных и 15 мышей REA. * p <0,05, ** p <0,01 и **** p <0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g001

    Наличие мембраносвязанных аутоантител на эритроцитах мышей REA было дополнительно подтверждено с помощью флуоресцентной микроскопии. Эритроциты мышей REA окрашивали поликлональными антителами F(ab’) 2 против IgG-PE мыши и визуализировали на флуоресцентном микроскопе.Эритроциты мышей REA ясно показывают присутствие мембраносвязанных аутоантител, меченных PE-конъюгированными вторичными антителами (флюоресцентные изображения, рис. 2, верхняя панель, ДИК-наложение, рис. 2, нижняя панель).

    Рис. 2. Флуоресцентное изображение эритроцитов, показывающее наличие мембраносвязанных аутоантител.

    Мышам еженедельно вводили 2×10 8 крысиных эритроцитов внутрибрюшинно в течение 5 недель. Образцы крови мышей в контрольной и РЭА группах собирали после 5 инъекций.Наличие мембраносвязанных аутоантител в эритроцитах, выделенных от мышей REA, было подтверждено с помощью флуоресцентной микроскопии после окрашивания эритроцитов F(ab’) 2 против IgG-PE мыши. На панели А показаны изображения эритроцитов контрольной группы, а на панели В — те же, что и у мышей REA. Верхние панели отображают флуоресцентные изображения, а нижние панели — наложение ДИК (увеличение 100X).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g002

    Оборот эритроцитов у мышей с АИГА

    Чтобы оценить, было ли снижение количества эритроцитов в крови у мышей с АИГА связано с равномерной потерей эритроцитов во всех возрастных группах, или же при АИГА преимущественно терялись более молодые или старые эритроциты, использовали метод мечения эритроцитов DIB [13,18]. (концепция поясняется на рис. S1).Экспериментальный протокол, показывающий график введения эритроцитов крысы вместе с этапами биотинилирования и временными точками для сбора образцов крови, показан на рис. 3, панель А. График двух этапов биотинилирования был спланирован таким образом, чтобы во время анализа ( . e ., после начала АИГА в результате 5-недельных i . p . инъекций крысиных эритроцитов), три отдельные подгруппы очень молодых биотинов отрицательные (<6 дней), промежуточные возрастные эритроциты (биотин low от 6 до 36 дней) и очень старые биотин high (>36 дней) эритроциты.Группа молодых эритроцитов может быть далее подразделена на ретикулоциты и молодые эритроциты на основе окрашивания антителом к ​​CD71. Эритроциты, выделенные из периферической крови, были окрашены ex vivo стрептавидином-APC и анти-мышиным CD71-PE, и доли биотина высокие , биотина низкие , CD71 ˗ биотина отрицательные и CD71 9000 биотин отрицательные популяции определяли с помощью проточной цитометрии. На панелях B и C на фиг. 3 показаны репрезентативные результаты относительных долей ретикулоцитов, биотин отрицательный , биотин низкий и биотин высокий популяций эритроцитов у контрольной и индуцированной АИГА мышей соответственно.По сравнению с контролем в этих репрезентативных результатах наблюдалась относительно более низкая доля биотин--негативных -х (молодых) эритроцитов и высокая доля биотин--высоких -х (старых) эритроцитов у мышей, индуцированных АИГА.

    Рис. 3. Оборот эритроцитов в крови контрольных и индуцированных АИГА мышей.

    Мышиные эритроциты метили биотином in vivo с помощью двухэтапной процедуры биотинилирования. Мышам с меткой DIB вводили внутрибрюшинно 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель для индукции АИГА.Протокол эксперимента представлен на панели A. Образцы крови были собраны у контрольных и индуцированных АИГА мышей через 3 дня после инъекций 5 th и 6 th (6 и 13 дней после этапа биотинилирования 2 nd ). Эритроциты окрашивали ex vivo стрептавидином-APC и анти-мышиным CD71-PE и определяли пропорции разных возрастных когорт. Репрезентативные гистограммы потока, показывающие соотношение различных возрастных групп эритроцитов после 5 доз инъекций, показаны на панелях B (контроль) и C (индуцированные АИГА).Профиль оборота ретикулоцитов (панель D; p = 0,02, ANOVA), биотин отрицательный молодых эритроцитов (панель E; p = 0,046, ANOVA), биотин низкий промежуточная возрастная группа эритроцитов (панель F; ) p = 0,010, ANOVA) и биотин high старых эритроцитов (панели G; p <0,001, ANOVA) у контрольных и индуцированных АИГА мышей. Каждая полоса на графике представляет среднее ± SEM наблюдений. n = 8 контрольных и 12 мышей, индуцированных АИГА.* p < 0,05, ** p < 0,01 и *** p < 0,005 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g003

    Объединенные данные по доле эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови от 8 контрольных и 12 мышей, индуцированных АИГА, представлены на рис. 3, панели ДГ. Эти результаты указывают на значительное снижение доли ретикулоцитов и более молодых эритроцитов у мышей после 6-недельных инъекций крысиных эритроцитов (рис. 3, панели D-E).Промежуточная возрастная группа эритроцитов (биотин low эритроцитов, попадающих в кровоток в течение 30 дней между первым и вторым этапами биотинилирования) также следует той же схеме, что и молодые биотин негативные эритроциты (рис. 3, панель F). ). Однако более старая популяция эритроцитов (биотин высокий ) показала значительное увеличение у мышей, индуцированных АИГА (рис. 3, панель G). Доля молодых (<6 дней) и промежуточных (6-36 дней) эритроцитов снизилась с 11.69 ± 0,70% и 69,22 ± 1,91% в контроле до 10,25 ± 0,48 и 56,80 ± 1,46% ( p = 0,010, тест ANOVA) соответственно у мышей, индуцированных АИГА. Доля старых (старше 43 дней) эритроцитов увеличилась в 2 раза с 8,31 ± 1,34 % в контроле до 18,15 ± 1,27 % ( p< 0,001, ANOVA) у мышей с индуцированной АИГА. Эти результаты свидетельствуют о том, что относительно более молодые эритроциты в крови могут преимущественно элиминироваться в условиях АИГА. Снижение доли ретикулоцитов на 16–18% (4.от 39 ± 0,50% в контроле до 3,60 ± 0,20% у мышей после 6 инъекций) может также свидетельствовать о подавленной эритропоэтической активности у мышей, индуцированных АИГА (рис. 3, панель D).

    Уровни мембраносвязанных аутоантител на ретикулоцитах и ​​эритроцитах разного возраста у мышей АИГА

    Уровни мембраносвязанных антиэритроцитарных аутоантител оценивали на эритроцитах разных возрастных групп, а также на ретикулоцитах. Эритроциты мышей, получавших лечение по протоколу DIB, окрашивали стрептавидином-APC и антимышиным CD71-PE для разграничения ретикулоцитов и эритроцитов разных возрастных групп, а также совместно окрашивали поликлональными антителами против мышиных IgG/IgM-FITC для выявления связанных с мембраной клеток. аутоантитела.Популяции ретикулоцитов и эритроцитов разных возрастных групп гейтировали на проточном цитометре на основании графиков зависимости стрептавидина от CD71 и анализировали наличие мембраносвязанных аутоантител во всех этих популяциях. Результаты на рис. 4 показывают значительное увеличение связывания аутоантител во всех возрастных группах эритроцитов, включая ретикулоциты. Связывание анти-мышиных эритроцитарных аутоантител показало значительный рост эритроцитов у мышей АИГА как с точки зрения доли эритроцитов с мембраносвязанными аутоантителами, так и средней интенсивности флуоресценции (MFI) связанных аутоантител.Кроме того, максимальное связывание аутоантител наблюдалось в ретикулоцитах и ​​молодых эритроцитах, а снижение связывания аутоантител наблюдалось в эритроцитах промежуточного и пожилого возраста.

    Рис. 4. Связывание аутоантител в эритроцитах разных возрастных групп.

    Мышам с меткой DIB еженедельно давали i . р . инъекции 2×10 8 крысиных эритроцитов в течение 5–6 недель для индукции АИГА. Образцы крови собирали у контрольных мышей и мышей AIHA через 3 дня после инъекции 5 th и 6 th .Эритроциты окрашивали ex vivo антимышиными IgG-PE, стрептавидином-APC и антимышиным CD71-FITC. Эритроциты разных возрастных групп гейтировали и в каждой из них анализировали уровень аутоантител. Каждое значение представляет среднее ± SEM данных. n = 8 контрольных и 12 мышей АИГА. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005 и **** p <0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента). Тест ANOVA на связывание аутоантител на разных возрастных группах эритроцитов значим ( p = 0.001 по MFI и p = 0,021 по доле эритроцитов с мембраносвязанными аутоантителами).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g004

    Возрастные изменения уровня АФК в эритроцитах мышей с АИГА

    Окислительное повреждение участвует в патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний [31–35]. Поэтому мы исследовали образование АФК в эритроцитах у мышей с экспериментально индуцированной АИГА.Уровни АФК в циркулирующих эритроцитах у контрольных и индуцированных АИГА мышей оценивали окрашиванием CM-H 2 DCFDA [19,28,30]. Результаты указывают на значительное увеличение MFI флуоресценции АФК в популяции эритроцитов цельной крови у мышей, индуцированных АИГА (рис. 5, панели А и В). После 6 инъекций крысиных эритроцитов уровень АФК у мышей, индуцированных АИГА, составил 79,80 ± 5,15 по сравнению с 59,29 ± 3,93 в контроле, что соответствует увеличению в 1,3 раза ( p = 0,010, ANOVA).

    Рис. 5.Генерация активных форм кислорода (АФК) у контрольных и индуцированных АИГА мышей.

