Схема биосинтеза белка: Ошибка 404. Страница не найдена • Онлайн-школа «Фоксфорд»

Реферат Биосинтез белка и строение рибосом


Скачать (4,84 Mb)


Биосинтез белка – чрезвычайно сложный и энергозатратный процесс. Он является основой жизнедеятельности клетки. Синтез белка осуществляется в рибосомах и проходит в несколько этапов. Двухцепочечная молекула ДНК на основе принципа комплементарности транскрибируется в одноцепочечную молекулу РНК. В результате получается матричная РНК, которая содержит информацию об аминокислотной последовательности белка. Далее мРНК поступает в рибосому и по ней, как по матрице, синтезируется белок, путем перевода генетической информации с языка нуклеотидной последовательности на язык аминокислотной последовательности…

Оглавление

1. Введение
2. Информационная РНК
3. Генетический код
4. Транспортные РНК и аминоацил-тРНК-синтетазы
5. Рибосомы
6. Трансляция
7. Сворачивание и транспорт белков
8. Заключение
9. Список литературы

Жизнь есть способ существования белковых тел. Это определение, данное Фридрихом Энгельсом, указывает на исключительную роль белков в функционировании организмов. Биосинтез белка – чрезвычайно сложный и энергозатратный процесс. Он является основой жизнедеятельности клетки.

Синтез белка осуществляется в рибосомах и проходит в несколько этапов по схеме ДНК→РНК→белок. Двухцепочечная молекула ДНК на основе принципа комплементарности транскрибируется в одноцепочечную молекулу РНК. В результате получается матричная РНК, которая содержит информацию об аминокислотной последовательности белка. Далее мРНК поступает в рибосому и по ней, как по матрице, синтезируется белок, путем перевода генетической информации с языка нуклеотидной последовательности на язык аминокислотной последовательности. Шаг за шагом строится полипептидная цепь, которая в процессе синтеза и после него модифицируется в биологически активный протеин. Синтезированный белок транспортируется в разные участки клетки для выполнения своих функций.
Кодирование аминокислотной последовательности белков осуществляется по определенным правилам, называемых генетическим кодом. Расшифровка генетического кода – очень значимое достижение науки. Код объясняет механизм синтеза белка, происхождение мутаций и другие биологические явления.
Рентгеноструктурный анализ и другие современные методы исследования позволили далеко продвинутся в изучении биосинтеза белка и других аспектов молекулярной биологии. Но тем не менее все еще не установлены пространственные структуры некоторых жизненно важных макромолекул. Науке предстоит ответить на многие вопросы, касающиеся белкового синтеза.

Общая схема биосинтеза белка

Общая схема биосинтеза белков в клетке: ДНК→РНК→белок (Рисунок 1).

Рисунок 1. Общая схема биосинтеза белков в клетке

Транскрипция. Отдельные участки двухцепочечной ДНК (гены) служат матрицами для синтеза на них однотяжевых цепей РНК по принципу комплементарности. Транскрипция проходит в три стадии: инициация, элонгация, терминация.

Процессинг и транспорт. В процессе синтеза РНК подвергается изменениям, в результате которых превращается в зрелую молекулу, пригодную для синтеза белка. Получающаяся информационная (матричная) РНК (мРНК) затем поступает к рибосомам в качестве программы, определяющей аминокислотную последовательность в синтезируемом белке.

Активация и акцептирование аминокислот. Белки состоят из аминокислот, но свободные аминокислоты клетки не могут быть непосредственно использованы рибосомой. Каждая аминокислота сначала активируется с помощью АТФ, а затем присоединяется к специальной молекуле РНК – трансферной (транспортной) РНК (тРНК) вне рибосомы. Получающаяся аминоацил-тРНК поступает в рибосому в качестве субстрата для синтеза белка.

