Энзибен замеры сопротивления: Закажите технический отчет по замерам сопротивления изоляции

Проведение профилактических испытаний и измерений электрооборудования и электроустановок напряжением до 1000 В

Наименование Кол-во Цена за ед. Стоимость, ₽

Замеры сопротивления изоляции и измерения заземления системы электроснабжения, усл. ед

ОКПД2 71.20.13.000   Услуги в области испытаний, исследований и анализа целостных механических и электрических систем

1 усл ед

99 930,00

99 930,00

Замеры сопротивления изоляции и измерения заземления системы электроснабжения, усл. ед

ОКПД2 71.20.13.000   Услуги в области испытаний, исследований и анализа целостных механических и электрических систем

1 усл ед

99 930,00

99 930,00

Замеры сопротивления изоляции и измерения заземления системы электроснабжения, усл. ед

ОКПД2 71.20.13.000   Услуги в области испытаний, исследований и анализа целостных механических и электрических систем

5 усл ед

19 986,00

99 930,00

Замеры сопротивления изоляции и измерения заземления системы электроснабжения, усл. ед

ОКПД2 71.20.13.000   Услуги в области испытаний, исследований и анализа целостных механических и электрических систем

1 усл ед

99 930,00

99 930,00

Замеры сопротивления изоляции и измерения заземления системы электроснабжения, усл. ед

ОКПД2 71.20.13.000   Услуги в области испытаний, исследований и анализа целостных механических и электрических систем

1 усл ед

99 930,00

99 930,00

Оказание услуг по контрольному замеру заземления системы электроснабжения и измерение сопротивления изоляции проводов, кабелей и электрооборудования — Электронный аукцион №0348200054621000020 на 167575.93 руб.

Дополнительная информация

Наименование электронной площадки в сети Интернет

РТС-тендер

Адрес электронной площадки в сети Интернет

Организация, определяющая поставщика (подрядчика, исполнителя)

Организация, осуществляющая размещение

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ СОЦИАЛЬНОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «ЦЕНТР СОЦИАЛЬНО-МЕДИЦИНСКОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ ИНВАЛИДОВ И ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ «ЯСЕНКИ»

Почтовый адрес

Российская Федерация, 108832, г.Москва, поселение Вороновское, Ясенки д, -, -, —

Адрес электронной почты

[email protected]

Номер контактного телефона

7-499-5003171

Организатор

Организация, осуществляющая размещение

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ СОЦИАЛЬНОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ «ЦЕНТР СОЦИАЛЬНО-МЕДИЦИНСКОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ ИНВАЛИДОВ И ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ «ЯСЕНКИ»

Почтовый адрес

Российская Федерация, 108832, г.Москва, поселение Вороновское, Ясенки д, -, -, —

Ответственное должностное лицо

Михайлова Ольга Александровна

Адрес электронной почты

[email protected]

Номер контактного телефона

7-499-5003171

Отзывы

Отзыв об измерителе электрической емкости и тангенса угла диэлектрических потерь серии HFJS компании Hengfeng на ОРУ-750 кВ Ленинградской АЭС

Уважаемый Сергей Олегович

С весны 2021 года наша организация при проведении пусконаладочных работ использует прибор HFJS — автоматический помехоустойчивый измеритель ёмкости и тангенса угла диэлектрических потерь производства компании Hengfeng electric. За время эксплуатации данный прибор зарекомендовал себя как надежное, простое в эксплуатации устройство с удобным и интуитивно понятным управлением.

Большим преимуществом прибора HF JS является то, что он состоит из одного блока -в одном корпусе установлены мост для измерения диэлектрических потерь, источник питания с преобразователем частоты, испытательный высоковольтный трансформатор и образцовый конденсатор. Вследствие чего подготовка к проведению измерений сводится к подключению двух (или четырех) измерительных проводов к испытуемому объекту — модель, которую мы используем имеет дополнительную функцию четырехканального измерения, что позволяет одновременно измерить емкость и тангенс угла потерь, например, на вводах трёхфазного трансформатора. Различные режимы измерений, реализованные в приборе, позволяют проводить испытания без снятия ошиновки.

Прибор поставляется в комплекте со всеми необходимыми измерительными проводами. Измерительные провода очень качественные, удобные в работе и более чем достаточной длинны. В процессе проведения измерений провода и прибор не нуждаются в дополнительной изоляции или специальной укладке — нет необходимости обеспечивать исключение касания измерительных кабелей, которые будут находится под высоким напряжением (порядка 10 кВ), земли и заземленных предметов.

Точностные характеристики прибора тоже не вызывают сомнений, например, при измерении параметров ёмкостных трансформаторов напряжения TCVT 800 (750 кВ) показания прибора полностью совпали с заводскими паспортными значениями емкости и тангенса угла диэлектрических потерь. В приборе есть возможность как сохранять результаты измерений в память, так и сразу же распечатывать их на встроенном термопринтере.

Отдельно хочется отметить отличную работу ООО «Евротест» — специалистами компании перед покупкой была проведена демонстрация работы прибора на нашем объекте. Техническая поддержка в процессе эксплуатации также имеется: обратились по телефону, находясь на месте измерений, и нам сразу дали несколько полезных рекомендаций.

Планируем и в дальнейшем приобретать измерительное оборудование у компании «Евротест».

Орфография и пунктуация авторов сохранена.

Вакансии в Россия — beBee


  • ГВКР — [email protected] Vvedensky

    Удаленная работа с географическими ограничениями Фрилансер 21.000 ₽ — 43.000 ₽ бюджет

    Проводим набор внештатных сотрудников. · Обработка, редактирование, корректуры текста. · Сверка после правок. · Peдaктиpoваниe aвтopских матepиaлoв. · От Вас необходима — высокая скорость печати, внимательность, усидчивость. · Работа на результат. Заработная плата напрямую зависи …


  • ГВКР — [email protected] Kurort Удаленная работа с географическими ограничениями Фрилансер 21.000 ₽ — 43.000 ₽ бюджет

    Проводим набор внештатных сотрудников. · Обработка, редактирование, корректуры текста. · Сверка после правок. · Peдaктиpoваниe aвтopских матepиaлoв. · От Вас необходима — высокая скорость печати, внимательность, усидчивость. · Работа на результат. Заработная плата напрямую зависи …


  • ГВКР — [email protected] Kapotnya Удаленная работа с географическими ограничениями Фрилансер 21.000 ₽ — 43.000 ₽ бюджет

    Проводим набор внештатных сотрудников. · Обработка, редактирование, корректуры текста. · Сверка после правок. · Peдaктиpoваниe aвтopских матepиaлoв. · От Вас необходима — высокая скорость печати, внимательность, усидчивость. · Работа на результат. Заработная плата напрямую зависи …

  • Образец технического отчета электролаборатории | Пример оформления протоколов испытаний

    Благодарственное письмо от ГКУ Самарской области «Центр по делам ГО, ПБ и ЧС»

    Благодарственное письмо от ГБУЗ «Самарский областной клинический онкологический диспансер»

    Благодарственное письмо от ФКУ СИЗО-4 УФСИН

    Благодарственное письмо от ООО «Газпромнефть-Ямал»

    Благодарственное письмо от ООО «СДЭК-ГЛОБАЛ»

    Благодарственное письмо от ООО «ЮЖУРАЛПРОЕКТ»

    Благодарственное письмо от ООО «ПТБ «Фактор»

    Благодарственное письмо от ООО «ЗНИГО»

    Благодарственное письмо от управления Федеральной Почтовой Службы Санкт-Петербурга и Ленинградской области — филиала ФГУП «Почта России»

    Благодарственное письмо от ФКП «Аэропорты Севера»

    Благодарственное письмо от ООО «Добрый Доктор»

    Благодарственное письмо от ООО «АвтоТрансЮг»

    Благодарственное письмо от ООО «Орион Наследие»

    Благодарственное письмо от ООО «ЮгСтройКонтроль»

    Благодарственное письмо от ООО «Транснефть-Охрана»

    Благодарственное письмо от ООО «Аэропорт АНАПА»

    Благодарственное письмо от ООО «Краун»

    Благодарственное письмо от ООО «ИТЕРАНЕТ»

    Благодарственное письмо от ГБПОУ МО «Колледж «Подмосковье»

    Благодарственное письмо от ГБУ ФК «Строгино»

    Благодарственное письмо от ООО «НПО «АКЕЛЛА»

    Благодарственное письмо от филиала ПАО «РусГидро» — «Жигулевская ГЭС»

    Благодарственное письмо от «Дор Хан 21 век»

    Благодарственное письмо от «МСЧ №29 ФСИН»

    Благодарственное письмо от ФГУП «РОСМОРПОРТ»

    Благодарность от МК «ВТБ Ледовый дворец»

    Благодарственное письмо от ОАО «РАМПОРТ АЭРО»

    Благодарственное письмо от ПАО «Межгосударственная Акционерная Корпорация «ВЫМПЕЛ»

    Благодарственное письмо от ПАО «РусГидро»

    Благодарственное письмо от ООО «Новый город»

    Благодарственное письмо от ФКУЗ МСЧ-10 ФСИН России

    Благодарственное письмо от ООО «Зелдент»

    Благодарственное письмо от ГБУ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУЕЛИКИ КРЫМ «КРАСНОГВАРДЕИСКАЯ ЦЕНТРАЛЬНАЯ РАЙОННАЯ БОЛЬНИЦА»

    Благодарственное письмо от АО «Научно-исследовательский институт вычислительных комплексов им. М.А. Карцева»

    Благодарственное письмо от АО «ДХЛ Интернешнл»

    Благодарственное письмо от ООО «Специальные системы и технологии»

    Благодарственное письмо от ООО «АЛЬФА-НДТ»

    Благодарственное письмо от ООО «Международный деловой центр Шереметьево»

    Благодарственное письмо от ЧОП «АЛЬФА ПАТРИОТ»

    Благодарственное письмо от ООО «ЛИТАС РЕНТГЕН»

    Благодарственное письмо от ООО «МосРентген»

    Благодарственное письмо от ООО «Центр безопасности информации «МАСКОМ»

    Благодарственное письмо от ООО «СЛУЖБА-7»

    Измерение экспрессии и активности фермента CAT для определения устойчивости к Al в сое

    Для выяснения механизма устойчивости сои к Al были систематически проанализированы физиологические и биохимические показатели, а также экспрессия и активность антиоксидантных ферментов в Al-чувствительных (Glycine max Merr., провинция Юньнань, Китай, SB) и Al-устойчивых Dambo (Glycine max Merr. , Киото, Япония, РБ) растения черной сои. Согласно полученным результатам, содержание пероксида водорода (H 2 O 2 ) и малонового диальдегида (МДА) в кончиках корней РБ было значительно ниже, чем в кончиках корней СБ, хотя по содержанию растворимого белка наблюдались противоположные результаты.Кроме того, экспрессия и активность супероксиддисмутазы (SOD, EC 1.15.1.1.1.1.1.1 ), пероксидазы (POD, EC 1.11.1.7 ) и каталазы (CAT, EC 1.11.1.6 ) при 0- 400 мкМ Al в течение 0-96 часов были выше в RB, чем в SB. Однако ниже 100 мкМ Al активность этих ферментов в SB увеличивалась с увеличением концентрации Al и продолжительности обработки, при этом активность SOD была самой низкой, а CAT-активность превышала активность POD с увеличением концентрации Al. В целом активность фермента в SB, обработанном Al в концентрациях более 200 мкМ, была ниже, чем в контроле SB (CK; не обработанном Al), и уменьшалась с увеличением продолжительности обработки.Кроме того, при концентрациях Al ниже 200 мкМ активность ферментов в RB была значительно выше, чем в RB CK, и увеличивалась как с концентрацией Al, так и с продолжительностью лечения. Более того, активность фермента в РБ, обработанном 400 мкМ Al, была несколько выше, чем у РБ CK. Таким образом, активность CAT определяет устойчивость сои к Al. Эти результаты показывают, что устойчивость сои к алюминию можно повысить, регулируя экспрессию и активность антиоксидантных ферментов для удаления H 2 O 2 в условиях стресса, вызванного алюминием.

    Ключевые слова: Аль стресс; Каталаза; пероксидаза; Соя; Супероксиддисмутаза.

    Количественная оценка адаптивного потенциала фермента устойчивости к антибиотикам

    Abstract

    Для количественного понимания процесса адаптации нам необходимо понять его «исходный материал», то есть частоту и приспособленность полезных мутаций.В настоящее время большинство эмпирических данных свидетельствуют об экспоненциальном распределении эффектов пригодности полезных мутаций, как это предсказано для распределений области Гамбеля теорией экстремальных значений. Здесь мы изучаем распределение влияния мутаций на устойчивость к цефотаксиму (Ctx) и приспособленность 48 уникальных полезных мутаций в бактериальном ферменте TEM-1 β-лактамазе, которые были получены путем скрининга продуктов случайного мутагенеза на повышенную устойчивость к Ctx. Наш вклад тройной. Во-первых, основываясь на частоте уникальных мутаций среди более чем 300 секвенированных изолятов и с поправкой на предвзятость мутаций, мы консервативно оценили, что общее количество мутаций первого этапа, повышающих устойчивость к Ctx в этом ферменте, составляет 87 [95% ДИ 75–189]. , или 3.4% от всех 2583 возможных замен пар оснований. Из 48 мутаций 10 являются синонимичными, а большинство из 38 несинонимичных мутаций происходят в кармане, окружающем каталитический сайт. Во-вторых, мы оцениваем влияние мутаций на устойчивость к Ctx, определяя выживаемость при различных концентрациях Ctx, и получаем их эффекты приспособленности, моделируя размножение и выживание как процесс ветвления. В-третьих, мы обнаруживаем, что распределение обеих мер следует распределению типа Фреше, характеризующемуся широким хвостом из нескольких исключительно подходящих мутантов.Такое распределение имеет фундаментальные эволюционные последствия, включая повышенную предсказуемость эволюции, и может дать частичное объяснение недавним наблюдениям поразительной параллельной эволюции устойчивости к антибиотикам.

    Резюме автора

    Хотя мутации, положительно влияющие на приспособленность, встречаются редко, они вносят непропорционально большой вклад в эволюцию, потому что им благоприятствует естественный отбор. Поскольку они редки и их трудно изучать экспериментально, мало что известно о частоте и вариации эффектов полезных мутаций на приспособленность, и часто предполагается, что их эффекты подчиняются экспоненциальному распределению.Мы количественно оценили общее количество полезных мутаций и их влияние на устойчивость к ферменту, который является основной мишенью устойчивости к антибиотику цефотаксиму. Основываясь на 48 уникальных полезных мутациях, выявленных среди более чем 300 секвенированных мутантов, мы подсчитали, что по крайней мере 87 из 2583 возможных точечных мутаций (3,4%) в этом ферменте являются полезными. Мы измерили выживаемость этих мутантов в диапазоне концентраций антибиотиков и получили оценки устойчивости и приспособленности. Восстановленное распределение отличается от экспоненциального из-за присутствия нескольких мутантов с очень большим эффектом.Существование таких мутаций повысит предсказуемость адаптации и сократит длину адаптивных путей.

    Образец цитирования: Шенк М.Ф., Сендро И.Г., Круг Дж., де Виссер JAGM (2012) Количественная оценка адаптивного потенциала фермента устойчивости к антибиотикам. Генетика PLoS 8(6): е1002783. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783

    Редактор: Диармайд Хьюз, Упсальский университет, Швеция

    Получено: 27 января 2012 г.; Принято: 9 мая 2012 г.; Опубликовано: 28 июня 2012 г.

    Авторское право: © 2012 Schenk et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

    Финансирование: Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) в рамках SFB 680 «Молекулярная основа эволюционных инноваций» и Седьмой рамочной программой Европейского сообщества (FP7/2007-2013) в рамках Грантовое соглашение 225167 «e-FLUX.«Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Адаптация бесполых организмов к окружающей среде обусловлена ​​последовательной фиксацией мутаций, повышающих приспособленность. Размер эффекта полезных мутаций варьируется, и распределение полезных эффектов приспособленности (DBFE) влияет на динамику, результат и повторяемость адаптации [1]–[5].Тем не менее, мы мало знаем об относительном количестве и влиянии полезных мутаций на приспособленность по двум основным причинам. Во-первых, полезные мутации относительно редки, что усложняет эмпирические исследования, поскольку для точной оценки DBFE требуется большое количество полезных мутаций. Во-вторых, нам не хватает общей теоретической базы для понимания DBFE [6], [7]. Теория экстремальных значений (EVT) дает прогнозы для адаптации к небольшим изменениям окружающей среды. В этих условиях дикий тип имеет относительно высокую приспособленность, и полезные мутации затем извлекаются из хвоста распределения.Многие обычно встречающиеся родительские распределения (включая нормальное, гамма, экспоненциальное и логистическое распределение) относятся к области Гумбеля. Все хвосты этих распределений являются экспоненциальными, включая множество мутаций с малым эффектом и несколько мутаций с большим эффектом [6]–[8]. Поэтому модели, учитывающие эффекты полезных мутаций, часто предполагают, что это распределение является экспоненциальным [3], [6]. Предсказание экспоненциального DBFE было подтверждено эмпирически с использованием генотипов с высокой приспособленностью [9]–[11], хотя в одном исследовании было обнаружено гамма-распределение [12].Для генотипов с низкой приспособленностью нам не хватает количественного прогноза, поскольку часто EVT больше не может применяться. DBFE больше не является экспоненциальным в этих условиях и описывается распределениями, которые являются приблизительно нормальными [10], [13].

    Помимо области Гамбеля существуют две другие области притяжения, которые охватывают классы распределений с укороченными хвостами (область Вейбулла) и с тяжелыми хвостами, которые затухают по степенному закону (область Фреше) [7], [14]. Обратите внимание, что различия между тремя областями связаны с различиями в форме распределения и не подразумевают различий в абсолютных коэффициентах отбора.Хотя отклонения от домена Гамбеля считаются биологически менее вероятными [7], нет фундаментальной причины, по которой они могут не происходить [14], и поэтому сомнительно, что DBFE может быть описан общей (экспоненциальной) формой. В двух исследованиях уже наблюдались распределения с укороченными хвостами [15], [16], но нам неизвестна поддержка распределений типа Фреше. В среднем адаптивные прогулки к локальным максимумам приспособленности в области Вейбулла длиннее, чем в области Гамбеля [17]–[19], в то время как вероятность параллельной эволюции снижается [14], [20].В домене Фреше повышается вероятность закрепления наиболее приспособленных аллелей, что приближает адаптивный процесс к «жадному» пределу [17], [18], [21] и увеличивает повторяемость адаптации [14], [ 18]. Кроме того, распределение с тяжелым хвостом сокращает время фиксации полезных мутаций, тем самым смягчая последствия конкуренции между полезными мутациями (клональная интерференция) и уменьшая возможность конкуренции между клонами, несущими множественные мутации [3], [22], [23]. ].