    Мышам вводили внутрибрюшинно 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель, чтобы вызвать АИГА. Образцы крови собирали у контрольных мышей и мышей, индуцированных АИГА, через 3 дня после введения 5 и 6 доз инъекции. Эритроциты окрашивали CM-H 2 DCFDA и определяли образование внутриклеточных АФК с помощью проточной цитометрии. Репрезентативные гистограммы, показывающие образование АФК у контрольных и индуцированных АИГА мышей, показаны на панели А, а средний уровень АФК во всей популяции эритроцитов показан на панели В ( p = 0.010, дисперсионный анализ). Эритроциты мыши метили биотином in vivo с помощью двухэтапной процедуры биотинилирования (в соответствии с графиком, приведенным на фиг. 3, панель А). Эритроциты мышей, окрашенных DIB, инкубировали с CM-H 2 DCFDA и окрашивали ex vivo стрептавидином-APC и анти-мышиным CD71-PE. Эритроциты разных возрастных групп (ретикулоциты, биотин отрицательный , биотин низкий и биотин высокий ) гейтировали (как на рис. 3, панели В и С) и в каждой из них анализировали уровень АФК.Уровень АФК в разных возрастных когортах эритроцитов представлен на панелях C-F. Тесты ANOVA для каждой из подгрупп показывают p = 0,741 для ретикулоцитов (панель C), p = 0,009 для биотина отрицательный (панель D), p = 0,022 для биотина низкий (панель E) и p = 0,005 для биотина высокий (панель F). Каждая полоса на графике представляет среднее ± SEM наблюдений. n = 8 контрольных и 12 мышей, индуцированных АИГА. * р <0,05, ** р <0.01 и **** p <0,001 для сравнения групп (t-критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g005

    Генерацию АФК также исследовали отдельно в когортах ретикулоцитов и эритроцитов крови разного возраста (ретикулоциты, биотин отрицательный , биотин низкий и биотин высокий ) у мышей, меченных DIB. Результаты на рис. 5, панели C-F показывают, что, аналогично картине, наблюдаемой для мембраносвязанных аутоантител, образование АФК также было значительно выше во всех возрастных группах эритроцитов, причем эффект был максимальным в более молодых биотин отрицательных эритроцитах.После 6 инъекций генерация АФК в биотин--негативных эритроцитах увеличилась до 111,00 ± 9,85 с 79,00 ± 3,86 в контроле (рис. 5, панель D), т. е. в 1,4 раза, с последующим увеличением на 30% ретикулоцитов, у которых MFI увеличился до 132,44 ± 3,70 от 104,50 ± 4,87 (рис. 5, панель C). Уровень АФК был относительно ниже в промежуточной и пожилой возрастных группах эритроцитов. Эти результаты позволяют предположить, что более молодая субпопуляция эритроцитов может генерировать больше АФК у мышей с АИГА.

    Эритропоэтическая активность у мышей, индуцированных АИГА

    Костный мозг и селезенка, два основных участка эритропоэза у взрослых мышей, исследовали на предмет изменений эритропоэтического паттерна вследствие индукции АИГА.Дифференциальную экспрессию молекул Ter119 и CD71 на поверхности эритроидных клеток в костном мозге и селезенке использовали для определения четырех различных стадий эритроидной дифференцировки: ранние проэритробласты (Ter119 med CD71 high ), ранние базофильные эритробласты (Ter119 high CD71). Высокий FSC Высокий , эритробласт а), поздний базофильный, полихроматический и ортохроматический эритробласт (Ter119 высокий CD71 MED FSC LOD , эритробласт B) и ортохроматические эритробласты с зрелыми эритроцитами (TER119 высокий CD71 FSC low , эритробласт C), как описано в другом месте [19,26,27].Репрезентативные гистограммы потока, показывающие стратегии гейтирования для идентификации различных стадий эритроидной дифференцировки у мышей BM, показаны на рис.

    S3.

    Доля всех эритроидных клеток (положительных по Ter119 клеток) в костном мозге и селезенке контрольных мышей и мышей АИГА показана на рис. 6. Доля эритроидных клеток в костном мозге (процент клеток Ter119 + в препаратах клеток, полученных из костного мозга) показала значительное уменьшение с 30,20% (контрольные мыши) до 19,96% (мыши AIHA), т.е.е. снижение на 33,9%. Это указывало на общее снижение эритропоэтической активности в костном мозге мышей АИГА. Подсчет различных эритроидных субпопуляций в костном мозге показал, что каждая из отдельных стадий эритроидной дифференцировки в костном мозге также снижалась (рис. 7), но только последняя стадия эритроидной дифференцировки (эритробласт С) снижалась больше (48,5%), чем общее уменьшение (36,6%) эритроидного компартмента в костном мозге, что указывает на то, что эритробласт С преимущественно теряется в костном мозге мышей АИГА.В отличие от эритропоэтической активности в костном мозге не наблюдалось уменьшения эритроидного компартмента в селезенке, а также относительных пропорций разных стадий эритроидной дифференцировки в селезенках с АИГА. Противоположные эффекты, наблюдаемые в костном мозге и селезенке, подтверждают концепцию «стрессового эритропоэза» [36,37], когда компенсаторный всплеск эритропоэза в селезенке возникает, когда эритропоэтическая активность костного мозга резко снижается. Можно отметить, что средние суммарные выделения клеток из селезенки и костного мозга мышей контрольной группы и группы АИГА существенно не отличались.Таким образом, изменения, наблюдаемые в относительных пропорциях различных субпопуляций клеток, могут быть достоверным представлением изменений абсолютного числа клеток этих субпопуляций.

    Рис. 6. Общее количество эритроидных клеток у контрольных и индуцированных АИГА мышей.

    Мышам давали и . р . инъекции 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель для индукции АИГА. Мышей умерщвляли через 3 дня после 5 и 6 доз инъекции и собирали их клетки костного мозга и селезенки.Выделенные клетки окрашивали анти-мышиным CD71-PE, анти-мышиным Ter119-APC и 7AAD после блокирования анти-мышиным CD16/32 и определяли долю эритроидных клеток (как описано на S3 Fig). Доли эритроидных клеток в КМ и селезенке мышей приведены выше (ВМ р <0,001 и селезенка р = 0,061, ANOVA). Каждое значение представляет собой среднее ± SEM наблюдений. n = 4 контрольных и 6 мышей АИГА. * р <0,05, *** р <0,005 и **** р <0.001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g006

    Рис. 7. Изменение относительных долей эритроидных клеток на разных стадиях дифференцировки при АИГА.

    Мышам еженедельно давали i . р . инъекции эритроцитов крысы для индукции АИГА. Мышей умерщвляли через 3 дня после инъекции 6 и собирали их клетки костного мозга и селезенки. Выделенные клетки окрашивали анти-мышиным CD71-PE, анти-мышиным Ter119-APC и 7AAD, и определяли долю эритроидных клеток, как описано на S3 Fig.Доля эритроидных клеток на разных стадиях созревания в костном мозге и селезенке у контрольных мышей и мышей АИГА представлена ​​вместе с процентными изменениями АИГА (ANOVA, p <0,001 как для костного мозга, так и для селезенки). Каждое значение представляет собой среднее ± SEM наблюдений. n = 4 контрольных и 6 мышей, индуцированных АИГА. * p <0,05, *** p <0,005 и **** p <0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0166878.g007

    Наличие мембраносвязанных аутоантител на эритроидных клетках на разных стадиях дифференцировки также исследовали в костном мозге и селезенке контрольных и АИГА мышей. Значительное увеличение уровней связанных с мембраной антител наблюдалось в эритроидных популяциях в костном мозге, а также в селезенке мышей АИГА (рис. 8, панель А). Значительное увеличение количества связанных с мембраной антител наблюдалось также в клетках, принадлежащих к отдельным стадиям эритроидной дифференцировки, как в костном мозге, так и в селезенке (рис. 8, панели В и С).Интересно, что увеличение уровня мембраносвязанных аутоантител было относительно большим в популяциях эритробластов В и эритробластов С (63,4% и 57,3% соответственно) в костном мозге по сравнению с увеличением, наблюдаемым на более ранних стадиях эритроидной дифференцировки.

    Рис. 8. Генерация антимышиных аутоантител в эритроидных клетках костного мозга и селезенки у мышей с индуцированной АИГА.

    Мышам вводили внутрибрюшинно 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель, чтобы вызвать АИГА.Мышей умерщвляли и собирали их клетки костного мозга и селезенки. Выделенные клетки окрашивали анти-мышиным CD71-PE, анти-мышиным Ter119-APC и 7AAD после блокирования анти-мышиным CD16/32 для определения доли живых эритроидных клеток, как описано на рис. S3. -окрашивание F(ab’) 2 против IgG-PE мыши для выявления присутствия аутоантител. Эритроидные клетки на разных стадиях созревания (проэритробласты, эритробласты А, В и С) гейтировали и в каждой из них анализировали связывание аутоантител.Наличие мембраносвязанных аутоантител в общей эритроидной популяции костного мозга и селезенки после 6 инъекций показано на панели А (тест ANOVA для костного мозга, p< 0,001 и селезенки, p = 0,001). Панели B и C показывают связывание аутоантител в эритроидных клетках на различных стадиях дифференцировки в костном мозге и селезенке (критерий ANOVA, p< 0,001 как для костного мозга, так и для селезенки) соответственно. Каждая полоса на графике представляет среднее ± SEM наблюдений.n = 4 контрольных и 6 мышей, индуцированных АИГА. * р < 0,05, ** р < 0,01 и **** р < 0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g008

    Генерацию АФК также исследовали в клетках, принадлежащих к разным стадиям эритроидной дифференцировки, в костном мозге и селезенке контрольных и АИГА мышей. Результаты на рис. 9 показывают значительное увеличение (67,7%, p<0,001) уровней АФК во всех эритроидных клетках костного мозга мышей АИГА, тогда как величина увеличения составила всего 18.5% (незначительно) в эритроидных клетках селезенки мышей АИГА. Сравнение уровней АФК на разных стадиях эритроидных клеток костного мозга показало, что достоверное повышение уровней АФК наблюдалось только на стадиях эритробласта В и эритробласта С, причем внутри этих двух стадий максимальное увеличение (51,4%) уровня АФК наблюдалось на стадии эритробласта С. (рис. 9), что также показало максимальное снижение пропорций у мышей АИГА (рис. 7).