Трансляция. Поток информации в виде мРНК и поток материала в виде аминоацил-тРНК поступают в рибосомы, которые осуществляют перевод (трансляцию) генетической информации с языка нуклеотидной последовательности мРНК на язык аминокислотной. Каждая рибосома движется вдоль мРНК от одного конца к другому и соответственно выбирает из среды те аминоацил-тРНК, которые соответствуют (комплементарны) триплетным комбинациям нуклеотидов, находящимся в данный момент в рибосоме. Аминокислотный остаток выбранной аминоацил-тРНК каждый раз ковалентно присоединяется рибосомой к растущей полипептидной цепи, а деацилированная тРНК освобождается из рибосомы в раствор. Так последовательно строится полипептидная цепь.

Формирование функционального белка. По ходу синтеза полипептидная цепь высвобождается из рибосомы и сворачиваться в глобулу. Сворачивание и транспорт белка сопровождаются ферментативными модификациями (процессинг белка).

Несмотря на большую сложность аппарата биосинтеза белков, он протекает с чрезвычайно высокой скоростью. Синтез тысяч различных белков в каждой клетке строго упорядочен – при данных условиях метаболизма синтезируется лишь необходимое число молекул каждого белка.

Информационная (матричная) РНК (мРНК) – РНК, являющаяся комплементарной копией участков значащих цепей генов ДНК, содержащих информацию об аминокислотных последовательностях полипептидных цепей белков.

Структура мРНК

Первичная структура

Рисунок 2. Химическое строение полинуклеотида РНК

Матричная РНК — одноцепочечный полинуклеотид (Рисунок 2). Он состоит из четырех нуклеотидов. Нуклеотид ы состоят из азотистого основания (аденин – А, гуанин – G, цитозин – C и урацил – U), сахара рибозы и фосфатной группы. 5′-гидроксил концевого нуклеозида (молекула, содержащая азотистое основание, связанное с сахаром) не образует связи между нуклеотидами. Он обозначается как 5′-конец РНК, а другой концевой нуклеозид со свободным З’-гидроксилом называют З’-концом РНК. мРНК читается рибосомой в направлении от 5′-конца к З’-концу .
В природных мРНК 5′-концевой гидроксил всегда замещен. мРНК эукариотов в большинстве случаев несут на 5′-конце специальную группу – кэп (Рисунок 3). Кэп представляет собой остаток 7-метилгуанозина (Рисунок 4).

 

Рисунок 3. Строение 5′-конца кэпированной мРНК

Рисунок 4. Модель молекулы 7-метилгуанозина

Функциональные участки мРНК

Чаще всего началом (инициаторным кодоном) кодирующей части мРНК яв¬ляется AUG. Не любой триплет может стать инициаторным. Это определяется собственной структурой кодона и положением в структуре мРНК.
мРНК может содержать нуклеотидные последовательности для кодирования нескольких белков. Это характерно для прокариот. Такие мРНК называются полицистронными. У эукариот мРНК обычно кодируют одну полипептидную цепь (моноцистронные мРНК).

Пространственная структура

Рисунок 5. Вторичная структура РНК

Трехмерная структура мРНК еще не установлена. Измерения физических параметров мРНК свидетельствуют о том, что они являются сильно свернутыми структурами, с внутрицепными взаимодействиями между азотистыми основаниями. Вторичная структура мРНК образована благодаря комплементарному спариванию отдельных участков одной и той же цепи друг с другом, с образованием большого набора относительно коротких двуспиральных участков (Рисунок 5).
Вторичная и третичная структуры мРНК играют определенную роль в трансляции. Однако роль вторичной и третичной структуры мРНК в скорости считывания цепи не установлена.
Некодирующие последовательности мРНК участвуют в определении специальных пространственных структур, ответственных за регулирование инициации трансляции, элонгации и других процессов.

Так как существует только 4 нуклеотида в мРНК и 20 аминокислот в белке, то трансляция не может быть осуществляется на основе прямого соотношения между нуклеотидами РНК и аминокислотами в белке. Нуклеотидная последовательность гена через посредничество мРНК транслируется в аминокислотную последовательность по правилам, известным как генетический код.