    Мы изучаем количество и свойства адаптивных мутаций в одном белке. До сих пор эмпирические исследования DBFE основывались либо на относительно небольших наборах охарактеризованных мутаций [9]–[12], [16], либо на больших наборах нехарактерных мутаций [13], [24]. Мы используем β-лактамазу TEM в качестве модельной системы и изучаем влияние уникальных полезных мутаций на адаптацию к цефотаксиму (Ctx). В то время как исходный фермент ТЕМ-1 эффективно гидролизует несколько β-лактамных антибиотиков, он обладает беспорядочным (т.е. низкая) активность по отношению к Ctx. Несколько исследований показали, что мутанты с повышенной устойчивостью к Ctx встречаются в природе [25] или могут быть отобраны с помощью итерационных раундов случайного мутагенеза и искусственного отбора [2], [26], [27]. Эти исследования уже идентифицировали несколько полезных мутаций и высокоустойчивых мутантов с множественными мутациями, но ни одно из них не охарактеризовало полный адаптивный потенциал или форму DBFE.

    Мы используем ПЦР-мутагенез для введения случайных мутаций в TEM-1 и выбора полезных мутаций при низких концентрациях Ctx.Таким образом, мы идентифицируем 48 уникальных полезных мутаций в наборе из 864 отобранных изолятов. Общее количество возможных полезных мутаций будет выше, и мы оцениваем, что по крайней мере 3,4% из всех 2583 возможных мутаций пар оснований в кодирующей области TEM-1 являются полезными. Для каждого мутанта мы измеряем устойчивость к Ctx и делаем вывод о его приспособленности к различным концентрациям Ctx, моделируя выживание и размножение как процесс ветвления. Распределение фенотипов устойчивости относится к домену Фреше и характеризуется большим количеством мутантов с малым эффектом и несколькими исключительно подходящими мутантами.DBFE зависит от приспособленности дикого типа, и когда приспособленность дикого типа низкая (при более высоких концентрациях антибиотика), DBFE также принадлежит домену Фреше.

    Результаты

    Оценка общего количества полезных мутантов

    Клетки Escherichia coli , содержащие плазмидный TEM-1, проявляют беспорядочную активность в отношении Ctx. Мы ввели случайные мутации в TEM-1 с помощью ПЦР-мутагенеза и отобрали устойчивые бактерии при самой низкой концентрации Ctx (0.04 мкг/мл), которые продемонстрировали различия в выживаемости между библиотеками дикого типа и мутантными, чтобы свести к минимуму погрешность изоляции в отношении мутаций с небольшим эффектом (рис. 1А). Всего было собрано 864 изолята — по 72 изолята на каждую из 12 независимых ПЦР. В качестве первого скрининга изменения устойчивости к Ctx мы определили минимальную ингибирующую концентрацию Ctx (MIC) для каждого изолята. Значения МИК для изолятов варьировались от 0,08 до более чем 2,56 мкг/мл, частично демонстрируя совпадение с МИК дикого типа (рис. S1).На распределение значений МИК влияет наличие изолятов с аллелем ТЕМ-1 (которые имеют пониженную, но положительную вероятность выживания при 0,04 мкг Ctx/мл), спонтанные резистентные мутации в бактериальной хромосоме, аллели, содержащие множественные мутации и мутационным смещением ДНК-полимеразы, используемой для мутагенеза (таблица S1). Чтобы избежать всех этих возможных источников смещения, мы сосредоточимся на уникальных мутантах TEM для определения DBFE.

    Рисунок 1. Выживание E.coli и распределение минимальных ингибирующих концентраций Ctx.

    (A) Выживание клеток E. coli с плазмидной TEM β-лактамазой при различных концентрациях Ctx. Концентрации Ctx нанесены на график в масштабе log 2 . Выживаемость представлена ​​как доля выживших клеток (± SD) по шкале log 10 . Сравнение клеток, несущих плазмиды pACTEM1, и плазмид из библиотек, полученных с помощью подверженной ошибкам ПЦР. В среднем на один ампликон вносили 0,6 ошибки.(B) Распределение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) Ctx для изолятов с уникальной полезной мутацией в ТЕМ ( n  = 48) и скорректированное распределение, учитывающее предполагаемое общее количество полезных мутаций ( n = 87, см. табл. 1). Концентрации Ctx нанесены на график в масштабе log 2 .

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.g001

    Мы использовали коллекцию из 864 изолятов для оценки общего количества полезных замен пар оснований в три этапа.Во-первых, мы секвенировали аллели TEM 310 изолятов, балансируя усилия по шести категориям MIC (таблица S2). Во-вторых, мы обнаружили 52 уникальных одиночных мутанта и определили, какие из них имели значительное преимущество, оценив их влияние на устойчивость к Ctx после переноса мутантного аллеля в наивный вектор и хозяина (т.е. взятые из необработанных замороженных запасов). Чувствительная непрерывная мера устойчивости Ctx была получена путем оценки концентрации Ctx, при которой фракция 10 -4 клеток образует видимую колонию, называемую ингибирующей концентрацией, убивающей 99.99% (IC99,99, рис. S2). Используя двусторонние тесты t и последовательную коррекцию Бонферрони, мы обнаружили, что преимущество каждого из 48 мутантов с IC99,99 выше, чем у TEM-1, было значительным (таблица S2). В-третьих, мы попытались оценить общее количество полезных мутаций. Основываясь на количестве уникальных полезных мутаций по отношению к количеству секвенированных изолятов в каждой категории MIC, можно получить оценку максимального правдоподобия (ML) общего количества полезных мутаций в каждой категории MIC вместе с 95% доверительным интервалом (таблица 1). ; см. Материалы и методы).Если также принять во внимание наблюдаемую мутационную предвзятость полимеразы (таблица S1), по оценкам, существует не менее 87 полезных мутаций (95% ДИ 75–189). Оценки ML предполагают, что самые высокие категории MIC (1,28 и ≥2,56) были отобраны исчерпывающим образом, в то время как наши записи неполны для самых низких категорий MIC. Таким образом, исправление отсутствующих мутаций смещает распределение значений MIC в сторону мутаций с небольшим эффектом (рис. 1B). Обратите внимание, что примененная процедура дает консервативную оценку общего количества полезных мутаций из-за возможных различий в вероятностях наблюдения среди мутантов (см. Материалы и методы).

    Характеристики мутаций

    48 идентифицированных полезных мутаций были локализованы в 32 из 291 положения аминокислот (рис. 2А). Полипептид ТЕМ состоит из сигнального пептида и зрелого белка. Большинство мутаций ( n  = 41) локализовано в зрелом белке, а семь мутаций локализованы в сигнальном пептиде. Примечательно, что 10 из 48 мутаций являются синонимичными мутациями. Мутации в зрелом белке (средняя IC99,99 = 0.160 мкг Ctx/мл) оказывали значительно больший эффект на устойчивость, чем сигнальный пептид (IC99,99 = 0,078 мкг Ctx/мл; две пробы t  = 3,520, df = 46, двусторонние P  = 0,0010), а несинонимичные мутации (IC99,99 = 0,166 мкг Ctx/мл) оказывали значительно больший эффект, чем синонимичные мутации (IC99,99 = 0,081 мкг Ctx/мл; t  = 3,238, df = 46, два хвостатый P  = 0,0022). Несколько кодонов привели к множеству полезных мутаций. Особенно выделялись кодоны E104, G238, E240 и R241, в которых три-четыре из пяти-шести доступных замен аминокислот повышали устойчивость к Ctx.Среднее улучшение резистентности на кодон положительно зависело от количества наблюдаемых адаптивных мутаций на кодон ( F 1,46  = 26,968, P <0,001).

    Рисунок 2. Количество наблюдаемых полезных мутаций на кодон и величина эффекта полезных замен.

    (A) Количество наблюдаемых полезных мутаций на кодон. Обратите внимание, что нумерация основана на консенсусной последовательности β-лактамазы класса А и что кодоны 1, 2, 239 и 253 отсутствуют в TEM.Зеленые столбцы представляют собой синонимичные мутации, а синие столбцы — несинонимичные мутации. (B) Величина эффекта полезных замен нанесена на карту кристаллической структуры TEM-1. Цвета указывают на увеличение устойчивости Ctx по сравнению с TEM-1, вызванное мутацией с наибольшим размером эффекта в каждом положении. На вставке показана та же структура, повернутая по горизонтали на 180°.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.g002

    Кластеризация мутаций становится еще более очевидной из их положения в третичной структуре зрелого белка (рис. 2B).Каталитический остаток серина (S70) расположен между доменом, состоящим из пяти β-слоев, упакованных против трех α-спиралей, и доменом, состоящим из восьми α-спиралей. За исключением E197V и A227T, все аминокислотные замены расположены в оксианионном кармане, окружающем каталитический центр, или на петлях у входа в этот карман. Большинство мутаций расположено в Ω-петле и шарнире между β-листами S3 и S4, которые расположены прямо напротив друг друга и содержат 10 и 13 мутаций соответственно.Восемнадцать из несинонимичных мутаций, насколько нам известно, никогда не были идентифицированы, тогда как двадцать ранее встречались в клинических изолятах или в экспериментах по направленной эволюции (таблица S2; рассмотрено в [25]). Набор новых мутаций включает в основном мутации с малым эффектом, но также включает R241P, который занимает третье место по размеру эффекта. Три из 10 синонимичных мутаций ранее были обнаружены в клинических изолятах (таблица S2).

    Распределение эффектов сопротивления

    48 полезных мутантов показали существенные различия в устойчивости к Ctx (IC99.99). Устойчивость варьировалась от 0,055 до 1,410 мкг Ctx/мл, где устойчивость TEM-1 составляет 0,052 [SD = 0,0010] мкг Ctx/мл. Однако устойчивость ТЕМ-1 все еще значительно выше, чем у бактерий, несущих ту же плазмиду без ТЕМ-1 (IC99,99 = 0,033 [SD = 0,0034] мкг Ctx/мл; две пробы t  = 8,627, df = 7 , двусторонний P <0,0001), что указывает на то, что также возможны вредные мутации.

    Чтобы определить форму распределения эффектов резистентности полезных мутаций (рис. 3А), мы подогнали данные к обобщенному распределению Парето (GPD).GPD представляет собой распределение с асимметрией вправо, параметризованное параметром масштаба τ и параметром формы κ , которое может моделировать хвосты самых разных распределений. Параметр формы определяет, принадлежит ли хвостовое распределение к области распределений с экспоненциальными хвостами ( κ  = 0; область Гамбеля), усеченными хвостами ( κ <0; область Вейбулла) или тяжелыми хвостами, затухающими по степенному закону ( κ >0; домен Фреше). Наши оценки κ ( κ e ) обычно находятся между 0.5 и 1 (рис. 3B), что указывает на то, что распределение принадлежит домену Фреше. EVT можно применять только тогда, когда наблюдаемые значения берутся из хвоста распределения. В этом можно убедиться, постепенно удаляя мутации с левой стороны хвоста; когда κ e не меняется в ходе этой процедуры, это свидетельствует о том, что DBFE соответствует хвосту некоторого распределения. Оценка κ e является примерно постоянной при рассмотрении наиболее подходящих мутаций от 48 до 20 (рис. 3B и 3C) и становится нестабильной после этой точки из-за небольшого количества точек данных.Тест отношения правдоподобия показывает, что κ e отличается от гипотезы домена Гумбеля ( κ = 0 ) с достоверностью более 95% для n >15 (рис. 3C).

    Рисунок 3. Анализ распределения и вероятности.

    (A) Распределение уровней устойчивости к Ctx (IC99.99) 48 полезных мутантов. (B) Вероятностный анализ предполагаемого параметра формы ( κ e ). κ e представляет собой график зависимости числа полезных мутантов (ранжированных по их эффекту), которые были включены для оценки ( n ) с использованием порога пригодности ( w c ).Поскольку каждое значение n соответствует диапазону значений w c , существует также диапазон κ e , связанный с каждым n . Штриховая линия соответствует κ  = 0. κ e значительно выше нуля во всем изображенном диапазоне, что позволяет предположить, что распределение принадлежит области Фреше. ( C ) Значение P , соответствующее гипотезе κ  = 0, нанесено на график против n .Для всех вариантов w c и n >14 нулевая гипотеза может быть отвергнута с достоверностью более 95%, как показано пунктирной линией.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.g003

    Мы проверили, являются ли результаты надежными в отношении критерия, используемого для расчета уровней устойчивости, и зависят ли они от наличия конкретных мутаций. Используя тот же анализ для концентрации Ctx, где выживают фракции 10 -2 , 10 -3 и 10 -5 клеток, мы подтвердили, что κ e находится в домене Фреше, независимо от того, дробь использовалась для расчета уровней сопротивления (рис. S3).Известно, что оценка ML для GPD чувствительна к отдельным мутациям с исключительно высоким уровнем устойчивости [28]. В нашем наборе данных мутант G238S намного лучше подходит, чем любая другая мутация, и мы повторно провели анализ без этого мутанта (рис. S4). Хотя κ e ниже без G238S, он все еще находится в области Фреше. Наконец, мы также оценили κ , включив для анализа только несинонимичные мутации в зрелом белке, и снова подтвердили отказ от Gumbel в пользу домена Фреше (рис. S5).Количество синонимичных мутаций было слишком мало, чтобы провести аналогичный анализ этого подмножества.

    Распространение фитнес-эффектов

    Доля клеток, которые вырастают в видимую колонию ( P sur ) при каждой концентрации Ctx (используется для оценки IC99,99), также может быть использована для оценки эффектов приспособленности 48 полезных мутантов в присутствии Ctx. . Моделируя размножение и выживание как процесс ветвления, мы можем оценить вероятность того, что отдельная клетка доживет до следующего поколения ( p ) от P до (см. Материалы и методы).Когда клетка доживает до следующего поколения, она делится, и ожидаемое число потомков составляет 2 p , что эквивалентно приспособленности Райта W . Затем коэффициент селекции s рассчитывается как W i / W 0 –1, где W i и W 0 соответствуют мутантам дикого типа и W 0 соответственно. . Поскольку мы предполагаем, что антибиотик не влияет на рождаемость (время генерации), W имеет верхнюю границу 2, а коэффициент отбора ограничен значениями от 0 до 1.

    В принципе, мы можем определить коэффициенты селекции только в условиях, которые допускают некоторое выживание дикого типа (т. е. до 0,08 мкг Ctx/мл). Чтобы расширить наши анализы до более высоких концентраций, мы вместо этого рассчитываем коэффициенты отбора в отношении наименее подходящего полезного мутанта при 0,02, 0,04, 0,08 и 0,16 мкг Ctx/мл. Оценки κ для распределения коэффициентов отбора (рис. 4А) позволяют предположить, что форма распределения зависит от концентрации Ctx: при 0.02 мкг/мл, κ e — отрицательный результат, что свидетельствует об усеченном хвосте (домен Вейбулла) — хотя его нельзя отличить статистически от 0 (домен Гумбеля), в то время как при концентрациях 0,04 мкг/мл и выше κ e является значительно положительным, предполагая тяжелый хвост (домен Фреше; рис. 4B и 4C). Наша интерпретация этих результатов заключается в том, что при низкой концентрации Ctx на DBFE влияет верхний предел 1, установленный для с , и только при более высоких концентрациях Ctx он может проявлять свою неограниченную форму.Поскольку в других исследованиях сам P sur использовался в качестве показателя приспособленности, мы также рассмотрели его распределение (рис. S6), точнее, DBFE, соответствующий , где вероятность наблюдения наименее подходящего полезного мутанта. Эта оценка дает очень большие коэффициенты отбора, но также поддерживает Фреше для концентраций Ctx выше 0,04 мкг/мл.

    Рисунок 4. Распределение коэффициентов отбора, анализ правдоподобия и P -значение.

    (A) Распределение коэффициентов отбора ( s ) 48 полезных мутаций для четырех низких концентраций Ctx, как выведено из данных о выживании с использованием модели ветвления. Вертикальные пунктирные линии показывают границы между логарифмическими интервалами, используемыми в анализе. Распределение смещается в сторону меньших значений с по мере увеличения концентрации антибиотика, при этом группа очень приспособленных мутантов сохраняется вблизи максимального коэффициента отбора с  = 1.(B) Вероятностный анализ предполагаемого параметра формы ( κ e ) для четырех распределений. Оценка ML κ e построена в зависимости от числа полезных мутантов, которые были включены для оценки ( n ) с использованием порога приспособленности ( w c ). Поскольку каждое значение n соответствует диапазону значений w c , существует также диапазон κ e , связанный с каждым n .(C) P -значение, соответствующее гипотезе κ  = 0, нанесено на график относительно n . Нулевая гипотеза может быть отвергнута с достоверностью более 95% для точек данных под пунктирной линией. Все панели соответствуют N lim  = 100000 бактерий и T exp  = 40 поколений. См. Рисунок S7 для аналогичного анализа, где T exp  = 40 поколений и N lim  = 1024 бактерии.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.g004

    Обсуждение

    Мы изучили адаптивный потенциал фермента TEM-1 β-лактамазы в новой среде. Мы создали случайные мутации, оценили общее количество полезных мутаций и определили распределение их влияния на устойчивость и приспособленность Ctx. Мы охарактеризовали 48 полезных мутаций, и наш статистический анализ показывает, что по крайней мере 3,4% всех мутаций являются полезными в экспериментальных условиях, значительная часть которых является синонимичными мутациями.Мы также обнаружили, что распределение эффектов резистентности и приспособленности этих мутаций принадлежит области Фреше распределений с тяжелыми хвостами.