    Рис. 9. Генерация АФК в эритроидных клетках костного мозга и селезенки при АИГА.

    Мышам давали и . р . инъекции 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель для индукции АИГА. Мышей умерщвляли через 3 дня после 5 и 6 инъекций и собирали их клетки костного мозга и селезенки. Выделенные клетки окрашивали анти-мышиным CD71-PE, анти-мышиным Ter119-APC и 7AAD и инкубировали с CM-H 2 DCFDA. Определяли эритроидные клетки на разных стадиях созревания и оценивали генерацию АФК в каждой из них.АФК в эритроидных клетках на разных стадиях созревания приведены выше. Каждое значение представляет собой среднее ± SEM наблюдений. n = 4 контрольных и 6 мышей, индуцированных АИГА. * p <0,05, ** p <0,01 и **** p <0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g009

    Обсуждение

    Аутоиммунные заболевания вызываются нарушением аутотолерантности, вызванным активацией аутореактивных лимфоцитов [38].Иммунологическая невосприимчивость достигается за счет клональной делеции [39,40] и/или клональной анергии [40,41] лимфоцитов, которые потенциально могут реагировать с собственными компонентами. В некоторых случаях аутотолерантность может быть нарушена из-за генетических факторов и/или факторов окружающей среды, таких как инфекции [42,43], которые могут спровоцировать аутоиммунитет либо путем воздействия криптических аутоэпитопов, либо неоантигенов, поликлональной активации Т- и/или В-клеток, молекулярной мимикрия между собственными и чужеродными антигенами, ошибки центральной и периферической толерантности или нарушения иммунной регуляции [44].В модели Playfair и Clarke [20] экспериментально индуцированной АИГА у мышей используется один из таких механизмов, при котором иммунологическая невосприимчивость к собственным эритроцитам нарушается повторным воздействием крысиных эритроцитарных антигенов со сходными/общими эпитопами, которые активируют в противном случае неактивные аутореактивные B- и T-рецепторы. -лимфоциты [22–23]. У мышей, которым вводили крысиные эритроциты (REA), развивается аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA), характеризующаяся наличием аутоантител против мышиных эритроцитов [22].

    В нашем исследовании у мышей C57BL/6 развилась значительная анемия после 5–6 последовательных еженедельных инъекций ( i . p .) эритроцитов крыс наряду со значительными уровнями связанных аутоантител на эритроцитах и ​​эритроидных клетках в костном мозге и селезенке. Детальное исследование с участием субпопуляций эритроцитов разных возрастных групп было предпринято для анализа возрастной предрасположенности циркулирующих эритроцитов к удалению при АИГА. Наше исследование выявило значительное снижение относительной доли более молодых эритроцитов и сопутствующее значительное увеличение относительной доли старых эритроцитов в циркуляции (рис. 3, панели D-G).Эти результаты указывают на преимущественную потерю более молодых эритроцитов и накопление старых эритроцитов в кровообращении мышей АИГА. Интересно, что мембраносвязанные аутоантитела могут быть продемонстрированы на всех возрастных группах эритроцитов, особенно после 5-недельных инъекций эритроцитов крыс. На шестой неделе все еще обнаруживались значительные аутоантитела, связанные с эритроцитами, для ретикулоцитов и молодых эритроцитов. Связывание аутоантител также наблюдалось на всех стадиях эритроидной дифференцировки в костном мозге, а также в селезенке.Однако уровни этих связанных с мембраной аутоантител максимальны на стадии эритробласта С в костном мозге, ретикулоцитах и ​​самых молодых эритроцитах в циркуляции. Поскольку связанные с мембраной антитела могут вызывать элиминацию клеток посредством нормальных механизмов активации комплемента и опосредованного антителами фагоцитоза, эти механизмы могут способствовать большей восприимчивости этих стадий жизненного цикла эритроидных клеток к элиминации при АИГА. Другим фактором, который может сделать клетки более восприимчивыми к элиминации, может быть образование АФК в ответ на аутоантитела.Наличие аутоантител на клетках-предшественниках костного мозга было связано с развитием гипоплазии и даже чистой аплазии эритроцитов при системной красной волчанке [36,37]. Как и уровни мембраносвязанных аутоантител, стадия эритробластов С в костном мозге и ретикулоцитах, а также молодые эритроциты в кровообращении генерируют более высокие уровни АФК, и этот фактор также может способствовать преимущественной элиминации этих клеток при АИГА.

    Связывание аутоантител может способствовать лизису эритроцитов за счет активации комплемента, а также за счет опсонизации, что приводит к усилению фагоцитоза.Оба этих процесса, однако, могут потребовать определенной критической плотности аутоантител на мембране эритроцита, и аутоантитела, будучи слабым ответом, не всегда могут приводить к тому, что эритроциты имеют требуемые критические уровни мембраносвязанных антител. Соответственно, не все эритроидные клетки и субпопуляции эритроцитов, которые связали аутоантитела, уменьшились в относительных пропорциях. Связывание антител может также вызывать другие изменения в эритроцитах, которые могут влиять на выживаемость клеток. Аутоиммунный ответ был связан с АФК-опосредованным повреждением при различных аутоиммунных заболеваниях [31-35].Сообщалось, что аутоантитела к антиоксидантным ферментам вызывают окислительный стресс, что, в свою очередь, приводит к образованию окислительно модифицированных аутоантигенов, которые служат неоантигенами, вызывая усиление воспалительной реакции [33,45]. При АИГА было продемонстрировано образование аутоантител против высокоантигенного белка полосы 3 [23], которые связывают анионный канал и блокируют высвобождение внутриклеточных АФК, особенно супероксид-аниона из эритроцитов, что приводит к увеличению внутриклеточных уровней АФК [34,35].Таким образом, АФК, образующиеся в эритроцитах, могут быть фактором, определяющим восприимчивость эритроцитов разных возрастных групп к элиминации. В нашем исследовании выявлено достоверное повышение (34,6%) уровня АФК в эритроцитах цельной крови, а также во всех возрастных субпопуляциях эритроцитов при АИГА (рис. 5, панель B-F). Однако максимальный уровень АФК был зарегистрирован в молодых биотин--негативных эритроцитах (рис. 5, панель D), что может быть фактором повышенной восприимчивости этой группы эритроцитов к механизмам элиминации.Старые эритроциты, несмотря на связывание аутоантител и повышенный уровень АФК, по-видимому, выживают при АИГА, причина которого не ясна. Возможно, что снижение чувствительности старых эритроцитов может быть результатом снижения эффективности механизмов, вызывающих клеточную гибель или эриптоз, которые могут вызывать связывание аутоантител. Проверка этого предположения потребует дальнейшей работы.

    На основании полученных результатов мы хотели бы предложить модель для определения восприимчивости эритроидных клеток, подвергающихся дифференцировке, и возрастных субпопуляций эритроцитов (рис. 10).В этой модели показано восемь стадий жизненного цикла эритроидных клеток, из которых первые четыре находятся в костном мозге и покоятся в кровообращении. Тенденции связывания аутоантител, генерируемых у мышей АИГА, а также относительное образование АФК на разных стадиях представлены в таблице, представленной на иллюстрации модели. Изменения относительных долей этих стадий в жизненном цикле эритроидных клеток в костном мозге (стадии 1–4) и в крови (стадии 5–8) также сопоставлены в этой таблице.В костном мозге доля только стадии 4 значительно снижается по сравнению с общим сокращением эритроидной популяции в костном мозге мышей АИГА. В кровообращении 5-7 стадии значительно снижаются, тогда как доля 8 стадии (старых эритроцитов) действительно значительно увеличивается. Таким образом, по-видимому, при АИГА наблюдается преимущественное устранение стадий 4 в костном мозге и стадий 5–7 в крови, хотя связывание аутоантител и образование АФК также можно наблюдать и на других стадиях.Таким образом, оказывается, что при АИГА клетки на ранних стадиях эритроидной дифференцировки, а также старые эритроциты в кровообращении почти не поражаются. Стадия 4 в костном мозге и стадия 5-7 в эритроцитах крови, по-видимому, преимущественно элиминируется при АИГА. Таким образом, наши результаты показывают, что в модели АИГА на мышах более поздние стадии эритроидной дифференцировки костного мозга и более молодые эритроциты в кровотоке специфически устраняются. Это новая информация, которая может помочь в разработке соответствующих вмешательств для АМСЗ.

    Рис. 10. Предлагаемая модель АМСЗ.

    Модель, изображающая этапы жизненного цикла эритроидных клеток, которые преимущественно элиминируются при АИГА, приведена выше. Стадии с 1 по 4 изображают эритроидные стадии в костном мозге, а стадии с 5 по 8 изображают различные возрастные группы эритроцитов в кровообращении. Сводка результатов связывания аутоантител и образования АФК на разных стадиях, а также изменения относительных долей клеток на разных стадиях представлены в таблице на рисунке.Заштрихованная область, охватывающая стадии с 4 по 7, предпочтительно исключается в модели мышей AIHA.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.g010

    Вспомогательная информация

    S1 Рис. Метод двойного

    биотинилирования in vivo (DIB) для отслеживания возрастных изменений циркулирующих эритроцитов.