Генетический код – способ сохранения наследственной информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот. Этот код был расшифрован в 1960-ых. Генетический код, основан на использовании алфавита, состоящего из четырех букв: А, Г, Ц и Т. Эти буквы соответствуют нуклеотидам, найденным в ДНК: аденин, гуанин, цитозин, тимин.
Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК читается непрерывными группами из трех нуклеотидов, называемых триплетами или кодонами. РНК представляет собой линейные полимер, состоящий из четырех разных нуклеотидов, поэтому возможны 4•4•4=64 комбинации трех нуклеотидов. Белки состоят из 20 аминокислот. Поэтому либо некоторые триплеты не используются, либо некоторые аминокислоты кодируются более, чем одним триплетом.
Различают два типа кодонов— смысловые, или значащие кодоны, и бессмысленные кодоны, или нонсенс-кодоны. Большинство (61) кодонов — значащие и только 3 (UAA, UAG, UGA) – нонсенс-кодоны. Смысловые кодоны соответствуют аминокислотам, а кодон AUG, помимо кодирования митионина, является инициирующим, или стартовым кодоном. Нонсенс-кодоны являются терминирующими кодонами, или стоп-кодонами.

Свойства генетического кода

Генетический код является неперекрываемым, непрерывным, специфичным, универсальным и вырожденным.

Неперекрываемость кода означает, что каждый нуклеотид входит только в один кодон, и поэтому изменения любого нуклеотида изменяют смысл только одного кодона.

Генетический код непрерывен. Он имеет линейный непрерывающийся порядок считывания. Кодоны транслируются всегда целиком. Расположение остатков аминокислот в синтезируемом полипептиде определяется антикодоном тРНК (триплет нуклеотидов, комплементарный одному из кодонов) .

Специфичность кода означает, что код является однозначным, поскольку каждый кодонный триплет кодирует только одну аминокислоту, и с одной мРНК можно синтезировать только одинаковые пептиды,

Генетический код универсален для всех живых существ – у всех живых организмов, включая вирусы и бактерии, одинаковые кодоны (триплеты нуклеотидов) кодируют одинаковые аминокислоты. Исключение составляют 4 кодона митохондрий грибов и животных, имеющих информационный смысл, отличный от универсального кода.

Вырожденность кода означает его избыточность, синонимичность, то есть одну аминокислоту может кодировать более одного триплета. Однако вырожденность не абсолютна. Например, метионину соответствует только один кодон.

До расшифровки генетического кода было невозможно понять механизм синтеза белка и объяснить происхождение мутаций. Открытие генетического кода позволило ответить на вопрос о том, как связаны между собой дефекты определенных белков человека и наследственные заболевания.

Генетический код

1-ая позиция (5’ конец)

2-ая позиция

3-ая позиция (3’ конец)

U

C

A

G

U

Phe
Phe
Leu
Leu

Ser
Ser
Ser
Ser

Tyr
Tyr
STOP
STOP

Cys
Cys
STOP
Trp

U
C
A
G

C

Leu
Leu
Leu
Leu

Pro
Pro
Pro
Pro

His
His
Gln
Gln

Arg
Arg
Arg
Arg

U
C
A
G

A

lle
lle
lle
Met

Thr
Thr
Thr
Thr

Asn
Asn
Lys
Lys

Ser
Ser
Arg
Arg

U
C
A
G

G

Val
Val
Val
Val

Ala
Ala
Ala
Ala

Asp
Asp
Glu
Glu

Gly
Gly
Gly
Gly

U
C
A
G

 

Аминокислоты и их символы

Кодоны

A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
A
R
S
T
V
W
Y
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Alanine
Cysteine
Aspartic acid
Glutamic acid
Phenylalani
Glycine
Histidine
Isoleucine
Lysine
Leucine
Methionine
Asparagine
Proline
Glutamine
Arginine
Serine
Threonine
Valine
Tryptophan
Tyrosine
Аланин
Цистеин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Фенилаланин
Глицин
Гистидин
Изолейцин
Лизин
Лейцин
Метионин
Аспарагин
Пролин
Глутамин
Аргинин
Серин
Треонин
Валин
Триптофан
Тирозин