    Хотя адаптивный потенциал, который мы оцениваем для β-лактамазы TEM-1, высок, реальное количество полезных мутаций, вероятно, даже выше, поскольку наши оценки консервативны. Другие недавние исследования также обнаружили частоту полезных мутаций порядка 1–10% [3], [12], [24], [29], [30]. Следует учитывать, что ТЕМ является известной мишенью резистентности Ctx [2], [26], [27] и уже обладает беспорядочной активностью по отношению к этому антибиотику, что является важной предпосылкой для успешной направленной эволюции [31].В процессе направленной эволюции выполняются итеративные раунды мутагенеза и искусственного отбора. Разница с нашим исследованием в основном заключается в том, что мы заинтересованы в характеристике полного адаптивного потенциала фермента, включая полезные мутации с небольшим эффектом, тогда как исследования направленной эволюции смещены в сторону обнаружения мутаций с большим эффектом, а также функциональных комбинаций мутаций. Как следствие, 18 из 38 несинонимичных мутаций, которые мы идентифицировали, являются новыми, включая мутации с большим эффектом (см. Таблицу S2).Протоколы направленной эволюции иногда допускают одновременный отбор нескольких мутаций. Эти протоколы были также применены к TEM [2], [26], [27], но тогда неясно, полезны ли идентифицированные мутации на фоне дикого типа или только тогда, когда присутствуют определенные другие мутации. При каждой фиксации мутационное соседство меняется, тем самым открывая доступ к мутациям, недоступным для исходного фона [32], и препятствуя доступу других за счет знаковых эпистатических взаимодействий [2], [4].Это, например, верно для компенсаторных мутаций, таких как M182T и T265M, которые восстанавливают стабильность ферментов, которые стали нестабильными в результате мутаций, повышающих активность [33]–[35], но не являются полезными на стабильном фоне дикого типа. . Хотя эпистаз влияет на идентичность мутаций, которые полезны при каждом изменении генетического фона, DBFE может оставаться незатронутым [36]. Это важная тема для будущих исследований.

    Полезные мутации, повышающие устойчивость Ctx, либо увеличивают концентрацию правильно свернутого фермента, либо активность на молекулу и могут влиять на оба аспекта противоположным образом [35], [37].Мутации в сигнальном пептиде и синонимичные мутации, вероятно, будут увеличивать уровни фермента. Например, известно, что мутация Q6R повышает уровень периплазматической экспрессии TEM [38]. Синонимичные мутации могут продлевать период полураспада мРНК [39], способствовать правильному фолдингу и экспорту белка [40] или влиять на стабильность и трансляцию мРНК [41]. Интересно, что Lind et al. [42] показали, что распределение эффекта приспособленности вредных мутаций в рибосомных белках не различается для синонимичных и несинонимичных мутаций, тогда как Lalic et al. [30] также идентифицировал множественные синонимичные мутации среди мутаций, которые расширили круг хозяев для растительного вируса. Мы обнаружили, что форма распределения существенно не изменилась при исключении синонимичных мутаций, в то время как синонимичные мутации в среднем оказывали меньшее влияние на устойчивость к Ctx, чем несинонимичные мутации. Вакуленко и др. [43] показали, что низкая активность TEM-1 вызвана стерическими затруднениями из-за громоздких боковых групп современных цефалоспоринов, таких как Ctx.Большинство идентифицированных замен располагалось в непосредственной близости от каталитического центра в оксианионной полости или на петлях у входа в эту полость (рис. 2Б). Это указывает на то, что они либо имеют специфическое взаимодействие с субстратом Ctx, либо увеличивают полость, как предполагалось для мутаций R164S и G238S [2], [43], [44].

    Мы представили новую процедуру определения пригодности на основе выживаемости бактериальных клеток при различных концентрациях Ctx. В предыдущих исследованиях были предприняты попытки оценить преимущества приспособленности мутаций устойчивости к антибиотикам с использованием тестов конкуренции или измерения скорости роста [10], [45], [46], но эти измерения обычно требуют значительных усилий и больших ошибок измерения (но ср.[42]). Мы количественно оценили вероятность того, что одна клетка образует видимую бактериальную колонию, моделируя размножение и выживание каждого поколения клеток как процесс ветвления. Преимущество этой процедуры заключается в том, что каждая выжившая колония вносит свой вклад в совокупную оценку вероятности выживания на поколение клеток. Потенциальным ограничением текущего подхода является предположение, что на приспособленность влияют только различия в выживаемости, а не различия в частоте рождений (т.е. время поколения).Наше предположение подтверждается Negri et al. [45], которые заметили, что начальная скорость роста не различалась между разными мутантами TEM. Тем не менее будет интересно сравнить оценки приспособленности, полученные с помощью нашего метода, с оценками, полученными другими методами, такими как прямые соревнования, и подтвердить предположение, лежащее в основе нашей процедуры.

    Результаты нашего исследования в сочетании с предыдущими исследованиями формы DBFE показывают, что DBFE в общем случае не может быть описана экспоненциальным распределением.Вместо этого его форма будет варьироваться в зависимости от организмов и окружающей среды. В настоящее время известны примеры для всех областей универсальности (Гумбеля, Вейбулла и Фреше). Большинство исследований столкнулись с экспоненциальным DBFE [9]–[11], в двух исследованиях наблюдались распределения с усеченными хвостами [15], [16], а наше исследование впервые обнаружило, что эффекты полезных мутаций следуют распределению, которое принадлежит в область Фреше. Лалик и др. [30] недавно сообщил о DBFE для РНК вируса растений, который лучше всего соответствует распределению Парето, члену класса EVT Фреше.Однако их распределение было основано на эффектах 20 случайных мутаций и, возможно, включало вредные мутации, в то время как их предполагаемая оценка параметра формы κ была очень маленькой ( κ ≈0,045), что делает маловероятным, что домен Гумбеля мог быть отклонены со статистической достоверностью. Также в нашем случае форма распределения зависит от условий окружающей среды: мы наблюдали распределения с тяжелыми хвостами при высоких концентрациях Ctx, но обнаружили усеченный или экспоненциальный хвост при самых низких концентрациях Ctx, где приспособленность дикого типа была высокой.Маклин и Баклинг [10] также обнаружили, что DBFE зависит от приспособленности дикого типа. Они проверили DBFE 15 полезных мутантов в rpoB при различных концентрациях рифампицина и смогли отвергнуть экспоненциальную нулевую гипотезу при высоких концентрациях. Однако они не оценили параметр формы κ GPD.

    Организующим принципом, который может помочь объяснить вариации наблюдаемых DBFE, является вариация плейотропных ограничений, связанных с изученными полезными мутациями.Мутации, повышающие устойчивость к антибиотику, также влекут за собой затраты на приспособление из-за плейотропного воздействия на другие клеточные функции, что часто делает их пользу обусловленной наличием антибиотика [47]. Фермент, выбранный нами для нашего исследования, может быть в этом отношении нетипичным, так как единственная каталитическая активность β-лактамаз связана с гидролизом β-лактамов [48], а резистентность к другим антибиотикам часто обусловлена ​​изменением структурных или метаболических компонентов, которые мишенью антибиотика [47].Можно предположить, что плейотропные ограничения, возникающие при адаптации специализированного фермента, отличаются от ограничений, связанных с адаптацией компонента с существующей функцией, хотя в каком отношении менее ясно. Ограниченные плейотропные ограничения согласуются с наличием нескольких исключительно подходящих мутантов в нашей системе и поддержкой, которую мы нашли для распределения типа Фреше. Однако может быть наивным думать, что плейотропные ограничения меньше для нашего фермента, потому что как внутренние ограничения, противодействующие воздействиям на ферментативную активность и стабильность, так и внешние ограничения из-за негативных эффектов высоких концентраций периплазматических ферментов, препятствующих поглощению питательных веществ, и белковых агрегатов. и может произойти связанное с этим привлечение ограничивающих шаперонов [35], [37].

    Наше наблюдение, что полезные мутации следуют распределению Фреше, имеет значение для повторяемости и динамики адаптации, в частности, в контексте устойчивости к антибиотикам [47]. Распределения Фреше характеризуются множеством мутаций с малым эффектом и «тяжелым хвостом» с несколькими мутациями с исключительно большим эффектом. Существование этих последних мутаций увеличивает краткосрочную вероятность параллельной эволюции, которую можно количественно определить как вероятность P 2 (n) того, что две повторяющиеся популяции фиксируют одну и ту же мутацию из n доступных полезных мутаций. .Когда DBFE находится в домене Гумбеля, P 2 ( n ) = 2/( n +1), что примерно вдвое превышает нейтральное значение [20]. При умеренном отклонении от области Гумбеля в область Фреше P 2 ( n ) по-прежнему пропорциональна 1/ n , но с коэффициентом, возрастающим с увеличением κ и расходящимся при κ 6 . = ½, где распределение перестает иметь конечный второй момент [14]. При ½< κ < 1 вероятность параллельной эволюции убывает медленнее с числом соседних генотипов как 1/ n −(1/ κ −1) [J.Krug, неопубликовано], а адаптация становится еще более детерминированной для κ >1, когда P 2 ( n ) приближается к отличной от нуля константе P 2  = 9076 и [Дж. Круг, неопубликовано; [49]]. Точно так же вероятность P max того, что мутация с наибольшим эффектом зафиксирована, приближается к постоянному значению, ограниченному снизу величиной P 2 [J. Круг, неопубликовано; [49]].Чтобы проиллюстрировать это, оценки P 2 и P max были получены из экспериментально определенных коэффициентов отбора. Обе меры воспроизводимости монотонно увеличиваются с увеличением концентрации Ctx, а для концентраций выше 0,04 мкг Ctx/мл повторяемость намного выше, чем предсказано для класса Gumbel (таблица S3 и рисунок S8). Эти результаты, по крайней мере качественно, согласуются с недавним наблюдением, что 10 из 12 реплик линий β-лактамазы TEM-1, адаптирующихся к Ctx, заменяют G238S, мутацию с наибольшим эффектом из нашей группы из 48, в качестве первой мутации [2]. ], а также сообщением о замечательной параллельной эволюции в сторону устойчивости к триметоприму [1].

    Форма DBFE также влияет на продолжительность адаптивных обходов. Предполагая максимально неровный, некоррелированный ландшафт приспособленности, недавние теоретические исследования показали, что среднее количество адаптивных шагов, необходимых для достижения локального максимума приспособленности, увеличивается логарифмически с начальным рангом приспособленности, когда κ <1, но становится независимым от этого количества, когда κ >1 [17]–[19]. В крайнем домене Фреше ( κ >1) мутация с наивысшей приспособленностью, скорее всего, будет зафиксирована на каждом этапе, поэтому блуждание фактически становится «жадным» и обычно завершается после небольшого числа замен [21].Таким образом, DBFE с тяжелым хвостом обеспечивает возможное объяснение коротких адаптивных блужданий, наблюдаемых в недавних экспериментах [50], [51]. Наконец, очень приспособленные мутанты, находящиеся в широком хвосте распределения, могут быстро закрепиться и вытеснить мутантов с меньшим эффектом. Это смягчает последствия конкуренции между полезными мутациями (клональная интерференция) и, в частности, снижает вероятность накопления нескольких полезных мутаций на одном и том же генетическом фоне во время выборочного сканирования [3], [22], [23].Учитывая эти разнообразные и фундаментальные последствия, крайне важно понять условия, которые приводят к возникновению DBFE типа Фреше.

    Материалы и методы

    Бактериальный штамм и плазмиды

    Escherichia coli штамм DH5 α E использовали в качестве хозяина для всех плазмид. TEM-1 амплифицировали из pBR322 и клонировали в плазмиду pACSE3 с получением pACTEM1 [26]. Эта плазмида несет ген устойчивости к тетрациклину; мы добавили 15 мкг тетрациклина/мл во все культуры, чтобы обеспечить их сохранность.Культуры выращивали при 37°С. Экспрессия аллелей TEM контролируется промотором pTac , который, в свою очередь, регулируется lac-репрессором, кодируемым геном lacI на pACSE3. Экспрессию аллелей TEM индуцировали добавлением 50 мкМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) [26].

    Мутагенез

    Мы ввели случайные мутации в TEM-1, используя набор случайного мутагенеза GeneMorph II (Stratagene) и праймеры P3 (TCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA) и P4 (ACTCTCTTCTCCGGGCGCTATCAT), которые фланкируют сайт множественного клонирования pACSE3.Условия мутагенеза были изменены для индуцирования ~0,6 мутаций на ампликон путем использования 100 нг матрицы и замены одной двадцатой полимеразы Mutazyme II полимеразой Pfu (Stratagene). Программа циклирования состояла из: денатурации при 95°С в течение 2 мин, 30 циклов денатурации (30 сек при 95°С), отжига (30 сек при 60°С) и удлинения (75 сек при 72°С) с последующим заключительным этапом при 72°С в течение 10 мин. Замены, возникающие в начале реакции ПЦР, преобладают в конечной смеси из-за разветвленного характера процесса амплификации [52].Для увеличения разнообразия мутаций мы провели двенадцать независимых ПЦР.

    Непосредственное мутационное соседство (т.е. расстояние Хэмминга = 1) TEM-1 содержит 2583 точечных мутанта (исключая вставки и делеции). Учитывая среднюю наблюдаемую мутационную нагрузку ~ 0,6 ошибки на последовательность (на основе секвенирования 24 невыбранных трансформантов) и ~ 10 6 трансформированных клеток на библиотеку, можно ожидать, что все 2583 одноэтапных мутанта присутствуют в смеси для трансформации по крайней мере однажды (http://guinevere.otago.ac.nz/cgi-bin/aef/pedel.pl, [53]), но значительная часть ампликонов не содержит или содержит множественные мутации.

    Выделение мутантов с повышенной устойчивостью к Ctx

    Ампликоны

    очищали с использованием набора для очистки ПЦР GenElute (Sigma-Aldrich) в соответствии с инструкциями производителя. Ампликоны расщепляли рестрикционными ферментами BspHI и SacI (New England Biolabs), очищали, лигировали в pACSE3 с использованием ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs), а затем электропорировали в DH5 α E.Исходную плазмиду pACTEM1 также подвергали электропорации в DH5 α E. Клетки восстанавливали в среде SOC (20 мкг триптона и 5 г дрожжевого экстракта/литр, снабженные 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgSO 4 , 10 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы) в течение 60 минут.

    Для отбора мутантов с повышенной устойчивостью к Ctx (Sigma-Aldrich) по сравнению с TEM-1 мы сначала определили, при какой концентрации Ctx pACTEM1 ( n  = 4) и мутантные библиотеки ( n  = 12) дают жизнеспособные колонии.Сразу после восстановления три аликвоты из каждой смеси трансформации распределяли на чашках с агаром LB без Ctx — для определения количества трансформантов в библиотеке — и на чашках с агаром LB с двукратным увеличением концентрации Ctx в диапазоне от 0,01 до 0,64 мкг/мл. . Планшеты инкубировали (40 ч), и подсчет колоний определял размер библиотеки и выживающую фракцию при каждой концентрации Ctx. Самая низкая концентрация, при которой pACTEM1 явно демонстрировала снижение выживаемости, составляла 0,04 мкг Ctx/мл (рис. 1).Для всех 12 библиотек мы впоследствии выбрали случайную выборку из 72 колоний из чашек с 0,04 мкг Ctx/мл. В сумме это составляет 864 клона, которые выращивали в течение ночи (0/N) в титрационных микропланшетах со средой LB. Десятипроцентные запасы глицерина всех изолятов хранили при -80°С.

    Предварительный скрининг с помощью анализа МИК

    Чтобы определить, какие классы резистентности Ctx присутствовали среди изолятов, мы сначала провели скрининг всех изолятов, измерив минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) с использованием метода разведения в бульоне.Перед скринингом культуры реанимировали путем разбавления их 1:100 в среде LB тетрациклином и выращивали O/N. Затем культуры повторно разбавляли до титра ~10 5 клеток/мл в свежей среде LB в серии микротитровальных планшетов с двукратным увеличением концентрации Ctx в диапазоне от 0,01 до 2,56 мкг/мл. Культуры инкубировали и устанавливали МИК как наименьшую концентрацию Ctx, которая не давала видимого роста. Обратите внимание, что во время процедуры отбора могли произойти спонтанные мутации вне гена TEM-1.Они не были исключены до анализа MIC и могут частично объяснить присутствие выживших с аллелем дикого типа при высоких концентрациях Ctx.

    Секвенирование и картирование мутаций

    Для выявления мутаций в TEM мы амплифицировали этот ген с использованием полимеразы Pfu и пары праймеров P3–P4. Продукты ПЦР секвенировали с помощью набора для секвенирования BigDye. Для получения сбалансированной выборки мы разделили все изоляты на шесть классов в соответствии с их МИК (0,08, 0,16, 0,08).32, 0,64, 1,28 и ≥2,56 мкг Ctx/мл). Мы продолжали секвенирование до тех пор, пока не идентифицировали 36 последовательностей с одной заменой в каждом классе MIC, сбалансированных по 12 повторным реакциям ПЦР. Двойные мутанты и последовательности дикого типа (TEM-1) исключали из дальнейшего исследования. Кроме того, мы секвенировали десять колоний из библиотек pACTEM1, которые выжили на чашках с 0,08 мкг Ctx/мл, чтобы проверить наличие спонтанных мутаций в TEM-1, которых не было. Последовательности анализировали с использованием программного обеспечения MEGA.Мутации нумеровали по Ambler et al. [54]. Замены аминокислот были нанесены на карту кристаллической структуры TEM-1 в PyMOL [55] с использованием координат структуры дикого типа (идентификатор банка данных белков: 1ZG4).

    Анализ устойчивости

    Уровни устойчивости к

    Ctx всех уникальных мутантов оценивали путем определения выживаемости на чашках с агаром в присутствии Ctx. Чтобы исключить спонтанные мутации в фоне E. coli или в плазмиде (вне TEM), мы лигировали секвенированные продукты ПЦР обратно в pACSE3 и электропорировали плазмиды в новую партию DH5 α E.Для каждого мутанта высевали от двух до четырех повторных культур в соответствующих разведениях на серию чашек с агаром LB с двукратным увеличением концентрации Ctx в диапазоне от 0,01 до 5,12 мкг/мл. После 40 часов инкубации количество колоний сравнивали с эффективным размером библиотеки, чтобы определить долю клеток, дающих видимые колонии при каждой концентрации Ctx. Уровень устойчивости (IC99,99) определяли как концентрацию Ctx, при которой фракция 10 -4 клеток образует видимую колонию.Это значение было рассчитано линейной интерполяцией по двум соседним точкам данных. Пороговое значение 10 -4 клеток было выбрано на основании обильного появления мутаций хромосомной резистентности в OmpF , которые, как известно, встречаются с частотой 10 -5 [45], [56]. Значения MIC и IC99,99 для 52 изолированных мутантов с одной мутацией сильно коррелировали ( r  = 0,90, n = 50, P <0,001).