    мышам C57BL/6 вводили три ежедневные ( и , и ) дозы по 1 мг BXN (первый этап биотинилирования). После отдыха в течение 30 дней однократная дополнительная доза 0.Вводили 6 мг BXN (вторая стадия биотинилирования). Кровь собирали в разные моменты времени и определяли распределение биотиновой метки на эритроцитах путем окрашивания клеток стрептавидином-АРС с последующей проточной цитометрией. Биотин отрицательные эритроциты будут представлять свежие и самые молодые эритроциты, высвобождаемые в кровь после второго этапа биотинилирования, биотин низкий эритроцитов, когорта эритроцитов, высвобождаемых в кровоток между первым и вторым этапами биотинилирования, а биотин высокий эритроцитов будет представлять собой популяция старых остаточных эритроцитов, которые присутствовали в крови на момент первой стадии биотинилирования.Группа молодых эритроцитов может быть далее подразделена на ретикулоциты и молодые эритроциты на основе окрашивания антителом к ​​CD71. Схема эксперимента представлена ​​на панели А, и стратегия гейтирования использовалась для идентификации биотина high , биотина low , CD71 ˗ биотина отрицательных эритроцитов и CD71 + биотина отрицательных ретикулоцитов. проточная цитометрия представлена ​​на панели B.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.s001

    (ТИФ)

    S2 Рис. Генерация аутоантител против мышиных эритроцитов у мышей с индуцированной АИГА.

    мышам C57BL/6 вводили i . р . инъекции 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель для индукции АИГА. В намеченные моменты времени у мышей брали кровь и эритроциты (1×10 6 ) окрашивали поликлональными антителами против мышиных IgG/IgM-FITC для оценки присутствия мембраносвязанных аутоантител в эритроцитах у контрольных мышей и мышей, индуцированных АИГА.Репрезентативные гистограммы потока, показывающие окрашивание антимышиных IgG/IgM-FITC, представлены на панели А. Уровень мембраносвязанных аутоантител на циркулирующих эритроцитах указан на панелях В (относительное связывание аутоантител) и С (доля эритроцитов с мембраносвязанными антителами). аутоантитела). Каждая полоса на графике представляет собой среднее ± SEM наблюдений. n = 10 мышей. *** p <0,005 и **** p <0,001 для сравнения групп (критерий Стьюдента).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.s002

    (TIF)

    S3 Рис. Эритропоэтическая активность в костном мозге (КМ) и селезенке у мышей с индуцированной АИГА.

    Мышам вводили внутрибрюшинно 2×10 8 крысиных эритроцитов еженедельно в течение 5–6 недель, чтобы вызвать АИГА. Мышей умерщвляли через 3 дня после 5 и 6 доз инъекции и собирали их клетки костного мозга и селезенки. Выделенные клетки окрашивали антимышиным CD71-PE, антимышиным Ter119-APC и 7AAD после блокирования антимышиным CD16/32 и определяли долю эритроидных клеток.Стратегия гейтирования для определения эритроидных клеток на разных стадиях созревания показана выше. Вкратце, клетки костного мозга и селезенки были отобраны как живые популяции 7AAD (панель B) и очерчены в соответствии с уровнями CD71 и Ter119. Ter119 + эритроидных клеток можно было идентифицировать в перевернутом L-образном затворе на блок-схеме (панель C). Эритроидные клетки Ter119 med CD71 high внутри этой перевернутой буквы «L» могут быть идентифицированы как ранние проэритробласты (панель C).Оставшуюся эритроидную популяцию можно дополнительно разделить на три разные популяции в зависимости от их размера (прямое рассеяние, FSC) и окрашивания CD71 (панель D). К ним относятся ранние базофильные эритробласты или эритропилические arthroblasts a (Ter119 высокий CD71 высокий FSC высокий ), поздний базофильный полихроматический и ортохроматический эритробласт или эритрофиблем B (TER119 высокий CD71 MED FSC Низкий ), а также ортохроматические эритробласты со зрелыми эритроцитами или эритробластами C (Ter119 высокий CD71 низкий FSC низкий ).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166878.s003

    (TIF)

    Благодарности

    Работа финансировалась за счет двух исследовательских грантов Департамента науки и технологий по гранту №. SR/SO/HS-0261/2012 к РКС. SC получил стипендию старшего научного сотрудника Совета по научным и промышленным исследованиям (CSIR), Нью-Дели. Мы с благодарностью признательны доктору Нити Пури из Школы естественных наук Университета Джавахарлала Неру за помощь в предоставлении лабораторий и помещений для содержания животных.

    Вклад авторов

    1. Концептуализация: РКС.
    2. Контроль данных: SC.
    3. Формальный анализ: СК РКС.
    4. Финансирование приобретения: RKS.
    5. Расследование: SC.
    6. Методология: SC NB.
    7. Администрация проекта: РКС.
    8. Ресурсы: РКС.
    9. Надзор: РКС.
    10. Валидация: RKS.
    11. Визуализация: РКС.
    12. Письмо – первоначальный вариант: SC.
    13. Написание – рецензирование и редактирование: RKS.

    Каталожные номера

    1. 1. Лутит Дж.Ф., Моллисон П.Л. Гемолитическая желтуха (ахолурическая желтуха) врожденная и приобретенная. Дж. Патол Бактериол. 1946 год; 58: 711–728. пмид:20297311
    2. 2. Сокол Р.Дж., Хьюитт С. Аутоиммунный гемолиз: критический обзор. Crit Rev Oncol Hematol. 1985 год; 4: 125–154.пмид:36
    3. 3. БЦ Герс, РЦ Фридберг. Аутоиммунная гемолитическая анемия. Am J Гематол. 2002 г.; 69: 258–271. пмид:110
    4. 4. Сокол Р.Дж., Букер Д.Дж., Штампс Р. Патология аутоиммунной гемолитической анемии. Джей Клин Патол. 1992 год; 45: 1047–1052. пмид:1479028
    5. 5. Хашимото С. Аутоиммунная гемолитическая анемия. Клин Рев Аллерг Имму. 1998 год; 16: 285–295.
    6. 6. Engelfriet CP, Overbeeke MA, фон дем Борн AE. Аутоиммунная гемолитическая анемия.Семин Гематол. 1992 год; 29: 3–12. пмид:1570541
    7. 7. Изуи С., Берни Т., Шибата Т., Фульпиус Т., Фоссати Л., Мерино Р. Молекулярная и клеточная основа патогенности аутоантител. Тохоку J Exp Med. 1994 год; 173: 15–30. пмид:7809905
    8. 8. Джеффрис ЛК. Трансфузионная терапия при аутоиммунной гемолитической анемии. Hematol Oncol Clin North Am. 1994 год; 8: 1087–1104. пмид:7860438
    9. 9. Дэйси С.Дж. Иммунные гемолитические анемии: столетие захватывающего прогресса в понимании.Бр Дж Гематол. 2001 г.; 114: 770–785. пмид:11564063
    10. 10. Semple JW, Freedman J. Аутоиммунный патогенез и аутоиммунная гемолитическая анемия. Семин Гематол. 2005 г.; 42: 122–130. пмид:16041661
    11. 11. Хаттангади С.М., Вонг П., Чжан Л., Флайгар Дж., Лодиш Х.Ф. От стволовых клеток к эритроцитам: регуляция эритропоэза на нескольких уровнях с помощью множества белков, РНК и модификаций хроматина. Кровь. 2011 г.; 118 (24): 6258–6268. пмид:21998215
    12. 12. Дзержак Э., Филипсен С.Эритропоэз: развитие и дифференцировка. Колд Спринг Харб Перспект Мед. 2013; 3(4): а011601. пмид:23545573
    13. 13. Ханделвал С., Саксена Р.К. Оценка выживаемости стареющих эритроцитов в кровотоке и сопутствующих изменений размера и экспрессии CD147 с помощью нового двухэтапного метода биотинилирования. Опыт Геронтол. 2006 г.; 41: 855–861. пмид:16889925
    14. 14. Ханделвал С., Ван Ройен Н., Саксена Р.К. Снижение экспрессии CD47 во время старения мышиных эритроцитов (эритроцитов) и его роль в клиренсе эритроцитов из кровотока.Переливание. 2007 г.; 47 (9): 1725–1732. пмид:17725740
    15. 15. Ханделвал С., Саксена Р.К. Роль экстернализации фосфатидилсерина в клиренсе эритроцитов, подвергшихся стрессу, но не в элиминации стареющих популяций эритроцитов у мышей. Опыт Геронтол. 2008 г.; 43: 764–770. пмид:18556166
    16. 16. Саксена Р.К., Хандельвал С. Старение и разрушение эритроцитов крови у мышей: гипотеза. Curr Sci Индия. 2009 г.; 97: 500–507.
    17. 17. Сахар С., Саксена Р.К.Цитотоксическое действие полидисперсных однослойных углеродных нанотрубок на эритроциты in vitro и in vivo . ПЛОС Один. 2011 г.; 6(7): e22032 pmid:21818289
    18. 18. Saxena RK, Bhardwaj N, Sachar S, Puri N, Khandelwal S. Метод двойного биотинилирования in vivo (DIB) для объективной оценки старения и клиренса эритроцитов мыши в кровообращении. Трансфус Мед Гематер. 2012 г.; 39: 335–341. пмид:23801925
    19. 19. Чаттерджи С., Саксена Р.К.Предпочтительная элиминация старых эритроцитов из кровотока и подавление эритропоэтической активности костного мозга по сравнению с кадмиевой анемией у мышей. ПЛОС Один. 2015 г.; 10(7): e0132697. пмид:26161863
    20. 20. Playfair JHL, Маршалл-Кларк С. Индукция аутоантител эритроцитов у нормальных мышей. Природа Нью Биол. 1973 год; 243: 213–214. пмид:4541395
    21. 21. Кокс К.О., Кист Д. Аутоиммунная гемолитическая анемия, вызванная у мышей, иммунизированных крысиными эритроцитами. Клин Эксп Иммунол.1974 год; 17: 319–327. пмид:4466605
    22. 22. Нейсмит Д.Д., Ортега-Пьеррес М.Г., Элсон К.Дж. Эритроциты крыс индуцировали выработку и контроль аутоантител против эритроцитов у нормальных мышей. Иммунол, версия 1981; 55: 55–87. пмид:6453824
    23. 23. Баркер Р.Н., Шен С.Р., Элсон С.Дж. Специфичность Т-клеток при мышиной аутоиммунной гемолитической анемии, вызванной крысиными эритроцитами. Клин Эксп Иммунол. 2002 г.; 129: 208–213. пмид:12165075
    24. 24. Арндт П.А., Гарратти Г. Проточный цитометрический анализ в иммунологии эритроцитов.Трансфус Мед Гематер. 2004 г.; 31: 163–174.
    25. 25. Тедсавад А., Така А., Ваначиванавин В. Разработка проточной цитометрии для обнаружения и количественного определения иммуноглобулина G, связанного с эритроцитами, при аутоиммунной гемолитической анемии с отрицательным прямым тестом Кумбса. Азиатская Пак J Аллергия Иммунол. 2011 г.; 29: 364–367. пмид:22299318
    26. 26. Liu Y, Pop R, Sadegh C, Brugnara C, Haase VH, Socolovsky M. Подавление коэкспрессии Fas-FasL эритропоэтином опосредует расширение эритробластов во время эритропоэтической реакции на стресс in vivo.Кровь. 2006 г.; 108: 123–133. пмид:16527892
    27. 27. Kalfa TA, Pushkaran S, Zhang X, Johnson JF, Pan D, Daria D, et al. ГТФазы Rac1 и Rac2 необходимы для ранней эритропоэтической экспансии в костном мозге, но не в селезенке. Гематология. 2010 г.; 95: 27–35. пмид:20065081
    28. 28. Бхардвадж Н., Саксена Р.К. Элиминация молодых эритроцитов из кровообращения и измененные модели эритропоэза во время фазы анемии, вызванной паракватом, у мышей. ПЛОС Один.2014; 9(6): e99364. пмид:24945144
    29. 29. Маринкович Д., Чжан Х., Ялчин С., Лучано Дж. П., Бругнара С., Хубер Т. и др. Foxo3 необходим для регуляции окислительного стресса в эритропоэзе. Джей Клин Инвест. 2007 г.; 117: 2133–2144. пмид:17671650
    30. 30. Бхардвадж Н., Саксена Р.К. Избирательная потеря более молодых эритроцитов из кровообращения и изменения эритропоэтических структур в костном мозге и селезенке при анемии мышей, вызванной полидисперсными одностенными углеродными нанотрубками.Нанотоксикология. 2015 г.; 9(8): 1032–1040. пмид:25831400
    31. 31. Мишель П., Эггерт В., Альбрехт-Небе Х., Грун Т. Повышенное перекисное окисление липидов у детей с аутоиммунными заболеваниями. Акта Педиатр. 1997 год; 86: 609–612. пмид:

      96

    32. 32. Куриен Б.Т., Скофилд Р.Х. Опосредованное свободными радикалами пероксидативное повреждение при системной красной волчанке. Жизнь наук. 2003 г.; 73: 1655–1666. пмид:12875898
    33. 33. Куриен Б.Т., Хенсли К., Бахманн М., Скофилд Р.Х. Окислительно модифицированные аутоантигены при аутоиммунных заболеваниях.Свободнорадикальная Био Мед. 2006 г.; 41: 549–556.
    34. 34. Лучи Ю., Кибе Н., Цунода С., Судзуки С., Миками Т., Окада Ф. и др. Значение окислительного стресса как причины аутоиммунной гемолитической анемии у мышей NZB. Свободнорадикальная Био Мед. 2010 г.; 48: 935–944.
    35. 35. Fujii J, Kurahashi T, Konno T, Homma T, Iuchi Y. Окислительный стресс как потенциальный причинный фактор аутоиммунной гемолитической анемии и системной красной волчанки. Мир J Нефрол. 2015 г.; 4(2): 213–222. пмид:25949934
    36. 36.Роффе С., Кэхилл М.Р., Саманта А., Брикнелл С., Даррант С.Т. Апластическая анемия при системной красной волчанке: клеточный иммунный механизм? Br J Ревматол. 1991 год; 30: 301–304. пмид:1863830
    37. 37. Кили П.Д., МакГакин К.П., Коллинз Д.А., Беван Д.Х., Марш Д.К. Аплазия эритроцитов и системная красная волчанка. волчанка. 1995 год; 4: 407–411. пмид:8563736
    38. 38. Вейгл WO. Недавние наблюдения и концепции иммунологической невосприимчивости и аутоиммунитета. Клин эксп Иммунол.1971 год; 9: 437–447. пмид:4107839
    39. 39. Хартли С.Б., Кросби Дж., Бринк Р., Кантор А.Б., Бастен А., Гуднау К.С. Элиминация из периферических лимфоидных тканей аутореактивных В-лимфоцитов, распознающих мембраносвязанные антигены. Природа. 1991 год; 353: 765–769. пмид:1944535
    40. 40. Окамото М., Мураками М., Симидзу А., Одзаки С., Цубата Т., Кумагаи С. и др. Трансгенная модель аутоиммунной гемолитической анемии. J Эксперт Мед. 1992 год; 175: 71–79. пмид:1730928
    41. 41. Goodnow CC, Crosbie J, Adelstein S, Lavoie TB, Smith-Grill SJ, Brink RA, et al.Измененная экспрессия иммуноглобулина и функциональное молчание аутореактивных В-лимфоцитов у трансгенных мышей. Природа. 1988 год; 334: 676–682. пмид:3261841
    42. 42. Смит Х.Р., Стейнберг А.Д. С учетом аутоиммунитета. Анну Рев Иммунол. 1983 год; 1: 175–210. пмид:6399976
    43. 43. Грегерсон П.К., Сильвер Дж., Винчестер Р.Дж. Гипотеза общего эпитопа. Подход к пониманию молекулярной генетики предрасположенности к ревматоидному артриту. Ревмирующий артрит. 1987 год; 30: 1205–1213.пмид:2446635
    44. 44. Фаджиоло Э. Потеря иммунологической толерантности по сравнению с собственными антигенами эритроцитов и нарушением регуляции цитокиновой сети при аутоиммунной гемолитической анемии. Аутоиммунная версия, 2004 г.; 3: 53–59. пмид:15003188
    45. 45. Куриен Б.Т., Скофилд Р.Х. Аутоиммунитет и окислительно модифицированные аутоантигены. Аутоиммунная версия, 2008 г.; 7: 567–573. пмид:18625446

    Физиология и фармакология эритропоэтина — Полный текст — Трансфузионная медицина и гемотерапия 2013, Vol.40, No. 5

    Эритропоэтин человека (Epo) представляет собой гликопротеиновый гормон с молекулярной массой 30,4 кДа, состоящий из одной цепи из 165 аминокислотных остатков, к которой присоединены четыре гликана. Почки являются первичными источниками Эпо, его синтез контролируется факторами транскрипции, индуцируемыми гипоксией (HIF). ЭПО является важным фактором жизнеспособности и пролиферации эритроцитарных клеток-предшественников. Оказывает ли Epo цитозащитное действие за пределами костного мозга, еще предстоит выяснить. Дефицит ЭПО является основной причиной анемии при хронической болезни почек (ХБП).Лечение рекомбинантным человеческим ЭПО (rhEpo, эпоэтин) может быть полезным не только при ХБП, но и при других показаниях, прежде всего при анемии у онкологических больных, получающих химиотерапию. Принимая во внимание нежелательные явления, введение rhEpo или его аналогов может увеличить частоту тромбоэмболий. Истечение срока действия патентов на оригинальные эпоэтины положило начало производству аналогичных биологических лекарственных препаратов («биоаналоги»). Кроме того, были разработаны аналоги (дарбэпоэтин альфа, метокси ПЭГ-эпоэтин бета) с длительным выживанием в циркуляции («биобеттер»).Новые стимуляторы эритропоэза проходят клинические испытания. К ним относятся соединения, которые непосредственно усиливают эритропоэз (например, миметические пептиды эритропоэза или белок, связывающий активин А), и химические вещества, которые действуют опосредованно, стимулируя эндогенный синтез эритропоэтина (стабилизаторы HIF).

    © 2013 S. Karger GmbH, Фрайбург

    Введение

    Жизнеспособность, пролиферация и дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников контролируются плейотропными факторами и факторами, специфичными для линий клеток крови.Производство эритроцитов (эритроцитов) регулируется гормоном эритропоэтином (Эпо), который поддерживает постоянную концентрацию гемоглобина в крови (Hb) в нормальных условиях. Эритроциты циркулируют в течение 100-120 дней. Затем они поглощаются макрофагами в костном мозге, а также, возможно, в селезенке и печени. Компенсируя эту потерю, костный мозг производит около 2,5 миллионов ретикулоцитов каждую секунду. Дефицит ЭПО приводит к анемии.

    Около 25% пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) нуждались в регулярных переливаниях крови, прежде чем стал доступен рекомбинантный человеческий Эпо (рчЭпо).Трансфузионная терапия является важным вариантом, и переливание эритроцитарной массы часто спасает жизнь. Однако продукты крови также несут в себе риски, такие как передача инфекционных заболеваний, острые и хронические гемолитические трансфузионные реакции и повреждение легких, связанное с переливанием крови. Это было особенно актуально для 1980-х годов (передача ВИЧ через кровь и производные плазмы), когда rhEpo стал клинически доступным. Запуск rhEpo и аналогичных стимуляторов эритропоэза (ESA) к настоящему времени принес пользу миллионам пациентов с хронической анемией [рассмотрено в [1]].Следует отметить, что в этот период безопасность переливания крови также повысилась, о чем свидетельствует Немецкий отчет о гемонадзоре за 2010 г. Института Пауля Эрлиха ( www.pei.de ).