GCA GCC GCG GCU
UGC UGU
GAC GAU
GAA GAG
UUC UUU
GGA GGC GGG GGU
CAC CAU
AUA AUC AUU
AAA AAG
UUA UUG CUA CUC CUG CUU
AUG
AAC AAU
CCA CCC CCC CCU
CAA CAG
AGA AGG CGA CGC CGG CGU
AGC AGU UCA UCC UCG UCU
ACA ACC ACG ACU
GUA GUC GUG GUU
UGG
UAC UAU

Транспортные РНК (тРНК) небольшие по размеру молекулы (73- 97 нуклеотидных остатков в цепи). Все тРНК имеют одинаковый 3′-конец, построенный из двух остатков цитозина и одного аденозина (CCA-конец). В середине цепи тРНК находится антикодон. В молекулах тРНК присутствет множество разнообразных модифицированных нуклеозидов (минорные нуклеозиды), образующиеся путем ферментативной модификации обычных нуклеозидных остатков.

Вторичная структура

Рисунок 6. Вторичная структура тРНК

Вторичная структура тРНК складывается за счет взаимокомплементарности участков цепи. Они формируют структуру «клеверного листа», состоящую из четырех стеблей и трех петель. Стебель с петлей формируют ветвь. В дополнение к трем петлям клеверного листа в структуре тРНК выделяют также дополнительную, или вариабельную, петлю (V петлю). Двухцепочечные стебли с постоянным числом спаренных нуклеотидов представляют собой двойную спираль.

Пространственная структура

Рисунок 7. Третичная структура тРНК

Третичная структура формируется за счет взаимодействия элементов вторичной структуры. Пространственная структура тРНК называется L-формой (из-за сходства с латинской буквой L).
Третичные взаимодействия (стекинг оснований и другие) скрепляют разные участки L-структуры в непрерывные двойные спирали.
Молекулам тРНК присущи индивидуальные различия, проявляющиеся на уровне вторичной и третичной структур, например, разная величина угла между доменами L-структуры.

Функции тРНК

Две основные функции тРНК:

  1. Акцепторная функция – способность ковалентно связываться с аминоацильным остатком, превращаясь в аминоацил-тРНК;
  2. Адапторная функция – способность узнавать триплет генетического кода, соответствующий транспортируемой аминокислоте, и обеспечивать поступление аминокислоты на «законное» место в растущей цепи белка.

Аминоацилирование тРНК

Аминоацилирование тРНКпроцесс активации аминокислот. Он происходит на первом этапе биосинтеза белка – двад­цать различных аминокислот присоеди­няются эфирной связью к соответствую­щим тРНК под действием двадцати различных активирую­щих ферментов, называемыми аминоацил-тРНК-синтетазами. Каждый фермент специфичен по отношению к определенной аминокислоте и к соответствующей тРНК.

Рисунок 8. Обобщенная структура аминоацил-тРНК

Аминоацилирование состоит из двух стадий, проходящих в каталитическом центре фермента. На первой стадии в результате взаимо­действия АТР и аминокислоты образуется промежуточ­ное соединение – аминоациладенилат. На второй стадии аминоацильный оста­ток переносится с аминоациладенилата, связанного с ферментом, на соответ­ствующую специфическую тРНК (Рисунок 8).

Аминоацилирование может быть выражено схемой:

АТФ – аденозинтрифосфат, АМФ – аденозинмонофосфат, PPi – пирофосфаты.
Исключительно низкая частота ошибок при аминоацилировании тРНК является непременным условием реализации генетического кода – если на предрибосомном этапе произошла ошибка и к тРНК присоединилась аминокислота, не соответствующая специфичности антикодона, то эта ошибка уже не может быть исправлена на последующих этапах белкового синтеза.
В ходе эволюции выработались специфические механизмы отбора «правильных» субстратов для аминоацил-тРНК-синтетаз, обеспечивающие безошибочное аминоацилирование тРНК.