    Статистические процедуры

    Мы оценили, сколько мутантов было пропущено в нашей процедуре выделения, адаптировав процедуру, описанную в [57].Когда все мутаты имеют равные вероятности наблюдения, вероятность наблюдать N Уникальные мутанты из общего количества N Существующие мутанты в K Picks, P N [ x K = N ] , можно рассчитать аналитически. Поскольку k и n получены из экспериментов, можно рассчитать наиболее вероятное значение N с помощью анализа максимального правдоподобия (ML), запросив P N [ X k =  n ] быть максимальным при наиболее вероятном N , N ML .Соответствующий 95% доверительный интервал получается путем вычисления значений N ci , для которых сумма вероятностей меньше или больше 0,025 и 0,975 соответственно. Учитывая потенциальные различия в вероятности обнаружения между мутациями с большим и малым эффектом, мы провели отдельный анализ для шести классов MIC. Предполагая равные вероятности наблюдения для всех мутантов в классе MIC и выделяя три трансформанта на категорию MIC из одной и той же библиотеки, мы можем ввести систематическую ошибку, которая увеличивает количество идентичных мутантов; поэтому наша оценка общего числа мутантов является консервативной.

    Мы проверили, имеют ли 52 уникальных мутанта значительно более высокий фенотип устойчивости (IC99.99), чем TEM-1, используя двусторонние тесты t с двумя образцами. Это оставляет открытой возможность для мутантов, менее устойчивых, чем TEM-1, которых мы обнаружили четыре (таблица S2). Поскольку дисперсия и среднее значение наших оценок IC99,99 имели сильную положительную корреляцию ( r  = 0,904), все t -тестов и регрессий были выполнены с использованием log(IC99,99), который гомогенизировал дисперсию и удалил положительную корреляцию. ( р  = −0.030).

    Обобщенное распределение Парето

    Чтобы присвоить форму DBFE области распределений экстремальных значений, мы подобрали обобщенное распределение Парето (GPD) к полученным данным, используя процедуру максимального правдоподобия (ML), по существу следуя процедуре в [58]. GPD характеризуется параметром масштаба τ и параметром формы κ . Подгонка дает оценку для κ ( κ e ), значение которого приписывает распределение одному из трех доменов универсальности [59].GPD задается следующим образом: GPD описывает ограничивающее поведение хвоста, которое, как ожидается, будет видно выше определенного порога ( w c ). Если данные соответствуют хвосту некоторого распределения, сдвиг порога сдвигает параметр шкалы на , но не затрагивает оценку для κ . Хотя приспособленность дикого типа кажется «естественным» порогом, иногда предпочтительнее более высокий порог. Например, Beisel и др. [58] предложил использовать приспособленность полезного мутанта с наименьшим эффектом как w c .Это было сделано, чтобы устранить ошибку, возникающую из-за пропуска мутаций с небольшим эффектом, и позволить анализ мутаций с приобретением функции. Выбор порога является постоянной проблемой для этого типа анализа, и существуют различные подходы (см. [60], [61]). В данном контексте ключевой проблемой является то, что вероятность упустить из виду мутации зависит от размера эффекта. Мы решили эту проблему, оценив κ для различных вариантов w c . Затем следует получить диапазон значений w c , в котором κ e стабильно.Если это не так, мы, вероятно, не наблюдаем хвост распределения в смысле теории экстремальных значений.

    Тест отношения правдоподобия проводится для оценки того, можно ли исключить нулевую гипотезу κ  = 0 (область Гамбеля) [7]. Следуя процедуре, описанной в [58], мы сначала рассчитали, где логарифмическая вероятность измеренных значений приспособленности, заданных κ e и τ e , и логарифмическая вероятность оценки значения при гипотезе, что κ  = 0.Затем мы создали 1000 наборов данных для каждого значения w c путем численного выбора случайных чисел из GPD с параметрами κ  = 0 и . Доля случаев, для которых -ln( Λ ) больше для экспериментальных данных, чем для численно полученных данных, дает P -значение, соответствующее гипотезе κ  = 0. Мы проверили, насколько изменилась ошибка измерения наши оценки. В этом случае правдоподобие ( L ) вычисляется путем произведения сверток функции плотности вероятности с гауссианами, представляющими неопределенность в измерении значений приспособленности (см. [58]): , где n число рассматриваемых мутантов, f — GPD, g — гауссиана со средним значением w i и дисперсией σ i .Значения w i и σ i извлекаются из повторных измерений IC99,99 или пригодности. Поскольку оценки для κ и τ очень мало меняются с учетом ошибки измерения, мы приводим данные только для невозмущенных случаев.

    Вероятность выживания как мера пригодности

    Путем моделирования размножения и выживания как ветвящегося процесса мы установили связь между выживанием в присутствии антибиотика и приспособленностью.Предположим, что последующие поколения особей в популяции воспроизводятся (удваиваются) с вероятностью p или умирают с вероятностью (1 − p ). Тогда ожидаемое число потомков равно 2 p , что можно определить как райтовскую приспособленность W . Чтобы быть видимой, колония бактерий должна достичь минимального размера, N lim ≈100 000 бактерий за время проведения эксперимента, T exp ≈40 поколений.Вероятность того, что это произойдет, равна измеренной вероятности выживания P sur . Чтобы получить значение p и, следовательно, W , из измеренных P sur , мы смоделировали процесс ветвления для 1000 значений p , равномерно распределенных между 0 и 1, и измерили долю запусков, в которых N lim были достигнуты в 40 или менее поколениях, f ( p ).Если наша модель верна, P SUR = F ( F ) и, следовательно, P = F -1 ( P Sur ). Мы рассчитали p путем обратного отслеживания, для которого можно было бы ожидать измеренное значение P на . Пропущенные значения f ( p ) были получены путем линейной интерполяции его логарифма. Затем мы рассчитали коэффициент отбора мутантов по отношению к наименее подходящему наблюдаемому полезному мутанту ( W 1 ), с  =  W / W 1 -1.Обратите внимание, что расчет s по отношению к приспособленности дикого типа вместо этого существенно не меняет оценки, но не позволяет нам использовать данные, соответствующие 0,16 мкг Ctx/мл. Мы убедились, что наши измерения не слишком сильно зависят от конкретного выбора N lim (см. рис. S7).

    По конструкции s может принимать значения только от 0 до 1 из-за ограничения 2≥2 p >1. На первый взгляд кажется, что резкое верхнее ограничение для с неизбежно сместит распределение в сторону области Вейбулла.Однако при 0,04, 0,08 и 0,16 мкг Ctx/мл, когда почти все мутанты имеют сильно сниженную вероятность выживания, верхняя граница не имеет значения, и возможны другие классы распределений. При 0,02 мкг Ctx/мл восстановленное распределение находится в области Вейбулла (хотя существенно не отличается от Gumbel), но обратите внимание, что здесь на DBFE может влиять верхний предел для с из 1.

    С помощью коэффициентов отбора вычисляем далее вероятности параллельной эволюции , и вероятность захвата популяции наиболее приспособленным мутантом, , где s max – коэффициент отбора, соответствующий наиболее приспособленному мутанту, и суммы в выражениях учитываются все полезные мутации [20].Отметим, что обе меры соответствуют режиму слабого мутирования сильного отбора и получены с использованием выражения Холдейна для вероятности фиксации π  = 2 с , которое предполагает 2 с «1 [62]. Для больших значений s выражения необходимо изменить, но общая тенденция увеличения P 2 и P max для увеличения значений κ сохраняется.

    Дополнительная информация

    Рисунок S1.

    Гистограмма, показывающая относительные частоты значений МИК для клеток E. coli с плазмидной TEM-β-лактамазой, которые несут (1) аллель TEM-1 дикого типа, (2) аллели из мутированных библиотек, переживших воздействие до 0,04 мкг Ctx/мл на чашках ( n  = 864) и (3) аллели из мутированных библиотек, которые несут только одну мутацию (на основе секвенирования образца из 310 изолятов). Значения МИК определяли без трансформации в свежий изогенный фон, и в этом анализе не исключалось потенциальное присутствие мутаций вне гена ТЕМ.Обратите внимание, что концентрации Ctx нанесены на график в масштабе log 2 .

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s001

    (TIF)

    Рисунок S2.

    Выживание клеток E. coli с плазмидной TEM β-лактамазой при различных концентрациях Ctx. Выживаемость представлена ​​как доля выживших клеток (± стандартное отклонение) в логарифмической шкале, а концентрации Ctx нанесены в виде логарифмической шкалы 2 . Сравнение между клетками, несущими pACTEM1, и тремя мутантами с большой (G238S), промежуточной (E104K) и малой полезной мутацией (I173V), которое показывает диапазон эффектов резистентности, обнаруженных в этом исследовании.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s002

    (TIF)

    Рисунок S3.

    Анализ правдоподобия предполагаемого параметра формы ( κ e ) GPD. На верхней панели κ e нанесено в зависимости от количества полезных мутантов, ранжированных по их влиянию на устойчивость, которые использовались для оценки ( n ) с использованием порога ( w c ). . IC99.99 рассчитывали как концентрацию Ctx, при которой выживала фракция из 10 -4 клеток.На этом рисунке показаны κ e , соответствующие долям 10 -2 , 10 -3 и 10 -5 выживших клеток для расчета ингибирующей концентрации Ctx. Обратите внимание, что каждое n соответствует диапазону значений w c и, таким образом, диапазону оценок для κ e . Штриховая линия соответствует κ = 0 . κ e превышает 0 для 15≤ n ≤50. Значение P , соответствующее гипотезе κ = 0 , нанесено против n на нижней панели.Пунктирная линия соответствует доверительному уровню 95%. Гипотезу можно отвергнуть с достоверностью более 95% для всех вариантов w c и 15≤ n ≤48.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s003

    (TIF)

    Рисунок S4.

    Аналогично рис. S3. Показаны результаты вероятностного анализа без наиболее приспособленного мутанта (G238S). Этот мутант исключается, чтобы определить, не зависит ли условие κ >0 исключительно от этой мутации.По сравнению с рисунком S3, κ e смещается в сторону меньших значений, но остается положительным. P -значения, полученные для гипотезы κ = 0 , как правило, больше по сравнению с анализом с G238S, но остаются ниже 0,05 (показано пунктирной линией) для 30≤ n ≤45.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s004

    (TIF)

    Рисунок S6.

    (A) Доли изолятов нанесены в зависимости от логарифма коэффициента отбора (выведенного из данных о выживаемости) для четырех низких концентраций Ctx.Вертикальные пунктирные линии показывают границы между логарифмическими интервалами, используемыми в анализе. (B) Вероятностный анализ предполагаемого параметра формы ( κ e ) для распределения коэффициентов отбора. Оценка ML κ e построена в зависимости от числа ранжированных полезных мутантов, которые были включены для оценки ( n ) с использованием порога пригодности ( w c ). Поскольку каждое значение n соответствует диапазону значений w c , существует также диапазон κ e , связанный с каждым n .(C) P -значение, соответствующее гипотезе κ  = 0, нанесено на график относительно n . Эта гипотеза может быть отклонена с достоверностью более 95% для точек данных под пунктирной линией.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s006

    (TIF)

    Рисунок S7.

    Аналогичен рис. 4, но для N lim  = 1024 бактерии и T exp  = 40 генераций. (A) Доли изолятов нанесены в зависимости от логарифма коэффициента отбора (выведенного из процесса ветвления) для четырех низких концентраций антибиотика.Вертикальные пунктирные линии показывают границы между логарифмическими ячейками, используемыми в анализе. Распределение смещается в сторону меньших значений по мере увеличения концентрации антибиотика, в то время как группа очень подходящих мутантов сохраняется вблизи максимального коэффициента отбора s  = 1. распределение коэффициентов отбора. Оценка ML κ e построена в зависимости от числа полезных мутантов (ранжированных по их эффекту приспособленности), которые были включены для оценки ( n ) с использованием порога приспособленности ( w c ).Поскольку каждое значение n соответствует диапазону значений w c , существует также диапазон κ e , связанный с каждым n . (C) P -значение, соответствующее гипотезе κ  = 0, нанесено на график относительно n . Эта гипотеза может быть отклонена с достоверностью более 95% для точек данных под пунктирной линией.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s007

    (TIF)

    Рисунок S8.

    Вероятность параллельной эволюции ( P 2 ) и вероятность фиксации наиболее приспособленного мутанта ( P max ), выведенные из коэффициентов отбора, нанесены на график в зависимости от концентрации антибиотика. Мы также строим прогноз вероятности параллельной эволюции в случае распределения класса Гамбеля, где N — количество полезных мутантов [20]. Обратите внимание, что, в отличие от случая Гамбеля, мы предсказываем увеличение частоты событий параллельной эволюции с увеличением концентрации антибиотика.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s008

    (TIF)

    Таблица S2.

    Идентифицированы уникальные мутации в β-лактамазе TEM-1, ранжированные по устойчивости к Ctx. В таблице указано, были ли адаптивные мутации идентифицированы ранее в клинических изолятах (согласно http://www.lahey.org/studies/temtable.asp; версия 17 ноября 2011 г.) или в лабораторных экспериментах (согласно [25]). В таблице также указано, как часто мутация выявлялась и в какой категории МИК она была идентифицирована.Обратите внимание, что указанные частоты относятся к измерениям МИК различных независимых изолятов, и, следовательно, конкретный генотип может быть идентифицирован в нескольких категориях МИК. МИК определяли непосредственно после выделения, тогда как уровни IC99.99 устанавливали после трансформации в изогенный фон. Улучшение рассчитывают путем деления IC99.99 мутантов на IC99.99 pACTEM1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002783.s010

    (DOCX)

    Благодарности

    Мы благодарим Bertha Koopmanschap и Merijn Salverda за помощь в проведении экспериментов, а также Jasper Franke, Paul Joyce и Su-Chan Park за полезные обсуждения.Мы также хотели бы поблагодарить трех анонимных рецензентов за полезные комментарии и предложения.

    Вклад авторов

    Идея и разработка экспериментов: МФС ЯГМдВ. Проведены эксперименты: МФС. Проанализированы данные: MFS IGS JK JAGMdV. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: MFS IGS JK. Написал статью: MFS IGS JK JAGMdV.