    Места и контроль продукции ЭПО

    Перитубулярные фибробласты в коре почек являются основным местом синтеза ЭПО. мРНК Эпо также обнаруживается в печени, селезенке, костном мозге, легких и головном мозге, и Эпо может транслироваться в этих органах в небольших количествах. На самом деле, печень является основным местом производства Epo на эмбриональной стадии.Концентрация циркулирующего ЭПО экспоненциально возрастает при снижении концентрации гемоглобина при неосложненной анемии (отсутствие заболевания почек или воспаления). Регулируемой переменной является рО 2 ткани, которая зависит от концентрации Hb, артериального рО 2 и сродства Hb-O 2 . По сравнению с другими органами рО 2 в коре почек мало зависит от изменений кровотока, так как потребление почками О 2 уменьшается пропорционально кровотоку.Следовательно, почки являются наиболее подходящими для продукции Эпо в крови, регулируемым содержанием O 2 (рис. 1).

    Рис. 1

    Схема эритропоэза. Почки являются основным местом производства эритропоэтина (ЭПО). Энхансер EPO активируется комплексом факторов транскрипции, индуцируемых гипоксией, HIF-1β/HIF-2α. Поддерживаемый кофакторами, такими как p300, комплекс HIF связывается с элементом ответа на гипоксию (HRE), активируя экспрессию EPO .В костном мозге ЭПО способствует выживанию, пролиферации и дифференцировке эритроцитарных клеток-предшественников, особенно эритроидных колониеобразующих единиц (КОЕ-Э). Примерно через четыре дня после повышения уровня ЭПО в кровоток поступает больше ретикулоцитов.

    Продукция ЭПО зависит от скорости транскрипции гена ЭПО (ЭПО; в хромосоме 7). Задействовано несколько факторов транскрипции. Промотор ЭПО ингибируется GATA-2 и ядерным фактором ▩B (NF-▩B), которые, вероятно, ответственны за нарушение экспрессии ЭПО при воспалительных заболеваниях [2].Энхансер EPO обладает элементом, реагирующим на гипоксию (HRE), который активируется гетеродимерными (α/β, 100-120 кДа каждый) транскрипционными факторами, индуцируемыми гипоксией (HIF). Помимо ЭПО, были идентифицированы сотни других HIF-чувствительных генов. Субъединицы HIF-α представлены изоформами, основным активатором ЭПО является HIF-2, который включает HIF-1β и HIF-2α [3].

    Важно отметить, что субъединицы HIF-α O 2 лабильны. Их С-конец содержит два остатка пролина (Pro 405 и Pro 531 в HIF-2α), которые гидроксилируются специфическими, требующими α-кетоглутарата, диоксигеназами в присутствии O 2 [рассмотрено в [3,4]. ,5]].HIF-α подвергается немедленной протеасомной деградации при гидроксилировании пролила, поскольку он помечен белком-супрессором опухоли фон Хиппеля-Линдау (pVHL) в ассоциации с убиквитинлигазой E3. Далее, в присутствии O 2 остаток аспарагина HIF-α (Asn 847 в HIF-2α) гидроксилируется так называемым фактором, ингибирующим HIF (FIH). После этого предотвращается связывание коактиватора транскрипции p300/CBP (CREB-связывающий белок). Разрабатываются лекарства для управления этими процессами и, таким образом, HIF-зависимой экспрессией генов [4,5,6].

    Структура Epo

    Epo человека представляет собой кислый гликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа. Его цепь из 165 аминокислотных остатков образует четыре антипараллельные α-спирали, два β-листа и два внутрицепочечных дисульфидных мостика (Cys 7 -Cys 161 , Cys 29 -Cys 33 ). Углеводная часть (40% молекулы) включает три N-гликана (по Asn 24 , Asn 38 и Asn 83 ) и один O-гликан (по Ser 126 ).N-гликаны выполняют множество функций, включая защиту Epo от протеаз и модуляцию его сродства к связыванию с рецепторами [7].

    Изоформы гликозилирования Epo и его аналогов можно различить с помощью изоэлектрофокусировки и иммуноблоттинга. Эти методы также используются для доказательства допинга ЭСА в спорте [8].

    Действие Эпо на предшественники эритроцитов

    Эритроциты являются потомками гемопоэтических стволовых клеток CD34+ [9], «КОЕ-GEMM» (колониеобразующие единицы, генерирующие гранулоциты, эритроциты, моноциты и мегакариоциты).«BFU-Es» (взрывообразующие единицы — эритроид) являются самыми ранними потомками в эритроцитарном компартменте. Их потомство проходит около 12 делений, давая начало нескольким сотням эритробластов в течение 10-20 дней. Рядом с BFU-E находятся «CFU-E» (колониеобразующие единицы — эритроид), которые экспрессируют обильные молекулы рецептора Epo (EpoR) и подвергаются апоптозу в отсутствие Epo. В присутствии Эпо КОЕ-Э и их потомство делятся 3-5 раз, образуя 8-64 эритробласта в течение 7-8 дней (рис.1). Как только достигается уровень «ортохроматических эритробластов» (син. «нормобласты»), клетки выдавливают свои ядра и затем становятся ретикулоцитами [10]. Ретикулоциты и зрелые эритроциты лишены EpoR.

    Как показано на рисунке 2, EpoR человека представляет собой трансмембранный гликопротеин массой приблизительно 59 кДа (484 аминокислотных остатка, один N-гликан), который действует как гомодимер [11]. Связывание Epo вызывает внутриклеточную активацию EpoR-ассоциированной Янус-киназы 2 (JAK-2). В свою очередь, JAK-2, EpoR и другие сигнальные белки фосфорилированы по тирозину [12].Кроме того, JAK-2 является важным шапероном для переноса EpoR на клеточную поверхность [13]. Фосфорилированный EpoR обеспечивает сайты стыковки для белков, содержащих домены гомологии SRC 2 (Sh3). В передаче сигналов EpoR участвуют преобразователи сигналов и активаторы транскрипции, такие как STAT-5, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI-3K)/AKT (протеинкиназа B) и SHC/митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK).

    Рис. 2

    Схема передачи сигналов рецептора Эпо. Эндогенный Epo, его рекомбинантные аналоги и Epo-миметические пептиды могут связываться с гомодимерным EpoR.Затем EpoR рекрутирует JAK-2, который катализирует трансфосфорилирование EpoR/JAK-2. Фосфорилированный EpoR индуцирует активацию преобразователя сигнала и активатора транскрипции 5 (STAT-5), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3K)/AKT и адаптерного белка Sh3 C (SHC)/митоген-активируемой протеинкиназы. (MAPK) пути. STAT-5 индуцирует экспрессию антиапоптотических белков (например, Bcl-x L ). PI-3K и MAPK предотвращают активацию проапоптотических белков (Bax, Bad) каспаз, специфических цистеиновых протеаз, в противном случае осуществляющих апоптоз.Кроме того, МАРК активирует гены, способствующие пролиферации клеток.

    Действие Epo прекращается, когда EpoR дефосфорилируется тирозинфосфатазой SHP-1 (Src-гомология фосфатазы-1) и интернализуется комплекс Epo/EpoR. Исследования in vitro показывают, что около 60% ЭПО повторно секретируется, а 40% подвергается протеасомной деградации после интернализации [14]. Опосредованное EpoR поглощение Epo клетками-мишенями считается основным механизмом деградации циркулирующего Epo [15].

    Предполагаемые действия Epo вне костного мозга

    Ген EpoR человека (EPOR; в хромосоме 19) экспрессируется не только в эритроцитарных предшественниках, но и в большинстве тканей [16,17], поскольку в промоторе EPOR отсутствует TATA-бокс [18 ]. Эндотелиальные, сердечные, почечные и нейрональные клетки человека содержат в 10-100 раз более низкие уровни мРНК EpoR, чем клетки, высоко реагирующие на Epo [16,17]. Доклинические исследования приписывали ЭСС плейотропный цитопротекторный эффект против гипоксии, ишемии/реперфузии, цитотоксических агентов и воспаления.Однако роль Epo/EpoR-системы за пределами костного мозга явно нуждается в одобрении [19]. Исследования на трансгенных мышах показали, что Epo/EpoR-система незаменима в некроветворных тканях [20]. С другой стороны, есть наблюдения химического связывания антител, выработанных против EpoR (в основном, поликлональных антител C-20; Santa Cruz), с различными клетками и тканями [обзор в [21]]. Тем не менее эти наблюдения могли быть неверно истолкованы, поскольку антитела (включая C-20), использованные в более ранних исследованиях, оказались неспецифичными и перекрестно реагирующими с различными другими белками, такими как белки теплового шока [22,23].Недавно было разработано моноклональное антитело, специфичное к EpoR (A-82; Amgen), и только это позволило провести достоверный анализ экспрессии белка EpoR [24]. Исследования с А-82 показали, что только эритроидные клетки имеют значительные уровни EpoR [16,17]. Кроме того, исследования с использованием A-82 показали, что линии опухолевых клеток обычно экспрессируют только низкие (до неопределяемых) уровни EpoR и что их EpoR нефункционален [25].

    В некоторых сообщениях предполагается in vitro ангиогенное действие ЭПО на эндотелиальные клетки-предшественники костного мозга человека (ЭКП) [26].В одном клиническом исследовании ЭСС увеличивали количество ЭПК в циркуляции [27]. Однако в других исследованиях лечение ЭСС не влияло на количество ЭПК у доноров для аллогенной трансплантации стволовых клеток периферической крови [28] или у пациентов с острым инфарктом миокарда [29]. ESA также не оказывали влияния в анализе ангиогенеза in vivo [16]. В совокупности все еще отсутствуют убедительные доказательства того, что ЭСС стимулируют ангиогенез в клинических условиях [19].