Узнавание тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами

Каждая тРНК, сохраняя универсальную L-образную форму, имеет отличительные признаки, безошибочно распознаваемые «своим» ферментом как «притягательные», а остальными 19 ферментами – как «отталкивающие».
Это следующие участки тРНК (Рисунок 9):

  • Антикодон
  • Нуклеотид, предшествующий CCA-концу.
  • Первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля

Рисунок 9. Участки, по которым происходит узнавание тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами

Рисунок 10. Комплекс 80S рибосома-мРНК-тРНК клетки дрожжей

Синтез белка происходит в рибосоме. Рибосома – сложный макромолекулярный аппарат, состоящий из более 50 белков, называемых рибосомными белками, и нескольких молекул РНК, называемых рибосомными РНК. Число рибосом в клетке различно. Оно зависит от интенсивности белкового синтеза в данном типе клеток. Обычная эукариотческая клетка содержит миллионы рибосом. Эукариотические и прокариотические рибосомы схожи в строении и функциях и различаются лишь числом и размером рРНК и рибосомных протеинов.
Строение рибосомы приведено на рисунке 10 на примере рибосомы дрожжей (Рисунок 10).
Рибосомы имеют размер 25-30 нм. Они состоят из двух неравных субъединиц. Субъединицы эукариотических рибосом формируются в ядре из рРНК, ассоциированных с рибосомными белками, которые транспортируются в ядро после синтеза в цитоплазме. Две субъединицы рибосомы затем выходят в цитоплазму, где соединяются воедино для участия в синтезе белка.
Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) – основные компоненты рибосом, составляют большую часть их массы. Молекулы рРНК определяют структуру, физические и химические свойства, функции рибосом, а также расположение рибосомных белков в субчастицах рибосом.
Малые субчастицы рибосом содержат одну молекулу рРНК, большие – две.
Молекулы рРНК являются совокупностью коротких одноцепочечных и двухспиральных участков, образующихся за счет комплементарного спаривания участков одной и той же полинуклеотидной цепи.
В субъединицах рибосом рРНК компактно упакованы благодаря ионам двухвалентных металлов и рибосомным белкам. Основная часть рРНК располагается внутри рибосомных субчастиц. Отдельные участки рРНК находятся на поверхности субчастиц. Они выполняют важную биололическую роль, формируя функциональные центры рибосом (центры связывания матричных и транспортных РНК и белковых факторов трансляции).
Рибосомная РНК концентрируется в основном ближе к центру частиц, тогда как масса рибосомных белков занимает в среднем более периферическое положение. Можно сделать вывод, что свернутая молекула высокополимерной рибосомной РНК – это структурное ядро рибосомной субчастицы, определяющее и ее компактность, и ее форму, и организацию на ней рибосомных белков. То есть рибосома есть прежде всего ее РНК (Рисунок 11).

Рисунок 11. Рибосомные белки и рибосомная РНК

Многочисленные рибосомные белки могут участвовать в функциях связывания субстратов и каталитических функциях рибосомы, локализуясь в соответствующих функциональных центрах и обеспечивая их своими активными группами; рибосомные белки могут служить стабилизаторами или модификаторами определенных локальных структур рибосомной РНК и таким образом поддерживать их в функционально активном состоянии или способствовать их переключениям из одного состояния в другое.
Когда рибосома не участвует в синтезе белков, две субъединицы разделены. Они соединяются с мРНК (обычно возле 5′-конца) для инициации синтеза белков. Затем мРНК продвигается через рибосому, и по мере вхождения кодонов в ядро рибосомы, нуклеотидная последовательность мРНК транслируется в аминокислотную поледовательность с помощью тРНК в качестве адаптора, чтобы приоединять каждую аминокислоту в правильном порядке к концу растущего белка. Когда считывается терминаторный кодон, из рибосомы выходит синтезированный белок, и две субъединицы снова разделяются. Эти субъединицы могут снова быть использованы для синтеза другого белка по другой молекуле мРНК.
Обычно одна молекула мРНК читается сразу несколькими рибосомами, двигающимися вдоль мРНК друг за другом и, таким образом, независимо синтезирующими идентичные молекулы белка, но с соответствующим отставанием. Такой динамический комплекс одной мРНК с несколькими рибосомами называется полирибосомой.