    Каталожные номера

    1. 1. Топрак Э., Верес А., Мишель Дж.-Б., Чайт Р., Хартл Д.Л. и др. (2012) Эволюционные пути к устойчивости к антибиотикам при динамическом устойчивом отборе лекарств.Нат Жене 44: 101–105.
    2. 2. Salverda MLM, Dellus E, Gorter FA, Debets AJM, Van der Oost J, et al. (2011) Начальные мутации направляют альтернативные пути эволюции белков. PLoS Genet 7: e1001321.
    3. 3. Sniegowski PD, Gerrish PJ (2010)Полезные мутации и динамика адаптации в бесполых популяциях. Фил Транс R Soc B 365: 1255–1263.
    4. 4. Weinreich DM, Delaney NF, DePristo MA, Hartl DL (2006) Дарвиновская эволюция может следовать только очень немногим мутационным путям к более приспособленным белкам.Наука 312: 111–114.
    5. 5. Orr HA (1998) Тестирование естественного отбора в сравнении с генетическим дрейфом в фенотипической эволюции с использованием данных локуса количественных признаков. Генетика 149: 2099–2104.
    6. 6. Orr HA (2003) Распределение эффектов приспособленности среди полезных мутаций. Генетика 163: 1519–1526.
    7. 7. Orr HA (2010)Популяционная генетика полезных мутаций. Фил Транс R Soc B 365: 1195–1201.
    8. 8. Gillespie JH (1984)Молекулярная эволюция в мутационном ландшафте.Эволюция 38: 1116–1129.
    9. 9. Кассен Р., Батайон Т. (2006)Распределение эффектов приспособленности среди полезных мутаций до отбора в экспериментальных популяциях бактерий. Нат Жене 38: 484–488.
    10. 10. MacLean RC, Buckling A (2009) Распределение фитнес-эффектов полезных мутаций в Pseudomonas aeruginosa . Генетика PLoS 5: e1000406.
    11. 11. Рокита Д.Р., Джойс П., Кодл С.Б., Вичман Х.А. (2005)Эмпирический тест модели адаптации мутационного ландшафта с использованием одноцепочечного ДНК-вируса.Нат Жене 37: 441–444.
    12. 12. Санхуан Р., Моя А., Елена С.Ф. (2004)Распределение эффектов приспособленности, вызванных однонуклеотидными заменами в РНК-вирусе. Proc Natl Acad Sci USA 101: 8396–8401.
    13. 13. McDonald MJ, Cooper TF, Beaumont HJE, Rainey PB (2010)Распределение фитнес-эффектов новых полезных мутаций в флуоресценции Pseudomonas . Биол. Летт 7: 98–100.
    14. 14. Джойс П., Рокита Д.Р., Бейзел С.Дж., Орр Х.А. (2008) Общая модель теории экстремальных значений для адаптации последовательностей ДНК при сильном отборе и слабой мутации.Генетика 180: 1627–1643.
    15. 15. Bataillon T, Zhang T, Kassen R (2011) Стоимость адаптации и фитнес-эффекты полезных мутаций в Pseudomonas fluorescens . Генетика 189: 939–949.
    16. 16. Rokyta DR, Beisel CJ, Joyce P, Ferris MT, Burch CL, et al. (2008) Благоприятные эффекты фитнеса не экспоненциальны для двух вирусов. Дж. Мол Эвол 67: 368–376.
    17. 17. Джайн К., Ситхараман С. (2011) Множественные адаптивные замены во время эволюции в новых условиях.Генетика 189: 1029–1043.
    18. 18. Нейдхарт Дж., Круг Дж. (2011) Адаптивные прогулки и теория экстремальных значений. Phys Rev Lett 107: 178102.
    19. 19. Джайн К. (2011) Количество шагов адаптации к локальному пику физической формы. EPL 96: 58006.
    20. 20. Орр Х.А. (2005) Вероятность параллельной эволюции. Эволюция 59: 216–220.
    21. 21. Orr HA (2003) Минимум среднего количества шагов, сделанных при адаптивных прогулках. J Theor Biol 220: 241–247.
    22. 22. Fogle CA, Nagle JL, Desai MM (2008)Клональная интерференция, множественные мутации и адаптация в больших бесполых популяциях. Генетика 180: 2163–2173.
    23. 23. Парк С.К., Саймон Д., Круг Дж. (2010) Скорость эволюции в больших бесполых популяциях. J Stat Phys 138: 381–410.
    24. 24. Perfeito L, Fernandes L, Mota C, Gordo I (2007) Адаптивные мутации у бактерий: высокая скорость и небольшие эффекты. Наука 317: 813–815.
    25. 25.Salverda MLM, de Visser JAGM, Barlow M (2010)Естественная эволюция бета-лактамазы TEM-1: экспериментальная реконструкция и клиническая значимость. FEMS Microbiol Rev 34: 1015–1036.
    26. 26. Barlow M, Hall BG (2002) Прогнозирование эволюционного потенциала: Эволюция in vitro точно воспроизводит естественную эволюцию бета-лактамазы TEM. Генетика 160: 823–832.
    27. 27. Stemmer WPC (1994) Быстрая эволюция белка in vitro путем перетасовки ДНК.Природа 370: 389–391.
    28. 28. Дэвисон А.С., Смит Р.Л. (1990) Модели превышения высоких пороговых значений. JR Stat Soc B (методологический) 52: 393–442.
    29. 29. Стивенс К.Е., Себерт М.Е. (2011)Частые полезные мутации во время серийного переноса одной колонии Streptococcus pneumoniae . PLoS Genet 7: e1002232.
    30. 30. Лалик Дж., Куэвас Дж.М., Елена С.Ф. (2011)Влияние видов-хозяев на распространение эффектов мутационной приспособленности для РНК-вируса.PLoS Genet 7: e1002378.
    31. 31. Ромеро П.А., Арнольд Ф.Х. (2009)Изучение ландшафтов пригодности белка путем направленной эволюции. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 866–876.
    32. 32. Холл А.Р., Гриффитс В.Ф., Маклин Р.К., Коулгрейв Н. (2010)Мутационное соседство и скорость поступления мутаций ограничивают адаптацию у Pseudomonas aeruginosa . Proc R Soc B 277: 643–650.
    33. 33. ДеПристо М.А., Вайнрайх Д.М., Хартл Д.Л. (2005)Блуждания миссенс в пространстве последовательностей: биофизический взгляд на эволюцию белка.Нат Рев Генет 6: 678–687.
    34. 34. Huang W, Petrosino J, Hirsch M, Shenkin PS, Palzkill T (1996) Детерминанты аминокислотной последовательности структуры и активности бета-лактамазы. Дж. Мол. Биол. 258: 688–703.
    35. 35. Соскин М., Тауфик Д.С. (2010)Мутационные эффекты и эволюция новых функций белка. Нат Рев Генет 11: 572–582.
    36. 36. Кряжимский С., Райс Д.П., Десаи М.М. (2012) Подразделение популяции и адаптация в бесполых популяциях Saccharomyces cerevisiae .Эволюция. в прессе.
    37. 37. Wang X, Minasov G, Shoichet BK (2002)Эволюция фермента устойчивости к антибиотикам, ограниченная компромиссами между стабильностью и активностью. Дж. Мол Биол 320: 85–95.
    38. 38. Голдсмит М., Тауфик Д.С. (2009)Потенциальная роль фенотипических мутаций в эволюции экспрессии и стабильности белков. Proc Natl Acad Sci USA 106: 6197–6202.
    39. 39. Deana A, Ehrlich R, Reiss C (1996) Выбор синонимичных кодонов контролирует оборот in vivo и количество мРНК в генах Escherichia coli bla и ompA.Дж. Бактериол 178: 2718–2720.
    40. 40. Zalucki YM, Gittins KL, Jennings MP (2008)Неоптимальные сигнальные кодоны секреторной последовательности необходимы для экспрессии и экспорта бета-лактамазы. Biochem Biophys Res Comm 366: 135–141.
    41. 41. Duan JB, Wainwright MS, Comeron JM, Saitou N, Sanders AR, et al. (2003) Синонимичные мутации в человеческом дофаминовом рецепторе D2 (DRD2) влияют на стабильность мРНК и синтез рецептора. Хум Мол Генет 12: 205–216.
    42. 42.Линд П.А., Берг О.Г., Андерссон Д.И. (2010) Мутационная устойчивость генов рибосомных белков. Наука 330: 825–827.
    43. 43. Вакуленко С.Б., Тайби-Тронш П., Тот М., Массова И., Лернер С.А. и соавт. (1999) Влияние на профиль субстрата мутационных замен в положениях 164 и 179 бета-лактамазы класса A TEMpUC19 из Escherichia coli . J Biol Chem 274: 23052–23060.
    44. 44. Orencia MC, Yoon JS, Ness JE, Stemmer WPC, Stevens RC (2001) Прогнозирование возникновения устойчивости к антибиотикам путем направленной эволюции и структурного анализа.Nat Struct Biol 8: 238–242.
    45. 45. Negri MC, Lipsitch M, Blázquez J, Levin BR, Baquero F (2000) Концентрационный отбор небольших фенотипических различий в устойчивости к антибиотикам, опосредованной бета-лактамазой TEM. Противомикробные агенты Chemother 44: 2485–2491.
    46. 46. Paulander W, Pennhag A, Andersson DI, Maisnier-Patin S (2007) Caenorhabditis elegans в качестве модели для определения устойчивости к антибиотикам Salmonella enterica serovar typhimuriu.Противомикробные агенты Chemother 51: 766–769.
    47. 47. Андерссон Д.И., Хьюз Д. (2010)Устойчивость к антибиотикам и ее стоимость: возможно ли обратить вспять устойчивость? Nat Rev Microb 8: 260–271.
    48. 48. Медейрос А.А. (1997)Эволюция и распространение бета-лактамаз ускоряется поколениями бета-лактамных антибиотиков. Clin Infect Dis 24: S19–S45.
    49. 49. Деррида Б. (1994) Эффекты несамоусреднения в суммах случайных величин, спиновых очков, случайных карт и случайных блужданий.В: Fannes M, Maes C, Verbeure A, редакторы. На трех уровнях: микро-, мезо- и макроподходы в физике. Нью-Йорк: Пленум Пресс. стр. 125–137.
    50. 50. Gifford DR, Schoustra SE, Kassen R (2011) Продолжительность адаптивных прогулок не зависит от исходной физической формы у Aspergillus nidulans . Эволюция 65: 3070–3078.
    51. 51. Schoustra SE, Bataillon T, Gifford DR, Kassen R (2009) Свойства адаптивных прогулок в развивающихся популяциях грибов.ПЛОС Биол 7: e1000250.
    52. 52. Sun F (1995) Полимеразная цепная реакция и процессы ветвления. J Comp Biol 2: 63–86.
    53. 53. Патрик В.М., Ферт А.Е., Блэкберн Дж.М. (2003)Удобные алгоритмы для оценки полноты и разнообразия в рандомизированных библиотеках, кодирующих белки. Белок Eng 16: 451–457.
    54. 54. Ambler RP, Coulson AFW, Frere JM, Ghuysen JM, Joris B, et al. (1991) Стандартная схема нумерации бета-лактамаз класса А.Биохим Дж. 276: 269–270.
    55. 55. ДеЛано В.Л. (2002) Система молекулярной графики PyMOL. Пало-Альто, Калифорния: DeLano Scientific.
    56. 56. Джаффе А., Чабберт Ю.А., Семонин О. (1982) Роль пориновых белков OmpF и OmpC в проникновении бета-лактамов. Противомикробные агенты Chemother 22: 942–948.
    57. 57. Финкельштейн М., Такер Х.Г., Вех Дж.А. (1998) Доверительные интервалы для количества невидимых типов. Stat Prob Lett 37: 423–430.
    58. 58.Бейзел С.Дж., Рокита Д.Р., Вичман Х.А., Джойс П. (2007) Тестирование области притяжения с экстремальными значениями для распределения полезных фитнес-эффектов. Генетика 176: 2441–2449.
    59. 59. Пикандс Дж. (1975) Статистический вывод с использованием статистики экстремального порядка. Энн Стат 3: 119–131.
    60. 60. Чулакян В., Стивенс М.А. (2001) Критерии согласия для обобщенного распределения Парето. Технометрика 43: 478–484.
    61. 61. Ланг М., Уарда ТБМЖ, Боби Б. (1999) На пути к операционным рекомендациям по сверхпороговому моделированию.J Hydrol 225: 103–117.
    62. 62. Холдейн Дж. Б. С. (1927) Математическая теория естественного и искусственного отбора. Proc Cambridge Phil Soc 23: 838–844.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Используя вибрационный эффект Штарка, исследователи исследуют взаимосвязь между электрическими полями, катализом и эволюцией. — ScienceDaily

    Ферменты – это белки, ускоряющие или катализирующие реакции в живых организмах.Бактерии могут вырабатывать ферменты, которые делают их устойчивыми к антибиотикам. В частности, фермент бета-лактамаза ТЕМ позволяет бактериям развивать устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и цефалоспорины. Исследователи из Стэнфордского университета изучают, как фермент изменяется и становится устойчивым к антибиотикам.

    Во время 62-го ежегодного собрания Биофизического общества, которое состоится 17–21 февраля 2018 г. в Сан-Франциско, штат Калифорния, Сэмюэл Х. Шнайдер, аспирант лаборатории боксеров Стэнфордского университета, представит исследование группы, изучающее, что происходит, когда фермент ускорение реакции и то, как фермент изменяется со временем, делая его устойчивым к антибиотикам.

    Исследователи пытались выяснить, что именно происходит, когда фермент связывается с другой молекулой, и, в конечном счете, как этот фермент становится устойчивым к антибиотикам. Команда исследователей из Boxer Lab использует существующую технику, называемую вибрационным эффектом Штарка (VSE), в новом способе измерения электрического поля молекулы, когда фермент и молекула присоединяются в разное время в ходе эволюции фермента, чтобы стать устойчивыми к антибиотикам. .

    Команда измерила электрические поля, генерируемые ферментом бета-лактамазы ТЕМ, прикрепленным к двум различным молекулам, и вибрацию химических связей в этих молекулах в надежде, что они найдут то, что заставляет фермент развивать устойчивость к цефалоспориновым антибиотикам.

    В дальнейшем команда надеется расширить исследование до тысяч вариантов этих ферментов, «чтобы понять взаимосвязь между эволюцией электрических полей в ферментах и ​​развитием резистентности [к антибиотикам]», — сказал Яцек Козуч, исследователь с докторской степенью, работающий в Боксерская лаборатория.

    Источник истории:

    Материалы предоставлены Биофизическим обществом . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

    Действие и механизм фермента резистентности к колистину MCR-4

  • Lim, L.М. и др. Возрождение колистина: обзор резистентности, токсичности, фармакодинамики и дозирования. Pharmacotherapy 30 , 1279–1291 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Spapen, H., Jacobs, R., Van Gorp, V., Troubleyn, J. & Honore, PM. Почечные и неврологические побочные эффекты колистина у пациентов в критическом состоянии. Энн. Интенсивная терапия 1 , 14 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Алос, Дж.I. [Устойчивость к антибиотикам: глобальный кризис]. Энферм. инфекции микробиол. клин. 33 , 692–699 (2015).

    Артикул Google ученый

  • Лаксминараян Р. и др. Устойчивость к антибиотикам — необходимость глобальных решений. Ланцет Заражение. Дис. 13 , 1057–1098 (2013).

    Артикул Google ученый

  • Понсе де Леон-Росалес, С., Арредондо-Эрнандес, Р. и Лопес-Видаль, Ю. [Устойчивость к антибиотикам: серьезная глобальная проблема]. Гак. Мед. мекс. 151 , 681–689 (2015).

    ПабМед Google ученый

  • Li, J. et al. Колистин: вновь появляющийся антибиотик для полирезистентных грамотрицательных бактериальных инфекций. Ланцет Заражение. Дис. 6 , 589–601 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Ловушка, К.Р., Эндрюс, Дж. М., Бренвальд, Н. и Уайз, Р. Переоценка активности колистин сульфометата натрия in vitro. J. Антимикроб. Чемотер. 39 , 255–260 (1997).

    КАС Статья Google ученый

  • Liu, Y.Y. et al. Появление плазмид-опосредованного механизма резистентности к колистину MCR-1 у животных и человека в Китае: микробиологическое и молекулярно-биологическое исследование. Ланцет Заражение.Дис. 16 , 161–168 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Сюй Ю. и др. Эволюционно консервативный механизм внутренней и передаваемой резистентности к полимиксину. mBio 9 , e02317–e02317 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Xu, Y., Lin, J., Cui, T., Srinivas, S. & Feng, Y. Механизм понимания передаваемой резистентности к полимиксину среди кишечных бактерий. J. Biol. хим. 293 , 4350–4365 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • Сунь Дж., Чжан Х., Лю Ю. Х. и Фэн Ю. На пути к пониманию резистентности к MCR-подобному колистину. Тенденции микробиол. 26 , 30042–30048 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Zhou, Z. et al. Модификации липида А в устойчивом к полимиксину Salmonella typhimurium : PMRA-зависимая 4-амино-4-дезокси-L-арабиноза и включение фосфоэтаноламина. J. Biol. хим. 276 , 43111–43121 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Helander, IM, Kilpelainen, I. & Vaara, M. Увеличение замещения фосфатных групп в липополисахаридах и липиде A полимиксин-резистентных pmrA мутантов Salmonella typhimurium : исследование 31-90NMR . Мол. микробиол. 11 , 481–487 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Миллер А.К. и др. Мутации PhoQ способствуют модификации липида А и резистентности к полимиксину Pseudomonas aeruginosa , обнаруживаемой у пациентов с муковисцидозом, получавших колистин. Антимикроб. Агенты Чемотер. 55 , 5761–5769 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Билецен К.и другие. Устойчивость к полимиксину В и образование биопленки у Vibrio cholerae контролируются регулятором ответа CarR. Заразить. Иммун. 83 , 1199–1209 (2015).

    Артикул Google ученый

  • Hankins, J.V., Madsen, J.A., Giles, D.K., Brodbelt, J.S. & Trent, M.S. Добавление аминокислот к Vibrio cholerae LPS устанавливает связь между ремоделированием поверхности у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Проц. Натл. акад. науч. США 109 , 8722–8727 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Henderson, J.C., Herrera, C.M. & Trent, M.S. AlmG, ответственный за устойчивость к полимиксину при пандемии Vibrio cholerae , представляет собой глицилтрансферазу, отдаленно связанную с поздними ацилтрансферазами липида A. J. Biol. хим. 292 , 21205–21215 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Bengoechea, J.A. Vibrio cholerae аминокислоты идут на защиту. J. Biol. хим. 292 , 21216–21217 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Коэн, М.Л. Эпидемиология лекарственной устойчивости: последствия для постантимикробной эры. Наука 257 , 1050–1055 (1992).

    КАС Статья Google ученый

  • Эконому, В.и Гусия, П. Сельское хозяйство и пищевые животные как источник устойчивых к противомикробным препаратам бактерий. Заразить. Сопротивление наркотикам. 8 , 49–61 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Уоттс, Дж. Э. М., Шрайер, Х. Дж., Ланска, Л. и Хейл, М. С. Рост устойчивости к противомикробным препаратам в аквакультуре: источники, поглотители и решения. Мар. Наркотики . 15 , pii: E158 (2017).

  • Ксавьер, Б.Б. и др. Идентификация нового плазмидно-опосредованного гена устойчивости к колистину, mcr-2, в Escherichia coli , Бельгия, июнь 2016 г. евро. Наблюдение . 21, doi: 10.2807/1560-7917.ES.2016.21.27.30280 (2016).

  • Eichhorn, I. et al. Идентификация новых вариантов гена устойчивости к колистину mcr-3 у Aeromonas spp. из национальной программы мониторинга резистентности GERM-Vet и из диагностических материалов. J. Антимикроб. Чемотер .73, 1217–1221 (2018).

  • Bi, Z. et al. Распространенность гена устойчивости к колистину mcr-1 в штамме Escherichia coli , продуцирующем бета-лактамазы расширенного спектра, из образцов фекалий человека, собранных в 2012 году в сельских деревнях провинции Шаньдун, Китай. Междунар. Дж. Антимикроб. Агенты 49 , 493–497 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Yin, W.J. et al.Новый плазмид-опосредованный ген устойчивости к колистину mcr-3 у Escherichia coli. МБио. 8 , e00543-17 (2017). mBio 8.

  • Carattoli, A. et al. Новая плазмидно-опосредованная резистентность к колистину mcr-4 ген у Salmonella и Escherichia coli , Италия, 2013 г., Испания и Бельгия, 2015–2016 гг.

  • Чен, Л. и др. Недавно идентифицированные гены устойчивости к колистину, mcr-4 и mcr-5 , из верхних и нижних отделов пищеварительного тракта свиней и домашней птицы в Китае. PLoS One 13 , e0193957 (2018 г.).

    Артикул Google ученый

  • Боровяк, М. и др. Идентификация нового гена фосфоэтаноламинтрансферазы, ассоциированной с транспозоном, mcr-5 , придающего устойчивость к колистину при ферментации d-тартрата Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B. J. Antimicrob. Чемотер. 72 , 3317–3324 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Вэй, В.и другие. Определение ICR-Mo, внутренней детерминанты устойчивости к колистину из Moraxella osloensis . PLoS. Жене. 14 , e1007389 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Feng, Y. Возможность передачи устойчивости к полимиксину MCR-1/2: сложное распространение и генетический механизм. Заражение АКС. Дис . 4 , 291–300 (2018).

  • Xavier, B.B. et al. Идентификация нового плазмидно-опосредованного гена устойчивости к колистину, mcr-2 , в Escherichia coli , Бельгия, июнь 2016 г. Евронаблюдение . 21 , doi: 10.2807/1560-7917.ES.2016.21.27.30280 (2016).

  • Кабельо, Ф. К., Томова, А., Иванова, Л. и Годфри, Х. П. Аквакультура и детерминанты устойчивости mcr к колистину. mBio 8 , pii: e01229-17 (2017).

  • Сюй Ю. и др. Распространение устойчивости к колистину MCR-3 в Китае: эпидемиологическое, геномное и механистическое исследование. EBioMedicine pii , S2352–S3964 (2018).(2318)30270-30276.

    Google ученый

  • Чавда Б. и др. Совместная идентификация mcr-4.3 и bla NDM-1 в клиническом изоляте Enterobacter cloacae из Китая. Антимикроб. Агенты Чемотер. 62 , e00649-18 (2018). https://doi.org/10.1128/AAC.00649-18.

  • Сан, Дж. и др. Расшифровка устойчивости к колистину MCR-2. mBio 8 , e00625–00617 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Ян, К. и др. Баланс между экспрессией mcr-1 и выживаемостью бактерий представляет собой тонкое равновесие между основными механизмами клеточной защиты. Нац. коммун. 8 , 2054 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Буше, Х.В. и др. Плохие жуки, никаких лекарств: нет ESKAPE! Обновление от Американского общества инфекционистов. клин. Заразить. Дис. 48 , 1–12 (2009).