    Epo может выполнять локальную функцию в головном мозге помимо его роли в эритропоэзе [30,31].Предполагается, что Эпо действует как нейротрофический и нейропротекторный фактор. Терапевтическая ценность введения rhEpo людям с гипоксическим поражением головного мозга находится в центре внимания настоящего исследования [32].

    Было высказано предположение, что Epo может оказывать некроветворное действие через гетеромерные рецепторы, включающие EpoR и CD131, общую β-субъединицу рецепторов цитокинов, таких как интерлейкин-3 (IL-3), IL-5 и гранулоцитарно-макрофагальные колонии. -стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) [33]. В доклинических исследованиях асиало-Эпо (Эпо, лишенный терминальной сиаловой кислоты) и карбамоилированный Эпо (СЕРО, Эпо, обработанный цианатом) оказывали цитопротекторное действие без стимуляции эритропоэза.Однако другие исследователи не обнаружили доказательств взаимодействия между EpoR и CD131 [34].

    Анализ ЭПО

    Биоанализы ЭПО in vivo обычно проводят на грызунах путем измерения ретикулоцитов или включения радиоактивного железа ( 59 Fe) в кровь. Одна международная единица ЭПО (МЕ) вызывает у животных такой же эритропоэтический ответ, как 5 мкмоль хлорида кобальта (Co 2+ ). Удельная активность эпоэтина in vivo (около 200 000 МЕ/мг пептида) выше, чем у очищенного ЭПО из мочи человека (70 000 МЕ/мг пептида).Биоанализы in vitro на Epo можно проводить в культурах клеток, чувствительных к Epo, путем измерения активности ферментов или синтеза гема или ДНК. В рутинной клинической практике для измерения единиц иммунореактивности Epo (Ед) обычно используются твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) для Epo. Нормальная концентрация Эпо в плазме крови человека составляет около 15 ЕД/л (~5 пмоль/л). Биоанализ in vivo необходим для калибровки rhEpo для терапевтических целей, поскольку иммунологические анализы не дают четкой информации об активности ESA в организме.

    Рекомбинантные препараты Эпо

    Трансфицированные клетки яичника китайского хомячка (СНО) обычно используются для крупномасштабного производства ЭСС. Лекарственные вещества готовят в виде сухих порошков или изотонических буферных растворов хлорида натрия/цитрата натрия для внутривенного (IV) или подкожного (SC) введения. Их стабилизируют полисорбатом (Tween-20 или -80) или человеческим альбумином (2,5 мг/мл) и бензиловым спиртом (1%).

    «Эпоэтин» — это международное непатентованное название лекарственного препарата (МНН) для rhEpo, полученного из эукариотических клеток, аминокислотная последовательность которого идентична последовательности эндогенного человеческого Epo.Различия в цепочке аминокислотных остатков обозначаются случайным префиксом (например, «дарбэпоэтин»). Характер гликозилирования обозначается греческой буквой (альфа, бета и т. д.). Две марки инновационного rhEpo, полученного из клеток CHO, а именно эпоэтин альфа и эпоэтин бета, были выпущены в качестве антианемических средств около 25 лет назад. Эпоэтин альфа продается в США как Epogen® (Amgen) для лечения пациентов с ХБП, находящихся на гемодиализе, и как Procrit® (Johnson and Johnson) для других показаний по соглашению с Amgen, а за пределами США в основном как Eprex® или Erypo. ® (Ortho Biotech, дочерняя компания Johnson and Johnson) и Espo® (Kirin).Эпоэтин бета в основном продается как NeoRecormon® (F. Hoffmann-LaRoche) и Epogin® (Chugai/F. Hoffmann-LaRoche). Первоначальные эпоэтины альфа и бета используются по одним и тем же основным показаниям (анемии, связанные с ХБП, или рак, леченный миелосупрессивной химиотерапией). В 2009 году эпоэтин тета был выпущен в качестве еще одного автономного rhEpo, полученного из клеток CHO (Eporatio®, Ratiopharm; Biopoin®, CT Arzneimittel) в Европейском союзе (ЕС). В некоторых частях мира пациентов с ХЗП лечили эпоэтином омега, который экспрессируется в клетках почек детенышей хомяка, трансфицированных кДНК ЭПО (BHK, от сирийского хомячка), но, по-видимому, этот продукт широко не используется.

    После истечения срока действия патентов на инновационные эпоэтины другие производители разработали аналогичные биологические лекарственные препараты («биоаналоги») [35]. Основной причиной использования биоаналогов является экономия затрат. Поскольку биофармацевтические препараты не могут быть точно скопированы, Комитет по лекарственным препаратам для человека (CHMP) Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) выпустил руководящие принципы, касающиеся утверждения биоаналогов и требований к конкретным продуктам для эпоэтинов ( www.ema.europa.eu/ema/). Аналогичные пути регулирования существуют во многих других регионах мира (США, Канада, Австралия, Япония и др.). Два биоаналога эпоэтина, доступные в ЕС, используются в той же дозе(ах) и режиме(ах) дозирования по показаниям для эталонного препарата Эпрекс/Эрипо. Один из биоаналогов получил МНН эпоэтин альфа (Binocrit®, Sandoz; Epoetin alfa Hexal®, Hexal Biotech; Abseamed®, Medice Arzneimittel Putter), а другой — эпоэтин дзета (Silapo®, Stada; Retacrit®, Hospira). Несколько торговых марок объясняются совместным маркетингом одних и тех же лекарственных веществ разными компаниями.В целом, названия (МНН) эпоэтинов сбивают с толку врачей в ЕС [рассмотрено в [35]].

    Физико-химические и функциональные исследования предполагаемых копий эпоэтина альфа, производимых и используемых во многих странах Азии и Латинской Америки, выявили значительные различия в изоформах, различия в активности от партии к партии, а также загрязнение некоторых продуктов эндотоксинами [36].

    RhEpo, вводимый внутривенно в клинически значимых однократных дозах 50 МЕ/кг массы тела (b.w.) элиминируется с кинетической скоростью первого порядка после фазы быстрого распределения (объем распределения 0,03-0,09 л/кг массы тела). Следовательно, пиковые концентрации rhEpo в плазме (МЕ/л) после внутривенного введения можно приблизительно оценить, умножив дозу (МЕ/кг) на коэффициент 20 [37]. После подкожного введения пиковые концентрации rhEpo в плазме достигаются через 12-18 ч, при этом биодоступность составляет около 30%. При подкожном введении пиковые концентрации в плазме составляют примерно одну двадцатую от исходных значений, измеренных после внутривенного введения.Однако медленное всасывание позволяет снизить потребность в лекарствах примерно на 30% при подкожном введении по сравнению с внутривенным введением [38].

    Существуют рекомбинантные ЭСС с пролонгированным выживанием в циркуляции («биолучше»). Появился первый дарбэпоэтин альфа (Aranesp®; Amgen), гипергликозилированный аналог (37,1 кДа) rhEpo, который содержит два дополнительных N-гликана в ассоциации с заменой пяти аминокислот [7]. По сравнению с конечным периодом полувыведения эпоэтина, вводимого в/в (6-9 ч), период полувыведения дарбэпоэтина альфа в три-четыре раза больше (25 ч), что позволяет применять его реже [39].Другим биопрепаратом является метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин-бета (метокси-ПЭГ-эпоэтин-бета; Mircera®, F. Hoffmann-LaRoche). Период полувыведения метоксиПЭГ-эпоэтина бета (60 кДа) составляет 130-140 часов при в/в введении. Длительное выживание in vivo дарбэпоэтина альфа и метокси ПЭГ-эпоэтина бета частично обусловлено сниженной аффинностью связывания EpoR. 1 мкг дарбэпоэтина альфа или метоксиПЭГ-эпоэтина бета пептида биофизически соответствует 200 МЕ пептида rhEpo. Клинически, однако, продукты длительного действия могут позволить снизить дозу ниже прогнозируемого соотношения 1:200 [39].

    Клиническое применение ЭСС

    ЭСС могут быть показаны для лечения хронических форм анемии, но они не являются альтернативой переливаниям эритроцитарной массы у пациентов с тяжелым кровоизлиянием, вызванным травмой, большой кровопотерей во время операций, таких как кардиоторакальные или операции на печени и тяжелая или опасная для жизни анемия. В зависимости от нормативных актов отдельных стран, ЭСС были одобрены для i) анемии, вызванной ХБП, как додиализной, так и диализной, ii) анемии у больных раком, получающих химиотерапию, iii) анемии, связанной с лечением зидовудином при ВИЧ-инфекции, iv) поддержки забора аутологичной крови , v) плановая хирургия и vi) анемия у недоношенных детей.

    Действительно, недостаток ЭПО является основным фактором, вызывающим анемию при ХБП. Почечные фибробласты теряют способность продуцировать Epo после повреждения и трансдифференцируются в миофибробласты, продуцирующие рубцы [40]. Другими факторами, связанными с почечной анемией, являются кровопотеря, сокращение продолжительности жизни эритроцитов, недоедание, снижение доступности железа и ингибирование роста предшественников эритроцитов воспалительными цитокинами и токсинами уремии. Терапия ЭСС может уменьшить потребность в переливаниях эритроцитов и гипердинамическом состоянии сердца.Физическая работоспособность и функция мозга также могут улучшиться при облегчении анемии. Целевой гематокрит (Hct) у пациентов, получавших ЭСС, обычно устанавливался в диапазоне 0,30–0,36, а целевая концентрация Hb — 100–120 г/л [41]. Тем не менее, действующие в США этикетки ЭСС предупреждают, что пациенты с ХБП в контролируемых клинических исследованиях подвергались большему риску смерти, серьезных побочных сердечно-сосудистых реакций и инсульта, когда ЭСС применялись для целевого уровня гемоглобина > 110 г/л. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США рекомендовало снижать концентрацию гемоглобина до 100 г/л у пациентов с ХБП, не зависящих от диализа, и до 100–110 г/л у пациентов, находящихся на диализе ( www.fda.gov/drugs/drugsafety/ucm259639.htm ).