Рисунок 12. Функциональные участки рибосомы

Рибосомы работают чрезвычайно продуктивно: в секунду одна рибосома эукариотической клетки присоединяет 2 аминокислоты к полипептидной цепи, рибосомы бактериальных клеток функционируют еще быстрее — около 20 аминокислот в секунду. Такая продуктивность объясняется наличием четырех функциональных участков (сайтов) для РНК молекул (Рисунок 12) – один для мРНК и три для тРНК:

  • А-сайт (aminoacyl-tRNA — аминоацил-тРНК)
  • Р-сайт (peptidyl-tRNA — пептидил-тРНК)
  • Е-сайт (exit — выход)
  • мРНК-связывающий участок

Молекула тРНК крепится к А- и Р-сайтам только если её антикодон образует пары оснований с комплементарным кодоном молекулы мРНК. А- и Р-сайты расположены близко друг к другу чтобы две их тРНК молекулы формировали пары нуклеотидов с примыкающим кодоном молекулы мРНК. Эта особенность рибосомы обеспечивает правильное считывание мРНК.
Рибосомы разных клеток различаются по размерам, которые опре­деляются по скорости осаждения при центрифу­гировании. Скорость осаждения измеряется в еди­ницах Сведберга (S). Сведберг – это отношение скорости седиментации к центробежному ускорению, 1S = 10-13 секунд. Коэффициенты седимента­ции разных рибосом варьируют от 5S до 80S. У прокариот рибосомы имеют коэффициент 70S, а рибосомы цитоплазмы эукариот — 80S.
Диссоциация рибосом в случае прокариот и эукариот соответственно:
70S→50S + 30S
80S→60S + 40S

Трансляция – непосредственный процесс синтеза белка рибосомой. Трансляция проходит в три стадии: инициация, элонгация, терминация.

Стадия инициации

Трансляция у бактерий и в эукариотических клетках в общем схожи, но различаются механизмом инициации. Для инициация белкового синтеза в бактериях необходимы 30S и 50S рибосомные единицы, мРНК, молекула тРНК, аминоацилированная N-формилметионином – fMet-tRNAfMet, три белка, называемые факторами инициации, гуанозинтрифосфат (ГТФ), Mg2+. В процессе работы рибосома потребляет энергию гидролиза гуанозинтрифосфата (Рисунок 13).

Рисунок 13. Структура гуанозинтрифосфата

Комплекс 30S субъединицы с факторами инициации распознает участки связывания рибосомы (сайты), которые содержат инициаторный кодон AUG, и специальную последовательность Шайна- Дальгарно, служащую для отличия AUG от внутренних кодонов, кодирующих метионин. В результате инициации образуется 70S рибосома – инициирующий комплекс, содержащий мРНК и fMet-tRNAfMet, связанную с P-участком рибосомы. Комплекс готов к элонгации.
В эукариотических клетках имеется как минимум девять факторов инициации. Инициирующий кодон AUG распознается не последовательностью Шайна-Дальгарно, а сканированием мРНК с 5′-конца до первого AUG и соответствующим расположением рамки считывания.

Стадия элонгации

Стадия элонгации требует комплекс инициации, аминоацил-тРНК, факторы элонгации (растворимые цитозольные белки) и гуанозинтрифосфат (ГТФ).
Синтез происходит на рибосоме путем последовательного добавления одного аминокислотного остатка за другим к строящейся полипептидной цепи; таким путем осуществляется элонгация (удлинение) пептида. Каждый новый аминокислотный остаток добавляется к карбоксильному концу (С-концу) пептида, т. е. С-конец пептида является растущим. Добавление одного аминокислотного остатка соответствует прочтению одного нуклеотидного триплета.
Элонгация проходит в три этапа, которые повторяются пока есть остатки аминокислот для присоединения.
На первом шаге аминоацил-тРНК молекула, нагруженная аминокислотой крепится к А-сайту рибосомы, а «отработавшая» тРНК высвобождается с Е-сайта (от exit — выход).
На втором шаге формируется новая пептидная связь под действием фермента пептидилтрансферазы.
На третьем шаге происходит транслокация: большая субъединица занимает позицию относительно малой субъединицы, оставляя две тРНК в гибридных сайтах: в Р-сайте на большой субъединице и А-сайте на малой для одной тРНК и в E-сайте на большой субъединице и Р-сайте на малой для другой. Затем малая субъединица перемещается вместе с мРНК на три нуклеотида, освобождая А-сайт для следующей тРНК и цикл повторяется снова. Молекула мРНК транслируется с 5′-конца к 3′-третьему, а синтез протеина начинается с N-конца. С началом каждого цикла аминокислота крепится к C-концу полипептидной цепи.