    Артикул Google ученый

  • Коутс, К., Уолш, Т. Р., Спенсер, Дж. и Хинчлифф, П. 1.12 Кристаллическая структура разрешения каталитического домена плазмид-опосредованной детерминанты устойчивости к колистину MCR-2. Acta Кристаллогр. Ф. Структура. биол. коммун. 73 , 443–449 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Breazeale, S.D., Ribeiro, A.A. & Raetz, C.R. Происхождение видов липидов A, модифицированных 4-амино-4-дезокси-L-арабинозой, у устойчивых к полимиксину мутантов Escherichia coli. Аминотрансфераза (ArnB), которая генерирует UDP-4-дезоксил-L-арабинозу. J. Biol. хим. 278 , 24731–24739 (2003 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Дерис З.З. и др. Вторичный механизм действия полимиксинов против грамотрицательных бактерий включает ингибирование активности НАДН-хиноноксидоредуктазы. Дж. Антибиот. (Токио) 67 , 147–151 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Yu, Z., Zhu, Y., Qin, W., Yin, J. & Qiu, J. Окислительный стресс, вызванный полимиксином E, участвует в быстром уничтожении Paenibacillus polymyxa. Биомед. Рез. Междунар. 2017 , 5437139 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Молина-Сантьяго, К. и Рамос, Дж. Л. Бактерицидные и бактериостатические антибиотики и реакция Фентона. Микроб. Биотехнолог. 7 , 194–195 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Wang, Y. et al. Всесторонний анализ резистома показывает распространенность NDM и MCR-1 в птицеводстве Китая. Нац. Microbiol 2 , 16260 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Trung, N.V. et al. Зоонозная передача гена устойчивости к колистину mcr-1 с мелких птицефабрик, Вьетнам. Аварийный. Заразить. Дис. 23 , 529–532 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Ye, H. et al. Разнообразные резервуары mcr-1 , содержащие плазмиды, придают микробиоте кишечника человека устойчивость к колистину. mBio 7 , e00177 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Гао, Р. и др. Распространение и механизм устойчивости к колистину MCR-1. PLoS. Патог. 12 , e1005957 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Li, Z., Tan, C., Lin, J. & Feng, Y. Разнообразные варианты плазмидного резервуара, несущего mcr-1 , в микробиоте легких свиней. науч. Китайская наука о жизни. 59 , 971–973 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Гао, Р., Ли, Ю., Лин, Дж., Тан, С. и Фэн, Ю. Неожиданная сложность множественной лекарственной устойчивости у штамма mcr-1 , содержащего Escherichia coli . науч. Китайская наука о жизни. 59 , 732–734 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Хинчлифф, П.и другие. Представление о механистической основе плазмид-опосредованной резистентности к колистину из кристаллических структур каталитического домена MCR-1. науч. 7 , 39392 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Feng, Y., Kumar, R., Ravcheev, D. A. & Zhang, H. Paracoccus denitrificans обладает двумя гомологами BioR, играющими роль в регуляции метаболизма биотина. Microbiologyopen 4 , 644–659 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Feng, Y. & Cronan, J.E. Комплексное связывание репрессора FabR бактериального биосинтеза ненасыщенных жирных кислот с родственными ему промоторами. Мол. микробиол. 80 , 195–218 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Коринальдези, К., Бароне, Г., Марчеллини, Ф., Делл’Анно, А. и Дановаро, Р.Молекулы, полученные из морских микробов, и их потенциальное использование в космецевтических и косметических продуктах. Мар. Наркотики . 15 , pii: E118 (2017).

  • Паул, А. М., О’Рейли, А. О., Майлз, А. Дж. и Уоллес, Б. А. Спектроскопия кругового дихроизма синхротронного излучения, определяемая спектроскопией структуры С-концевого домена NaChBac и ее роль в сборке каналов. Проц. Натл. акад. науч. США 107 , 14064–14069 (2010 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Лешнер, К., Harrington, C.F., Kearney, JL, Langton, D.J. & Larsen, E.H. Возможности асимметричного фракционирования потока в сочетании с ICP-MS для характеристики частиц износа металла и металлопротеинов в биологических жидкостях от пациентов с заменой тазобедренного сустава. Анал. Биоанал. хим. 407 , 4541–4554 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Liu, Y.Y. et al. Структурная модификация липополисахарида, обусловленная mcr-1 у грамотрицательных патогенов ESKAPE. Антимикроб. Агенты Чемотер. 61 , e00580–00517 (2017). пии.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Caroff, M., Tacken, A. & Szabo, L. Ускоренный детергентом гидролиз бактериальных эндотоксинов и определение аномерной конфигурации гликозилфосфата, присутствующего в фрагменте «выделенного липида A» эндотоксина Bordetella pertussis. Углевод. Рез. 175 , 273–282 (1988).

    КАС Статья Google ученый

  • Wanty, C. et al. Структура нейссерийной липоолигосахаридфосфоэтаноламинтрансферазы А (LptA), необходимой для устойчивости к полимиксину. Дж. Мол. биол. 425 , 3389–3402 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Tsai, C.M. & Frasch, C.E. Чувствительный серебряный краситель для обнаружения липополисахаридов в полиакриламидных гелях. Анал. Биохим. 119 , 115–119 (1982).

    КАС Статья Google ученый

  • Канистанон, Д. и др. Мутант Francisella в модификации липида А-углевода вызывает защитный иммунитет. PLoS. Патог. 4 , e24 (2008 г.).

    Артикул Google ученый

  • Анандан, А. и др. Структура липидов. Фосфоэтаноламинтрансфераза указывает на то, как конформационные изменения управляют связыванием субстрата. Проц. Натл акад. науч. США 114 , 2218–2223 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Gros, M., Rodriguez-Mozaz, S. & Barcelo, D. Экспресс-анализ остатков мультиклассовых антибиотиков и некоторых их метаболитов в больницах, городских сточных водах и речной воде с помощью сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с квадруполем -тандемная масс-спектрометрия с линейной ионной ловушкой. Ж. Хроматогр. А. 1292 , 173–188 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Dwyer, D. J. et al. Антибиотики вызывают окислительно-восстановительные физиологические изменения как часть их летальности. Проц. Натл акад. науч. США. 111 , E2100–E2109 (2014 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Лобриц М.А. и др. Эффективность антибиотиков связана с бактериальным клеточным дыханием. Проц. Натл акад. науч. США 112 , 8173–8180 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • McBee, M.E. et al. Производство супероксида в бактериях зависит от стресса и состояния клеток: метод проточной цитометрии с оптимизированным гейтированием, который сводит к минимуму артефакты измерения АФК с помощью флуоресцентных красителей. Перед. микробиол. 8 , 459 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Ерусланов Э.и Кусмарцев С. Идентификация АФК с использованием окисленного DCFDA и проточной цитометрии. Методы Мол. биол. 594 , 57–72 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Biasini, M. et al. SWISS-MODEL: моделирование третичной и четвертичной структуры белка с использованием эволюционной информации. Рез. нуклеиновых кислот. 42 , W252–W258 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Бенкерт, П., Kunzli, M. & Schwede, T. Сервер QMEAN для оценки качества модели белка. Рез. нуклеиновых кислот. 37 , W510–W514 (2009 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Allen, W. J. et al. DOCK 6: Влияние новых функций и текущей производительности стыковки. Дж. Вычисл. хим. 36 , 1132–1156 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Ирвин, Дж.Дж., Стерлинг Т., Майсингер М.М., Болстад Э.С. и Коулман Р.Г. ZINC: бесплатный инструмент для открытия химии для биологии. J Chem Inf Model 52, 1757–1768 (2012).

    Google ученый

  • Петтерсен, Э. Ф. и др. UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. Дж. Вычисл. хим. 25 , 1605–1612 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Ласковски Р.A. & Swindells, MB LigPlot+: множественные диаграммы взаимодействия лиганд-белок для открытия лекарств. J. Chem. Инф. Модель. 51 , 2778–2786 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Тамура, К., Дадли, Дж., Ней, М. и Кумар, С. MEGA4: программное обеспечение для молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA), версия 4.0. Мол. биол. Эвол. 24 , 1596–1599 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Гаскюэль, О.BIONJ: улучшенная версия алгоритма NJ, основанная на простой модели данных последовательности. Мол. биол. Эвол. 14 , 685–695 (1997).

    КАС Статья Google ученый

  • Le, S. Q. & Gascuel, O. Усовершенствованная матрица замены аминокислот. Мол. биол. Эвол. 25 , 1307–1320 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Структура каталитического домена резистентного к колистину фермента MCR-1 | BMC Biology

  • Munoz-Price LS, Poirel L, Bonomo RA, Schwaber MJ, Daikos GL, Cormican M, Cornaglia G, Garau J, Gniadkowski M, Hayden MK, et al.Клиническая эпидемиология глобальной экспансии карбапенемаз Klebsiella pneumoniae . Ланцет Infect Dis. 2013;13:785–96.

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Falagas ME, Kasiakou SK. Колистин: возрождение полимиксинов для лечения полирезистентных грамотрицательных бактериальных инфекций. Клин Инфекция Дис. 2005;40:1333–41.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Олайтан А.О., Моран С., Ролен Ж-М.Механизмы резистентности к полимиксинам: приобретенная и врожденная резистентность бактерий. Фронт микробиол. 2014;5:643.

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Falagas ME, Rafaildis PI, Matthaiou DK. Резистентность к полимиксинам: механизмы, частота и варианты лечения. Обновления устойчивости к наркотикам. 2010;13:132–138.

    КАС Статья Google ученый

  • Трент М.С., Рибейро А.А., Лин С., Коттер Р.Дж., Рэтц К.Р.Фермент внутренней мембраны Salmonella и Escherichia coli , который переносит 4-амино-4-дезокси-L-арабинозу в липид A: индукция устойчивых к полимиксину мутантов и роль нового донора, связанного с липидом. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:43122–31.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ли Х., Хсу Ф.Ф., Терк Дж., Гройсман Э.А. PmrA-регулируемый ген pmrC опосредует фосфоэтаноламиновую модификацию липида А и устойчивость к полимиксину у Salmonella enterica .J Бактериол. 2004; 186:4124–33.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Нидхэм Б.Д., Трент М.С. Укрепление барьера: влияние ремоделирования липида А на бактериальный патогенез. Nat Rev Microbiol. 2013; 11: 467–81.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Петру В.И., Эррера К.М., Шульц К.М., Кларк О.Б., Вендом Дж., Томасек Д., Банерджи С., Раджашанкар К.Р., Дюфрисне М.Б., Клосс Б. и др.Структуры аминоарабинозотрансферазы ArnT предполагают молекулярную основу для гликозилирования липида А. Наука. 2016; 351: 608–12.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Wanty C, Anandan A, Piek S, Walshe J, Ganguly J, Carlson RW, Stubbs KA, Kahler CM, Vrielink A. Структура Neisserial липоолигосахаридфосфоэтаноламинтрансферазы A (LptA), необходимой для устойчивости к полимиксину. Дж Мол Биол.2013; 425:3389–402.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Fage CD, Brown DB, Boll JM, Keatinge-Clay AT, Trent MS. Кристаллографическое исследование фосфоэтаноламинтрансферазы EptC, необходимой для устойчивости к полимиксину и подвижности у Campylobacter jejuni . Acta Crystallogr D. 2014; D70:2730–9.

    Артикул Google ученый

  • Liu Y-Y, Wang Y, Walsh TR, Yi L-X, Zhang R, Spencer J, Doi Y, Tian G, Dong B, Huang X и другие.Появление плазмид-опосредованного механизма резистентности к колистину MCR-1 у животных и человека в Китае: микробиологическое и молекулярно-биологическое исследование. Ланцет. 2016;16:161–8.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Du H, Chen L, Tang YW, Kreiswirth BN. Появление гена устойчивости к колистину mcr-1 у устойчивых к карбапенемам энтеробактерий. Ланцет Infect Dis. 2016;16:287–8.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Хенни М., Пуарель Л., Киффер Н., Чатр П., Сарас Э., Метайер В., Дюмулен Р., Нордманн П., Мадек Ю.Ю.Совместное присутствие генов, кодирующих b-лактамазу расширенного спектра и MCR-1, на плазмидах. Ланцет Infect Dis. 2016;16:281–2.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Nordmann P, Poirel L. Устойчивость к колистину, опосредованная плазмидами: дополнительная угроза устойчивости к антибиотикам. Клин Микробиол Инфект. 2016;22(5):398–400.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Пуарель Л., Киффер Н., Лиассин Н., Тан Д., Нордманн П.Плазмид-опосредованная резистентность к карбапенему и колистину в клиническом изоляте Escherichia coli . Ланцет Infect Dis. 2016;16:281.

    КАС Статья Google ученый

  • Nordmann P, Lienhard R, Kieffer N, Clerc O, Poirel L. Плазмид-опосредованная резистентная к колистину Escherichia coli бактериемия в Швейцарии. Клин Инфекция Дис. 2016;62:1322–3.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Holtz KM, Kantrowitz ER.Механизм реакции щелочной фосфатазы: данные ЯМР, кристаллографии и сайт-специфического мутагенеза. ФЭБС лат. 1999; 462:7–11.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Клеланд В.В., Хенгге AC. Ферментативные механизмы переноса фосфатов и сульфатов. Chem Rev. 2006; 106:3252–78.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Крог А., Ларссон Б., фон Хейне Г., Зоннхаммер Э.Л.Прогнозирование топологии трансмембранных белков с помощью скрытой марковской модели: приложение к полным геномам. Дж Мол Биол. 2001;305(3):567–80.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Xue Z, Xu D, Wang Y, Zhang Y. ThreaDom: извлечение информации о границах белковых доменов из множественных выравниваний потоков. Биоинформатика. 2013;29(13):i247–56.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чжан Ю.Сервер I-TASSER для прогнозирования трехмерной структуры белка. Биоинформатика BMC. 2008; 9:40.

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Рой А., Кучукурал А., Чжан Ю. I-TASSER: унифицированная платформа для автоматизированного прогнозирования структуры и функции белков. Нат Проток. 2010;5(4):725–38.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ян Дж., Ян Р., Рой А., Сюй Д., Пуассон Дж., Чжан Ю.I-TASSER Suite: предсказание структуры и функции белка. Нат Методы. 2015;12(1):7–8.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Институт клинических и лабораторных стандартов. Стандарты эффективности для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. М100-С25. 2015. shop.clsi.org/site/Sample_pdf/M100S25_sample.pdf. По состоянию на 1 августа 2016 г.

  • Studier FW, Moffatt BA. Использование РНК-полимеразы бактериофага Т7 для направленной селективной экспрессии высокого уровня клонированных генов.Дж Мол Биол. 1986; 189: 113–30.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A. Инструменты идентификации и анализа белков на сервере ExPASy. В: Уокер Дж. М., редактор. Справочник по протоколам протеомики. Нью-Йорк: Humana Press; 2005. с. 571–607.

    Глава Google ученый

  • Winn MD, Ballard CC, Cowtan KD, Dodson EJ, Emsley P, Evans PR, Keegan RM, Krissinel EB, Leslie AG, McCoy A, et al.Обзор пакета CCP4 и текущих разработок. Acta Crystallogr D. 2011; 67 (Pt 4): 235–42.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Battye TG, Kontogiannis L, Johnson O, Powell HR, Leslie AG. iMOSFLM: новый графический интерфейс для обработки дифракционных изображений с помощью MOSFLM. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2011; 67 (часть 4): 271–81.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Эванс П.Масштабирование и оценка качества данных. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2006; 62 (часть 1): 72–82.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Скубак П., Панну Н.С. Автоматическое определение структуры белка по данным слабого рентгеновского излучения. Нац коммун. 2013;4:2777.

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Абрахамс Дж.П., Лесли А.Г. Методы, использованные для определения структуры бычьей митохондриальной АТФазы F1.Acta Crystallogr D. 1996; 52 (Pt 1): 30–42.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Вагин А.А., Штайнер Р.А., Лебедев А.А., Поттертон Л., МакНиколас С., Лонг Ф., Муршудов Г.Н. Словарь REFMAC5: систематизация предшествующих химических знаний и рекомендации по их использованию. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2004; 60 (часть 12 часть 1): 2184–95.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Коутан К.Программное обеспечение Buccaneer для автоматизированного построения моделей. 1. Отслеживание белковых цепей. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2006; 62 (часть 9): 1002–11.

    Артикул пабмед Google ученый

  • Шелдрик ГМ. Краткая история SHELX. Acta Crystallogr A. 2008; 64 (Pt 1): 112–22.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Коутан К. Последние разработки в классической модификации плотности.Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2010; 66 (часть 4): 470–8.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Скубак П., Ватерреус В.Дж., Панну Н.С. Комбинация многовариантных фаз улучшает автоматизированное построение кристаллографической модели. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2010; 66 (часть 7): 783–8.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Муршудов Г.Н., Скубак П., Лебедев А.А., Панну Н.С., Штайнер Р.А., Николлс Р.А., Винн М.Д., Лонг Ф., Вагин А.А.REFMAC5 для уточнения макромолекулярных кристаллических структур. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2011; 67 (часть 4): 355–67.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шелдрик ГМ. Экспериментальная фаза с SHELXC/D/E: сочетание отслеживания цепи с изменением плотности. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2010; 66 (часть 4): 479–85.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Адамс П.Д., Афонин П.В., Бункоци Г., Чен В.Б., Дэвис И.В., Эколс Н., Хедд Дж.Дж., Хунг Л.В., Капрал Г.Дж., Гроссе-Кунстлеве Р.В. и др.PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярной структуры. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2010; 66 (часть 2): 213–21.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Афонин П.В., Гроссе-Кунстлеве Р.В., Эколс Н., Хедд Дж.Дж., Мориарти Н.В., Мустякимов М., Тервиллигер Т.С., Уржумцев А., Цварт П.Х., Адамс П.Д. На пути к автоматизированному уточнению кристаллографической структуры с помощью phenix.refine. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр.2012; 68 (часть 4): 352–67.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чен В.Б., Арендал 3-й В.Б., Хедд Дж.Дж., Киди Д.А., Иммормино Р.М., Капрал Г.Дж., Мюррей Л.В., Ричардсон Дж.С., Ричардсон, округ Колумбия. MolProbity: проверка структуры всех атомов для макромолекулярной кристаллографии. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2010; 66 (часть 1): 12–21.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Йостен Р.П., Лонг Ф., Муршудов Г.Н., Перракис А.Сервер PDB_REDO для оптимизации моделей структуры макромолекул. IUCrJ. 2014; 1 (часть 4): 213–20.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Krissinel E, Henrick K. Согласование вторичной структуры (SSM), новый инструмент для быстрого выравнивания структуры белка в трех измерениях. Acta Crystallogr D Биол Кристаллогр. 2004; 60 (часть 12): 2256–68.

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Pettersen EFGT, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE.UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. J Comput Chem. 2004; 13:1605–12.