    У пациентов с ХБП основной причиной резистентности к ЭСС является снижение доступности железа из-за действия гепсидина. На это указывает низкая концентрация ферритина в сыворотке (<100 мкг/л), низкая насыщенность трансферрина (<20%) и высокая доля гипохромных эритроцитов (>10%) [42,43]. Введение железа внутривенно может снизить потребность в дозировке ЭСС [44]. Однако врачи должны знать, что перегрузка железом может привести к повреждению тканей [45].

    У онкологических больных, получающих химиотерапию, лечение ЭСС (эпоэтинами или дарбэпоэтином альфа) можно начинать, когда концентрация гемоглобина падает ниже 100 г/л. Основной целью терапии является поддержание концентрации гемоглобина выше триггерной точки переливания, однако переливание эритроцитов также является вариантом. Клиницисты должны перевешивать потенциальный вред (например, тромбоэмболия) и пользу (например, уменьшение количества трансфузий) ЭСС и сравнивать их с потенциальным вредом (например, очень редкими трансмиссивными инфекциями и различными иммуноассоциированными трансфузионными реакциями) и пользой (например,грамм. быстрое улучшение концентрации Hb) трансфузий эритроцитов [46]. ЭСС следует назначать в минимально возможной дозе, а лечение должно повышать концентрацию гемоглобина до минимально возможного уровня, если оно направлено на предотвращение трансфузий эритроцитов.

    Кроме того, терапия ЭСС может быть показана больным СПИДом, получающим зидовудин. В хирургических условиях rhEpo можно вводить до операции для стимуляции эритропоэза в программах флеботомии для повторного донорства аутологичных эритроцитов или коррекции ранее существовавшей анемии, а также после операции для восстановления массы эритроцитов при определенных вмешательствах.Другим одобренным показанием для ЭСС может быть анемия недоношенных, чтобы уменьшить количество трансфузий эритроцитов у новорожденных.

    Безопасность

    Никогда не сообщалось о случаях острого токсического воздействия одобренных составов rhEpo или его аналогов. ЭСС противопоказаны пациентам с повышенной чувствительностью к продуктам, полученным из нечеловеческих клеток. Пациентов с повышенной чувствительностью к человеческому альбумину не следует лечить препаратами, стабилизированными этим белком. При беременности rhEpo следует назначать очень осторожно, так как риск для плода у человека не оценивался.

    У пациентов с ХБП, получающих лечение ЭСС, наиболее частым нежелательным эффектом является повышение артериального давления и, возможно, гипертония (им подвержены 1–10 пользователей из 100). Таким образом, ЭСС противопоказаны пациентам с неконтролируемой артериальной гипертензией. Повышение артериального давления может быть частично объяснено повышенной вязкостью крови и реверсией вызванной гипоксией вазодилатации в связи с увеличением концентрации гемоглобина. У пациентов с непочечной анемией обычно не развивается артериальная гипертензия на фоне терапии ЭСС.Использование ЭСС может увеличить частоту тромбоэмболий и риск сердечно-сосудистых событий, включая смерть. Вполне вероятно, что возникновение сердечно-сосудистых событий частично связано с повышением концентрации Hb и Hct.

    Точно так же тромбоэмболические осложнения у онкологических больных считаются критическим фактором риска, связанным с применением ЭСС [47]. Обновление Кокрановской базы данных 2012 года, включающее 91 рандомизированное контролируемое исследование (с 20 102 участниками) лечения анемии у онкологических больных, получающих или не получающих противораковую терапию, в которых сравнивалось использование ЭСС (плюс переливание при необходимости), не только подтвердило, что использование ЭСС снижает относительный риск трансфузий эритроцитов, но также предоставил доказательства того, что ЭСС увеличивают риск тромбоэмболических осложнений и летальных исходов [48].Возможно, терапия ЭСС связана с увеличением числа тромбоцитов. ЭСС могут косвенно стимулировать тромбопоэз, поскольку истощение запасов железа из-за усиления эритропоэза может привести к тромбоцитозу [49]. В недавнем отчете предлагается снизить риск тромбоза, связанный с ЭСС, с помощью антитромботической терапии [50].

    Другой важный вопрос заключается в том, могут ли ESA стимулировать рост опухоли. Лабораторные исследования с применением соответствующих биохимических методов показали, что в раковых клетках отсутствует функциональный белок EpoR, хотя они экспрессируют низкие уровни мРНК EPOR [16,17,25].Вопрос о том, могут ли Epo и его аналоги способствовать росту опухоли путем стимуляции ангиогенеза, находится в центре внимания настоящего исследования, на которое одни авторы отвечают утвердительно [51], а другие — отрицательно [19]. В нескольких метаанализах изучались результаты использования и безопасности ЭСС у онкологических больных. Беннет и др. [47] и Bohlius et al. [52] сообщили об отрицательном риске воздействия ЭСС на смертность, но не о том, как ЭСС влияют на прогрессирование заболевания. Мета-анализы показали, что использование ЭСС обычно не влияет на прогрессирование заболевания [53,54].Однако данные по безопасности, полученные в некоторых отдельных контролируемых исследованиях, позволяют предположить, что ЭСС могут влиять на прогрессирование заболевания и/или смертность в определенных популяциях больных раком (например, больных раком головы и шеи, получающих только лучевую терапию) [54]. Эти утверждения согласуются с результатами обновления Кокрейновского обзора 2012 года, если процитировать дословно: «Влияют ли и как ЭСС на контроль над опухолью, остается неясным. Повышенный риск смерти и тромбоэмболических осложнений следует сопоставлять с потенциальными преимуществами лечения ЭСС с учетом клинических обстоятельств и предпочтений каждого пациента» [48].

    Наконец, в отношении биофармацевтических препаратов важны чистота и иммуногенность препарата. Производство ЭСК соответствует чрезвычайно высоким биотехнологическим стандартам в большинстве регионов мира, включая Северную Америку, Европу и Японию. В этих регионах препараты, содержащие ЭСК, редко оказываются иммуногенными даже при подкожном введении. Частота нейтрализующих анти-Эпо антител (анти-ЭПО-АТ) индуцированной чистой эритроцитарной аплазии (PRCA) у пациентов с ХЗП, получавших rhEpo, в настоящее время <0.03 на 10 000 пациенто-лет [55]. Однако изменения в производственном процессе или в рецептуре ЭСС могут вызвать иммунную реакцию. Когда при подкожном введении биосимиляра эпоэтина происходила нейтрализация анти-Эпо-АТ, исследования, проведенные производителем, показали, что аномально высокие уровни вольфрама в предварительно наполненных шприцах вызывали разворачивание и агрегацию эпоэтина [56]. Следовательно, изменение типа шприцев может решить временную проблему.

    Перспективы

    Лечение анемии рекомбинантными ЭСС является дорогостоящим.Таким образом, возник вопрос, существуют ли альтернативные терапевтические варианты [57,58].

    Во-первых, существуют небольшие перорально активные химические вещества, которые предотвращают деградацию HIF-α («стабилизаторы HIF») и стимулируют эндогенную выработку Epo. Опубликовано клиническое исследование фазы I конкурента α-кетоглутарата FG-2216 (FibroGen) у пациентов с ХБП [59]. На самом деле было идентифицировано множество различных стабилизаторов HIF [5,6,60]. Однако стабилизаторы HIF индуцируют экспрессию многих генов помимо ЭПО [5,60], что может привести к нежелательным явлениям.

    Другая стратегия заключалась в замене рекомбинантных ESA на миметические пептиды Epo (EMP), синтетические циклические пептиды примерно из 20 аминокислот. EMP не обнаруживают гомологии последовательности с Epo, но передают сигнал через EpoR (рис. 2). В качестве первого ЭМП пегинесатид (Омонтис®; Аффимакс/Такеда) был одобрен в США в 2012 г. для подкожного или внутривенного лечения пациентов с ХБП на диализе. Однако препарат был отозван в начале 2013 г., поскольку у 0,2% пациентов наблюдались серьезные реакции гиперчувствительности, а у 0,02% пациентов — фатальные реакции гиперчувствительности.В альтернативном подходе EMP были сконструированы на каркасах на основе IgG человека с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Исходное соединение CNTO 528 (Centocor) повышало концентрацию гемоглобина при внутривенном введении в фазе I клинических испытаний. Было показано, что последующий продукт CNTO 530, димерный EMP, слитый с каркасом Fc IgG4 человека, расширяет пул эритроцитарных предшественников in vitro и in vivo [61]. Однако могут возникнуть сомнения относительно преимуществ этого типа биофармацевтических препаратов по сравнению с установленными ЭСС.

    Наиболее новым подходом было введение сотатерцепта (ACE-011; Acceleron Pharma/Celgene), рекомбинантного химерного белка, состоящего из внеклеточного домена рецептора активина человека типа 2A и Fc-домена IgG1 человека. Сотатерцепт связывает и инактивирует активин А. В фазе I клинических испытаний сотатерцепт вызывал дозозависимое увеличение ретикулоцитов, эритроцитов, концентрации гемоглобина и гемоглобина у здоровых женщин в постменопаузе [39]. Однако, в отличие от HIF-стабилизаторов, которые можно принимать перорально, сотатерцепт необходимо вводить инъекционно.Кроме того, следует более детально изучить иммуногенный потенциал препарата.

    Заявление о раскрытии информации

    Автор выполнял оплачиваемую роль консультанта/консультанта и получал гонорары и финансирование исследований от фармацевтических компаний, производящих и/или продающих ЭСС.

    Авторское право: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или любую систему хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
    Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности.Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством.

    0 comments on “Эритропоэз схема: Презентация на тему: «ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ АНЕМИЙ. Эритропоэз Эритропоэз

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.