    Артикул Google ученый

  • Основанный на модели подход к характеристике ферментативно-опосредованного ответа на лечение антибиотиками: выход за рамки классификации SIR

    Abstract

    Для разработки соответствующих методов лечения необходимо иметь возможность точно охарактеризовать реакцию бактерий на антибиотики. При воздействии на β-лактамы бактерии могут быть устойчивыми и/или толерантными, а популяции могут проявлять устойчивость.Распутывание этих явлений является сложной задачей, и до сих пор не было предложено единого понимания. Поскольку эти реакции включают процессы, происходящие на нескольких уровнях, включая молекулярный уровень (например, деградация антибиотиков), уровень клеточной физиологии (филаментация) и уровень популяции (выброс β-лактамаз в окружающую среду), необходимы количественные подходы к моделированию. Здесь мы предлагаем модель бактериального ответа на лечение β-лактамом, которая объясняет устойчивость бактерий, толерантность и устойчивость популяции.Наша модель может быть откалибрована исключительно на основе показаний оптической плотности, может предсказать эффект инокулята и приводит к механистически релевантной классификации бактериального ответа на лечение, которая выходит за рамки классической классификации восприимчивых/промежуточных/резистентных. Опосредованная филаментацией толерантность и коллективная ферментативно-опосредованная деградация антибиотиков являются важными характеристиками модели, объясняющими сложную наблюдаемую реакцию клеточных популяций на лечение антибиотиками.

    Введение

    Устойчивость к антибиотикам является одной из основных проблем здравоохранения нашего времени.Чтобы принять соответствующие решения о лечении конкретных клинических изолятов, необходимо как можно точнее их охарактеризовать. Стандартная классификация чувствительный/промежуточный/резистентный (SIR) основана на измерении в стандартных условиях единственного показателя чувствительности штамма к антибиотику – минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Однако реакция клеточной популяции на лечение антибиотиками является многофакторной и может быть описана с точки зрения резистентности (способность клетки расти и делиться в присутствии антибиотиков), толерантности (способность клетки выживать). в присутствии антибиотиков), или устойчивость (способность клеток популяции по восстанавливаться после лечения).Это поднимает вопрос, можно ли извлечь больше информации о восприимчивости клеток к антибиотику из всей кривой роста клеточной популяции (рис. 1А). Это тем более актуально, учитывая, что кривые роста оптической плотности (OD) могут быть легко доступны для диагностических целей в клинических условиях.

    Рисунок 1: Характеристика ответа на антибиотики с использованием кривых роста OD.

    A. Использование всей информации, доступной в кривых роста OD, может быть более информативным.Вверху: минимальные ингибирующие концентрации (МИК) измерены с уникальным моментом времени в 18 часов. Изоляты А и В имеют высокую МИК, тогда как изолят С имеет низкую МИК. Внизу: Отслеживание оптической плотности (OD) культур во время эксперимента позволяет выявить, что штаммы A и B ведут себя по-разному, несмотря на одинаковую МИК. Можно охарактеризовать А как высокоустойчивый, а Б как слабоустойчивый, но терпимый и устойчивый. Штамм C не является ни устойчивым, ни толерантным. Б. Наш подход.Тестируемые изоляты инокулируют на 96-луночный планшет и применяют различные концентрации антибиотиков. OD считывается автоматическим устройством для считывания планшетов и обрабатывается автоматически. Затем данные вводятся в модель, для которой оцениваются числовые параметры вместе с их неопределенностями для каждого изолята. На основе этих параметров можно использовать подход машинного обучения для классификации штаммов по кластерам.

    Хотя тонкие детали механизмов все еще изучаются 1–5 , известно, что молекулярный механизм действия β-лактамных антибиотиков заключается в инактивации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), что отключает способность клетке синтезировать или восстанавливать свою клеточную стенку.Более ранние исследования также показали, что эти молекулярные действия могут привести к резким изменениям формы клеток у бактерий при лечении антибиотиками. Многие β-лактамы вызывают филаментацию, но некоторые могут также вызывать появление сферопластов, яйцевидных или выпуклых клеток 6–8 . Эти процессы задерживают лизис и, следовательно, являются формой толерантности 9 . Также были проведены исследования реакции клеточной популяции на лечение бета-лактамами, подчеркивая роль ферментативно-опосредованной устойчивости (также называемой коллективной толерантностью к антибиотикам (CAT)) либо посредством измерения ОП, либо путем подсчета клеток 10–12 .Однако, даже если механизмы ускользания в настоящее время частично понятны на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях, до сих пор не было предложено консолидированного видения их комбинированных эффектов для количественного объяснения динамики ответа клеточных популяций, обработанных β-лактамами. Мы связываем это со сложностью задействованных явлений, а также с внутренними экспериментальными или концептуальными проблемами, связанными с двумя основными наблюдаемыми в этой системе: подсчет клеток требует постоянных и трудоемких вмешательств, а интерпретация измерений ОП, как известно, затруднена в присутствии филаментация или отек.

    В этом исследовании мы решаем сложную проблему точной характеристики штаммов только с помощью измерений OD, чтобы обеспечить возможность реализации подхода в клинических условиях, которые часто ограничиваются такого рода измерениями. Таким образом, мы сосредоточились на использовании устройства для считывания планшетов для получения кривых ответа ОП различных клинических изолятов E. coli на обработку бета-лактамом в лунках микропланшета. Мы наблюдали большое разнообразие динамики ответов. Тем не менее, ограничение анализа этими данными создает информационную проблему, в частности, из-за декорреляции между числом живых клеток и показателями оптической плотности в присутствии филаментации, а также из-за сложности доступа к другим представляющим интерес величинам в системе, таким как эволюция концентраций химических веществ. видов в культуральной среде.По этой причине мы объединили знания в области бактериальной реакции на бета-лактамы в математическую модель, охватывающую молекулярный, клеточный уровни физиологии и популяции, достаточно общую, чтобы отразить динамику всех рассматриваемых изолятов, и достаточно простую, чтобы ее можно было идентифицировать только по данным ОД. Результатом этих целенаправленных усилий по моделированию стала модель, способная правильно предсказать хорошо известные наблюдения, такие как эффект инокулята, который описывает, как МИК увеличивается с начальным количеством клеток.Подгонка этой модели к данным, которые мы собрали для клинических изолятов, позволила нам извлечь значения параметров и неопределенности, характерные для каждого отдельного изолята. Затем это привело к появлению естественной классификации различных изолятов с точки зрения устойчивости и толерантности. Поскольку эта классификация имеет механистический смысл, она выходит за рамки системы SIR. Полный подход представлен на рисунке 1B.

    Результаты

    Регистрация динамики оптической плотности, числа клеток и распределения по длине в механистической модели

    Задача подхода, показанного на рис. 1В, состоит в описании многих различных процессов на основе неполных, но лонгитюдных данных, собранных для клеточных культур, обработанных антибиотиками. .Чтобы оценить возможность решения этой проблемы, мы построили математическую модель реакции популяции бактерий на лечение бета-лактамами, направленное на удлинение клеток, включая все соответствующие процессы на молекулярном, одноклеточном и популяционном уровнях. Примечательно, что модель также включает динамические процессы, которые трудно измерить в клиническом контексте, и поэтому их можно использовать для восстановления скрытой динамики на основе экспериментальных данных.

    Моделирование длины клеток и филаментации необходимо для объяснения толерантности к лечению бета-лактамом 9 .Однако простое рассмотрение того факта, что все клетки имеют одинаковую длину, которая увеличивается со временем из-за филаментации, не может объяснить сложную динамику клеточного лизиса. Действительно, умирают только самые длинные клетки, что создает нетривиальную обратную связь по средней длине выживших клеток. Следовательно, требуется учет гетерогенности длин клеток в выживающей клеточной популяции. Поэтому мы разработали модель уравнения в частных производных (PDE) временной эволюции распределения длины клеток в популяции и описали с помощью обыкновенных дифференциальных уравнений (ODE) другие процессы, такие как активная деградация антибиотика высвобождаемыми β-лактамазами. в среде при лизисе клеток.Эволюция распределения длины клеток представлена ​​процессом фрагментации роста, который основан на предположении, что клетки экспоненциально удлиняются и делятся со скоростью, зависящей от их длины, возможно, более чем на два фрагмента, что особенно характерно для нитевидных клеток. после отмены антибиотика 13 . Поскольку некоторые β-лактамы, такие как цефотаксим, могут ингибировать PBP3, участвующий в формировании перегородки 14,15 , предполагается, что скорость деления является уменьшающейся функцией концентрации антибиотика в среде.Однако скорость удлинения зависит только от концентрации питательных веществ и остается неизменной под действием антибиотика, как и в случае большинства β-лактамов 10 .

    Известно, что при заданной концентрации β-лактама время до лизиса клеток обратно пропорционально скорости роста 16 . Это говорит о том, что механизм смерти можно легко смоделировать с помощью критической длины клетки, достижимой при блокировании клеточного деления. Клеточные нити длиннее этого порога подвержены значительной гибели (рис. 2А).Это делает лизис клеток прямой функцией не самого антибиотика, а длины клетки, которая резко увеличивается из-за антибиотика. Антибиотик, однако, в высоких дозах может уменьшать эту критическую длину за счет ингибирования других PBPs, таких как PBP1s, которые играют фундаментальную роль в репарации дефектов стенок 5 .

    Рисунок 2: Многомасштабная модель воздействия бета-лактамом на клеточные популяции.

    A. Графическое представление модели. Реакция клеток : Клетки экспоненциально удлиняются со скоростью g , которая зависит от питательных веществ, но не зависит от антибиотика.Выше концентрации k 1 антибиотик ингибирует PBP3, что лишает клетки способности делиться. Клетки, которые не могут делиться филаментом, пока не достигнут критической длины L max, после чего они погибают со скоростью γ . Более высокие концентрации антибиотиков, около k 2 , ингибируют PBP1, что делает клетки хрупкими и уменьшает критическую длину, так что клетки умирают раньше. Справа изображены схематические изображения типичного ответа клеточной культуры на начальное лечение антибиотиками. Реакция популяции : Когда клеточная популяция подвергается воздействию β-лактамной обработки (красные точки), клетки удлиняются и в конечном итоге лизируются, высвобождая β-лактамазу в окружающую среду (синие кружки), которая разлагает антибиотик, таким образом защищая выжившие клетки. B. Сравнение экспериментальных данных и подгонки модели. Изолят ANSES 32139 обрабатывают различными концентрациями цефотаксима (CTX) и измеряют оптическую плотность и число живых клеток (точки), как описано в разделе «Методы».Для номеров клеток мы также показываем 95% доверительные интервалы при оценке обратной задачи КОЕ (см. Методы). Данные для OD были субдискретизированы для ясности. Сплошными линиями мы показываем результат модели, подогнанной только по OD, а пунктирными линиями — модель, подогнанную одновременно по OD и номеру ячейки. Модель также выводит прогнозы для средней длины клеток и концентрации антибиотиков и других химических веществ в культуральной среде.

    Все бактерии в этом исследовании экспрессируют β-лактамазы, ферменты, высвобождаемые в культуральной среде при лизисе клеток, со способностью расщеплять молекулы антибиотиков 17 .Хотя штаммы могут экспрессировать несколько β-лактамаз с разной эффективностью, модель объединяет их в одну среднюю. Концентрацию антибиотиков, а также β-лактамаз отслеживают с помощью ОДУ. Модель также учитывает избыточную OD, вносимую фрагментами лизированных клеток (мертвая биомасса). Уравнения соответствующей модели PDE приведены в разделе «Методы» и более подробно описаны в дополнительном тексте A и B. f, t ) сохранить только его первые моменты: число ячеек N и среднюю длину L .ОДУ для этих величин включают парциальные моменты распределения длин клеток, которые нам удалось выразить только в терминах N и L посредством тщательных приближений (см. Дополнительный текст A для деталей).

    Автоматизируя устройство для считывания микропланшетов с помощью пользовательского драйвера plateRider , мы получили экспериментальные данные, используя протокол, предназначенный для демонстрации строгого монодного роста в отсутствие обработки, ограничения испарения и корректировки нелинейности измерений ОП (см. Методы и Дополнительный текст C, D, E и F).Модель адаптировали к OD и данным подсчета живых клеток, как описано в разделе «Методы». На рисунке 2B показаны экспериментальные данные для эталонного штамма, подвергнутого воздействию различных начальных концентраций цефотаксима, а также модели моделирования, адаптированные к данным. На этом рисунке показано, что наша модель предлагает очень хорошее согласие с экспериментальными данными и дополнительную информацию о процессах, которые нелегко измерить, таких как средняя длина клетки или химический состав культуральной среды.

    Кроме того, и это важно, согласие остается хорошим независимо от того, подгоняем ли мы его по OD и номеру клетки или только по OD и заставляем его предсказывать номер клетки (см. также дополнительный текст G для другого изолята).Это показывает, что в кривых роста OD достаточно информации, чтобы приподнять завесу над важными скрытыми процессами, такими как эволюция числа живых клеток. Наконец, он также качественно отражает эволюцию длины клеток, наблюдаемую с помощью микроскопа (дополнительный текст H). Чтобы еще больше оспорить предсказательную силу нашей модели, мы проверили ее способность количественно предсказывать эффект инокулята.

    Прогнозирование эффекта инокулята

    Известно, что активная деградация антибиотика под действием β-лактамаз, высвобождаемых в культуральную среду при лизисе клеток, вызывает снижение наблюдаемой эффективности антибиотика по мере увеличения начальной плотности клеток, явление, известное как эффект инокулята 18,19 (рис. 3А).Это может привести к повторному росту популяции, а затем к проявлению устойчивости, также известной как коллективная толерантность к антибиотикам. Количественная характеристика этого эффекта была предметом нескольких исследований 11,20 , поскольку его детальное понимание будет иметь решающее значение при разработке оптимальных методов лечения 21 или методов лечения, адаптированных к предполагаемой плотности клеток в месте инфекции 22 .

    Рисунок 3: Количественное прогнозирование эффекта инокулята.

    А. Действие антибиотика зависит от исходной плотности клеток. При низкой плотности клеток высвобождаемых β-лактамаз недостаточно для выведения антибиотика из среды до лизиса всех клеток. При высокой плотности клеток может погибнуть достаточное количество «жертвенных клеток», чтобы высвободить количество β-лактамазы, способное выводить антибиотик до того, как все клетки лизируются. Затем оставшиеся клетки могут в конечном итоге делиться и воссоздавать популяцию, демонстрируя устойчивость. B. Слева кривые роста OD, измеренные для разных инокулятов, предсказываются моделью после подбора только двух промежуточных инокулятов.Точно предсказываются как крах, так и повторный рост, но разные для каждой пары инокулята/концентрации антибиотика. Справа также прогнозируется эволюция MIC в зависимости от начального количества клеток. Вертикальные столбцы представляют собой самые низкие (самые высокие) концентрации тестируемых антибиотиков, при которых оптическая плотность клеток была ниже (выше) 0,1 через 20 часов.

    Эталонный штамм (ANSES 32139) выращивали в присутствии ряда концентраций антибиотиков, начиная с нескольких плотностей клеток.Как показано на Рисунке 3B (слева), эффект инокулята действительно проявляется в результате моделирования модели, даже несмотря на то, что в этом случае модель была подобрана только для двух из восьми плотностей посева и может быть экстраполирована на другие. Получение этих прогнозов далеко не тривиально, поскольку требует не только точного определения механизма клиренса антибиотика β-лактамазами и эволюции числа выживших клеток для прогнозирования повторного роста популяции, но и экстраполяции этой информации на условия. что модель никогда не видела.

    Чтобы дополнительно охарактеризовать эффект, экспериментальные и прогнозируемые МИК были нанесены вместе на рис. 3В (справа). В соответствии с недавними экспериментальными, а также теоретическими результатами 11 , мы обнаружили, что при низкой плотности клеток, измеренный MIC является экспоненциальной функцией исходной плотности клеток.

    Учет разнообразия ответов ряда клинических изолятов

    Эксперименты по кривой роста были проведены на коллекции из 9 клинических изолятов E. coli , выбранных для экспрессии репрезентативной панели различных семейств β-лактамаз, включая карбапенемазы.Изоляты, все принадлежащие к типу последовательности (ST) 410, были выбраны с чувствительностью к цефотаксиму в диапазоне от полной чувствительности до высокой устойчивости. Кроме того, некоторые из этих изолятов содержат мутации в PBP3 ( ftsI ) или поринах ( ompC и ompF ), что способствует снижению чувствительности к антибиотикам 23 (рис. 4A и дополнительный текст I).

    Рисунок 4: Характеристика клинических изолятов.

    A. Каждый клинический изолят, рассмотренный в этом исследовании, кодирует одну или несколько β-лактамаз, включая карбапенемазы.В пяти из них также обнаружены мутации в генах, кодирующих PBP3 или порины, что снижает чувствительность клетки к антибиотикам. B. Экспериментальные данные были собраны для 9 клинических изолятов с 12 начальными концентрациями антибиотика в каждом (слева), а подбор параметров был применен к измерениям OD (справа). C. Кластеризация t-SNE на основе доверительных интервалов подобранных параметров. Слева: 515 случайных наборов параметров использовались для создания синтетических экспериментов, включая смоделированный шум измерения.Мы подогнали модель к этим экспериментам и классифицировали синтетические изоляты в соответствии с практической идентифицируемостью этих подобранных параметров. Появилось несколько групп, фенотипически однородных. Группы, у которых нет ограничений роста, показаны более прозрачными, поскольку они соответствуют неправдоподобным биологическим условиям. Справа: 9 клинических изолятов были классифицированы таким же образом, что привело к созданию трех фенотипических групп, наблюдаемых при синтетическом подходе. Два изолята, помеченные N, соответствуют как данным OD, так и количеству клеток, остальные соответствуют только данным OD.С обеих сторон для каждой группы предусмотрено по одному репрезентативному участку.

    Та же самая процедура подбора параметров была применена к каждому изоляту, показанному на рисунке 4B. Мы получили очень хорошее соответствие данным с нашей моделью, результат, который нам было сложно воспроизвести с любой другой стандартной моделью ОДУ, которую мы рассматривали. Мы пришли к выводу, что учет неоднородности длин клеток, либо явно с использованием модели PDE, либо неявно с помощью модели ODE, полученной из нее, имеет важное значение. Более того, наша модель количественно отражает не только кривые OD, но и эволюцию количества клеток, как показано для двух из девяти изолятов на рисунке 2B и в дополнительном тексте G.

    Интерпретируя мутации, придающие устойчивость, как дискретные события, значительно изменяющие значение связанных параметров, мы искали признаки мутаций ftsI , ompC и ompF в наборах параметров, соответствующих изолятам, в которых они появляются. Мы действительно обнаружили, что самые высокие значения параметра, контролирующего чувствительность PBP3 к антибиотику, были приписаны изолятам с мутациями на ftsI в ожидаемом порядке эффективности мутаций (дополнительный текст J).

    Кроме того, используя литературные данные, мы оценили эффективность CTX-M-1, CTX-M-15, CTX-M-55, TEM-1, NBM-5, CMY-2, CMY-22 и OXA. -181 β-лактамаз на цефотаксиме и обнаружили, что изоляты с несколькими β-лактамазами действительно связаны с моделями с высокими значениями параметров, контролирующих эффективность β-лактамаз (дополнительный текст K).

    Классификация изолятов по значимым категориям с помощью анализа идентифицируемости

    Помимо их внутренней ценности, описывающей штамм, девять наборов параметров, полученных путем оценки параметров из девяти изолятов, также можно рассматривать в отношении друг друга.Сходное поведение у разных изолятов должно проявляться в сходных значениях параметров у этих штаммов. Чтобы избежать визуализации данных в 17-мерном пространстве, мы использовали t-распределенное стохастическое вложение соседей (t-SNE), статистический метод для визуализации данных высокой размерности на картах низкой размерности. t-SNE учитывает близость между точками: две точки, близкие в пространстве высокой размерности, должны быть отображены на точки, близкие в пространстве низкой размерности.

    Однако прямая кластеризация изолятов на основе значений параметров не позволяет надежно идентифицировать кластеры (дополнительный текст L).Это связано с наличием неидентифицируемости в модели. Несмотря на то, что мы подтвердили, что модель в принципе полностью идентифицируема, всегда может случиться так, что диапазон антибиотиков, используемых экспериментально, недостаточен для того, чтобы заставить штамм полностью проявлять все возможные ожидаемые поведения. Следовательно, для высокоустойчивых или восприимчивых изолятов имеющихся данных недостаточно, чтобы можно было получить строго ограниченное значение для всех параметров модели. В этих случаях эти параметры практически невозможно идентифицировать, а их подогнанные значения подвержены большой изменчивости.Следовательно, два родственных изолята могут не выглядеть одинаково с точки зрения значений параметров из-за неидентифицируемой части модели.

    Однако мы поняли, что эту проблему идентификации можно использовать. Действительно, сходные изоляты могут быть более похожими по параметру идентифицируемости , чем по параметру по значениям . Алгоритмы подбора параметров также могут возвращать, в дополнение к набору параметров, максимизирующему вероятность данных, оценку матрицы кривизны вероятности в оптимальной точке.В первом приближении эта матрица кривизны может быть использована для построения доверительных интервалов вокруг оптимального набора параметров.

    Чтобы сначала протестировать этот подход in silico , мы создали коллекцию из 515 синтетических клинических изолятов путем случайной выборки значений параметров в биологически правдоподобных пределах. Мы использовали эти параметры для получения данных с имитацией экспериментального шума и использовали наш подход к калибровке этих данных для получения подогнанных значений параметров и неопределенностей.Как видно из реальных экспериментальных данных, кластеризация синтетических изолятов на основе значений параметров не приводит к окончательным результатам (дополнительный текст L). Напротив, кластеризация синтетических изолятов на основе этих доверительных интервалов дает несколько групп, которые фенотипически однородны, как показано на рисунке 4C (слева). Эта классификация в основном ортогональна SIR, несколько групп состоят из смеси изолятов S, I и R.

    Обрабатывая таким же образом коллекцию из 9 клинических изолятов, мы наблюдали появление трех кластеров.Важно отметить, что каждый кластер может быть связан с определенным способом ответа на лечение. Более конкретно, мы получаем один кластер для штаммов, которые не проявляют значительной филаментации и не подвержены влиянию антибиотика, один кластер для штаммов, на которые антибиотик воздействует с образованием филаментов и массовой гибелью клеток, но которые достаточно толерантны, чтобы небольшая суб- популяция выживших выздоравливает после промежуточных обработок, и один кластер для изолятов, которые умирают раньше и не могут восстановиться даже после промежуточных обработок.То есть, используя неконтролируемый кластерный подход, мы наблюдали появление классификации изоляционных ответов на три механически релевантных класса: восприимчивые, толерантные и устойчивые (STR). Следует подчеркнуть, что эта классификация отличается от системы SIR: изоляты, классифицированные как устойчивые на основании их значений МИК, различаются на основе их фактической реакции на лечение на толерантные и добросовестно устойчивые изоляты. Интересно, что среди групп, наблюдаемых в синтетическом исследовании, присутствовали одни и те же классы: устойчивые изоляты коллекции были обнаружены в кластере H, толерантные изоляты были обнаружены в кластере E, а восприимчивые изоляты в кластере C.Тем не менее, не все модели поведения, наблюдаемые в нашей коллекции синтетических изолятов, наблюдались у настоящих изолятов. Это поднимает вопрос, является ли такое поведение биологически невозможным или просто отсутствует в нашей коллекции.

    Обсуждение

    Поскольку медицина все больше ориентируется на персонализацию, быстрое определение свойств изолята, вызывающего инфекцию, представляет собой конкретную и полезную информацию для лечащего врача. Текущий стандарт представляет собой систему из 3 групп: SIR, обозначающую чувствительные, промежуточные и устойчивые бактерии.Критерии включения в эти группы состоят в сравнении МПК изолята с пороговыми значениями, характерными для типов клеток и антибиотиков, которые ежегодно обновляются органами здравоохранения. Однако описание реакции изолята на лечение уникальным номером обязательно приводит к чрезвычайно грубому представлению. Более того, различие между различными группами основано на довольно произвольных пороговых значениях без какой-либо механистической интерпретации.

    В этом исследовании мы представили основанный на модели подход к классификации E.coli клинических изолятов, проявляющих опосредованную ферментами резистентность к антибиотикам, толерантность и популяционную устойчивость. Модель, основанная на уравнении роста-фрагментации и на ограниченном числе простых биологических гипотез, представляет собой всестороннее понимание явлений, происходящих на молекулярном, клеточном физиологическом и популяционном уровнях, а также их взаимодействий. Примечательно, что он отводит центральную роль опосредованной антибиотиками филаментации как способу клеток выиграть время до деградации антибиотика.

    Насколько нам известно, наша модель является первой моделью бактериальной резистентности, толерантности и устойчивости к β-лактамам, способной одновременно предсказывать количество клеток и оптическую плотность клеточной культуры, подвергнутой филаментации и подвергнутой комплексному лечению антибиотиками. Он решает задачу наблюдения и моделирования, с которой сообщество никогда не сталкивалось напрямую. Предыдущие исследования действительно избегали проблемы филаментации, сосредотачиваясь исключительно на измерениях числа клеток 24,25 , или, когда рассматривалась OD, часть кривой роста OD до аварии должна была игнорироваться, если модель не учитывала филаментацию 12 ,26 .Игнорирование участка кривой роста, предшествующего краху, существенно мешает количественно оценить влияние антибиотиков на PBP1.

    Кроме того, мы продемонстрировали, что наша модель способна количественно предсказать эффект инокулята в широком диапазоне инокулятов, полагаясь на характеристику, выполненную только в небольшом диапазоне. Наше моделирование эффекта инокулята исходит из модели клеточного ответа, которая не была специально разработана для эффекта инокулята и, таким образом, не является специальной феноменологической моделью.Наша модель также приводит к оценкам параметров, согласующимся с известным генотипом изолятов.

    Важно отметить, что предлагаемый подход является достаточно мощным, чтобы требовать только данные OD для калибровки модели, наблюдаемые легко доступны, но, как известно, трудно использовать в присутствии филаментации 27 . Мы использовали эту функцию для получения информации о значениях параметров и чувствительности для выбора различных клинических изолятов, а также использовали неконтролируемый кластерный подход для классификации их поведения.Мы наблюдали появление трех отдельных групп с механистическими интерпретациями, что привело к предложению классификации восприимчивых, толерантных и добросовестно устойчивых штаммов, классификации, основанной на значительно более богатой информации, чем система SIR. Этот результат подтверждает наличие бактериальной идентичности и признаков в динамике их роста 28 , и по сравнению с визуальной или автоматической классификацией без модели на необработанных кривых оптической плотности добавляет пояснительный слой, который состоит из ограниченного числа биологически обоснованных моделей. параметры, объясняющие механизмы побега.

    Одним из аспектов реакции бактериальных популяций на антибиотики, не включенных в модель, является персистенция , крайний случай толерантности, используемый для описания субпопуляции клеток с отчетливо отличным от остальной популяции фенотипом. Персистентные клетки не растут, поэтому на них не влияет линейный лизис. Текущее понимание персистеров заключается в том, что они могут выживать при длительном воздействии антибиотиков и стохастически переключаться на нормальный фенотип, чтобы восстановить популяцию после того, как лекарство было очищено.Тот факт, что персистеры не нужны в нашей модели для объяснения повторного роста популяции, показывает, что достаточно толерантные изоляты могут также проявлять способность «выживать при воздействии высоких концентраций антибиотика», признак, обычно связанный с персистенцией 29 .

    Наша модель была разработана для энтеробактерий, подвергшихся лечению цефотаксимом. Этот антибиотик в первую очередь нацелен на PBP, белки, участвующие в клеточном делении, удлинении и поддержании формы клеток.Однако разные β-лактамы могут иметь разное сродство к разным PBP и ингибировать их в разном порядке, что приводит к разным физиологическим реакциям клеток. Например, в то время как ампициллин и цефотаксим, предпочтительно связываясь с PBP3, вызывают выраженную реакцию филаментации, известно, что мециллинам с большим сродством к PBP2 вызывает появление овоидных клеток. Несмотря на то, что наша модель предполагает, что филаментация является основным механизмом толерантности, этот метод в принципе применим более широко.Таким образом, мы ожидаем, что потребуется лишь небольшая адаптация модели для ее адаптации к другим бета-лактамным антибиотикам.

    Наша модель фиксирует не только клеточный ответ на лечение (фармакодинамика), но и эволюцию клеточной среды, то есть культуральной среды в лунке микропланшета (элементарная фармакокинетика). Таким образом, эту работу можно было бы продолжить в двух направлениях. Во-первых, может быть интересно выращивать клетки в параллельных биореакторах небольшого объема, чтобы иметь возможность культивировать клетки в течение более длительного времени и с более высокой плотностью, а также наблюдать влияние персистеров и мутаций и связывать наблюдения с параметрами модели и STR классификация изолятов.Во-вторых, дополнив нашу модель надлежащим компонентом фармакокинетики, мы получили бы прекрасную отправную точку для количественного исследования эффектов обработок in vivo , в которых наша модель могла бы в значительной степени помочь проверить, происходит ли местное высвобождение β-лактамов в этом месте. инфекции может оказать реальное влияние на исход лечения. Действительно, существует известная корреляция между наличием эффекта инокулята in vitro и неэффективностью лечения in vivo 22 .

    Материалы и методы

    Штаммы и антибиотики

    Изоляты E. coli последовательности типа 410, использованные в этом исследовании, кратко описаны на рис. учеба 23 . Цефотаксим был приобретен у Sigma-Aldrich, и разведения были сделаны с учетом чистоты, указанной поставщиком. Антибиотики и исходные растворы хранили при температуре -20°C и регулярно обновляли, чтобы ограничить деградацию.

    Условия выращивания

    Если не указано иное, все предварительные культивирования, культивирования и эксперименты проводили в жидкой среде M9 с 0,1% глюкозы (1 г/л глюкозы, 6,78 г/л Na 2 HPO 4 , 3 г/ L KH 2 PO 4 , 1 г/л NH 4 Cl, 0,5 г/л NaCl, 0,24 г/л MgSO 4 , 0,01 г/л CaCl 2 ). Низкая концентрация глюкозы предназначена для создания условий остановки роста, связанной с углеродом, ситуации, которая лучше поддается математическому моделированию (рост монод, см. Дополнительный текст D).Остановка роста происходит в этой среде между 0,2 и 0,3 OD 600 .

    Получение кривых роста

    Ночь. Одну бактериальную колонию собирали с чашки с агаром и инкубировали в течение ночи при 37°C и 200 об/мин. Прекультура. Ночную среду центрифугировали, ресуспендировали в свежем M9 и разбавляли до 0,05 ОП 600 перед новой инкубацией в течение 3-4 часов в тех же условиях, стремясь уловить клетки в экспоненциальной фазе для начала эксперимента. Подготовка к эксперименту. Клетки из прекультуры центрифугировали, ресуспендировали в свежем М9 и разбавляли до 0,05 OD 600 . В каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном вносили 196 мкл М9, 2 мкл суспензии клеток и 2 мкл исходного раствора антибиотика. В зависимости от конфигурации планшета и количества повторов разведения делались, насколько это возможно, в больших количествах, чтобы свести к минимуму ошибки, связанные с пипетированием малых объемов. Сбор данных. Многорежимный считыватель планшетов Tecan Spark 2017 года использовался для всех измерений OD в сочетании с пользовательским программным драйвером plateRider , что давало нам широкий контроль над измерениями (дополнительный текст C). В качестве планшетов использовали плоскодонные микротитровальные планшеты Corning 3370. 96-луночный планшет был заключен в «влажностную кассету» для ограничения испарения. Измерения ОП проводили в цикле, состоящем из измерения и инкубации при встряхивании. Кассета влажности открыта только во время измерений по графику, оптимизированному для ограничения испарения (дополнительный текст E).Инкубационные периоды проводят при 37°С и длятся 300 с, в течение которых происходит пять инкубационных циклов (40 с неподвижной инкубации, затем 10 с линейного встряхивания (амплитуда 1,8 мм и частота 135 Гц) и 10 с орбитального встряхивания ( амплитуда 5 мм и частота 20 Гц) В каждой точке данных в короткой последовательности проводят 20 измерений ОП одной и той же лунки и возвращают медиану ОП, чтобы исключить возможные выбросы

    Оценка числа живых клеток

    Живые клетки число было оценено методом подсчета КОЕ с использованием специального метода статистического анализа, позволяющего оценить ожидаемое количество клеток и 95% доверительный интервал для каждого значения всего лишь в одной повторности.Мы использовали байесовский вывод, чтобы определить, что если мы наблюдаем O 1 КОЕ из отобранного объема V 0 клеточной культуры объемом V 1 , то вероятность того, что начальное количество клеток N дается

    Формулу можно расширить, включив в нее несколько реплик. Эта формула использовалась для определения ожидаемого начального количества клеток и 95% доверительных интервалов вокруг этого значения (более подробную информацию см. в Ref 30 ).Это сыграло важную роль в минимизации количества разложенных и подсчитанных тарелок.

    Анализ данных

    Гашение наружного диаметра. Измеренная оптическая плотность лунки представляет собой сумму оптической плотности культуры клеток и оптической плотности дна лунки, которая немного различается между лунками одного и того же планшета. По этой причине постоянная ОП была удалена из данных каждой лунки, так что начальное измеренное значение соответствовало экспериментальному начальному разведению клеток. Удаление ошибочных точек времени. Иногда чтение OD дает сбой и возвращает значение, намного превышающее как предыдущее, так и последующее значение той же лунки.Поскольку эта ситуация крайне маловероятна с биологической точки зрения, эти выбросы были удалены перед подгонкой модели. Исправление нелинейности измерений. Было изучено соотношение между измеренной и теоретической OD, и измерения были скорректированы на нелинейность (см. Дополнительный текст F).

    Модели

    Для описания временной эволюции распределения длин клеток n ( l, t ) мы использовали модель роста-фрагментации. Он основан на четырех основных механизмах: клетки непрерывно удлиняются со скоростью г , делятся со скоростью f и при делении, независимо от их длины, всегда делятся на клетки размером до 1 (условная единица), это означает, что филаментированные клетки могут разделиться более чем на 2 клетки.Наконец, они лизируются, когда достигают критической длины L м . Следующие УЧП описывают эти явления:

    PDE инициализируется стационарным распределением длины клеток экспоненциально растущей клеточной популяции: л ) с

    Взаимодействие с антибиотиками учитывается через зависимость этих скоростей и порога от концентрации антибиотиков в культуральной среде.Хотя скорость удлинения не зависит от концентрации антибиотика и подчиняется закону Моно, скорость деления f и критическая длина L м являются убывающими функциями антибиотика:

    В культуральной среде также отслеживаются различные концентрации, такие как питательные вещества s , антибиотики a , β-лактамазы b и мертвая биомасса c и c r Их динамика описывается следующими ОДУ:

    Наконец, оптическая плотность пропорциональна сумме живой и мертвой биомасс:

    Описывает модель PDE.Для вычислительной эффективности мы получили и использовали для калибровки модель ОДУ, аппроксимирующую приведенную выше модель УЧП (см. Дополнительный текст А для подробных объяснений).

    Подгонка модели

    Каждый параметр был ограничен диапазоном биологически правдоподобных значений. В зависимости от роли параметра и размера диапазона применялась или не применялась замена переменной для выполнения поиска этого параметра в линейном пространстве или в логарифмическом пространстве. Затем все 17 диапазонов поиска были возвращены в интервал [0, 10], и именно в этом пространстве [0, 10] 17 был выполнен поиск параметров.

    Функция стоимости вычисляет логарифмическое правдоподобие данных, предполагая независимый гауссовский шум измерений в каждой точке. Особое внимание было уделено поиску в смешанных наборах данных, включающих как измерения оптической плотности, так и количество клеток, чтобы сбалансировать вклад обоих типов данных. Интеграция системы ODE была выполнена с помощью метода solve_ivp из scipy 31 с помощью метода « LSODA », а абсолютные и относительные допуски были установлены на 10 9.Для синтетических экспериментов к оптической плотности применялся аддитивный гауссов шум со стандартным отклонением, которое зависит от оптической плотности, откалиброванной по реальным данным: σ = 0,02 · OD + 10−4.

    Подгонка модели была выполнена с помощью CMAES 32 с начальным значением σ = 2, за исключением случаев, когда требовался локальный поиск. Это особенно касается оценки неопределенности параметров. Затем был использован решатель наименьших квадратов из scipy 31 с методом « trf ».Этот решатель также возвращает информацию о кривизне вокруг оптимума, которую мы интерпретировали для вычисления асимптотических доверительных интервалов для подобранных параметров.

    Вклад авторов

    В.А. и Г.Б. разработали исследование. В.А. спроектировал и провел эксперименты, вывел математические модели, разработал драйвер считывателя планшетов и проанализировал данные. LY обсудила проект и предоставила экспертную информацию о механизмах побега.

    0 comments on “Энзибен замеры сопротивления: Закажите технический отчет по замерам сопротивления изоляции

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.