Стадия терминации

Элонгация продолжается до тех пор пока рибосома не присоединит последнюю аминокислоту. Терминация начинается при присутствии одного из трех терминаторных кодонов в мРНК (UAA, UAG, UGA), которые следуют сразу за последней аминокислотой. Когда рибосома достигнет терминирующего кодона мРНК, синтез полипептида прекращается. В бактериях, если терминаторный кодон имеет место быть в А-сайте рибосомы, в дело вступают три фактора терминации, которые участвуют в гидролизе пептидил-тРНК связи; освобождении полипептида и последней, уже ненагруженной тРНК из Р-сайта; диссоциации 70S рибосомы на 30S и 50S субъединицы, готовых начать новый цикл синтеза белка.
Таким образом, каждая рибосома проходит полный цикл трансляции, включающий инициацию, элонгацию и терминацию; в результате такого эпицикла прочитывается вся кодирующая последовательность мРНК и синтези­руется законченная полипептидная цепь белка. После этого рибосома может повторить цикл с другой цепью мРНК или другой кодирующей последовательностью той же цепи.

Процесс экспрессии генов не заканчивается на построении аминокислотной последовательности, составляющей протеин, с помощью генетического кода. Чтобы быть полезным клетке, новый пептид должен подвергнутся процессингу: свернутся в трехмерную нативную конформацию, присоединить какие-либо молекулы, необходимые для его активности, модифицироваться под действием протеинкиназ и других энзимов и правильно соединиться с другими частями белка, с которыми он функционирует.
Информация, нужная для всех этих процессов содержится в последовательности связанных аминокислот, которые производит рибосома, когда транслирует мРНК в полипептидную цепь. Когда протеин сворачивается в компактную структуру, гидрофобные звенья обращаются внутрь глобулы. Формируется большая часть нековалентных взаимодействий между различными участками молекул. Итогом всех этих энергетически выгодных взаимодействий, определяющих свернутую структуру полипептидной цепи является конформация с самой низкой энергией.
За миллионы лет эволюции аминокислотная последовательность каждого протеина была выбрана определенным образом не только для конформации, которую он принимает, но также для быстрого сворачивания. Для некоторых белков сворачивание начинается с N-конца сразу после выхода полипептида из рибосомы. В этом случае, как только протеин покидает рибосому, через несколько секунд он формирует компактное строение, содержащее окончательную вторичную структуру (спирали и β-листы).
Большинство белков не сворачиваются во время синтеза. Вместо этого они «встречаются» у рибосомы с отдельным классом белков, называемых шаперонами. Связывание с шаперонами обеспечивает правильное сворачивание белка в нативную конформацию.
Основные этапы процессинга:

  • Модификация N-конца и С-конца
  • Удаление сигнальных последовательностей
  • Фосфорилирование гидраксиаминокислот
  • Реакции карбоксилирования
  • Метилирование групп
  • Присоединение боковых углеводных цепей
  • Добавление простетических групп
  • Образование дисульфидных мостиков

Внутриклеточная сортировка белков

Эукариотические клетки состоят из множества структур, органелл и отсеков со специфичными функциями, которые требуют определенный набор белков. Эти белки (за исключением тех, которые синтезируются в митохондрих и пластидах) производятся рибосомами в цитозоле.
Белки предназначенные для секреции, интеграции в плазматическую мембрану, включения в лизосомы, обычно проходят первые несколько стадий внутриклеточной сортировки. Белки для митохондрий, пластид и ядра используют при отдельных механизм. Белки, предназначенные для цитозоля, остаются там, где были синтезированы.
Важнейшим элементом в процессе сортировки белков является короткая последовательность аминокислот – сигнальная последовательность белка (лидер). Она направляет белок на предназначенное ему место и удаляется во время транспорта или по прибытию белка в конечный пункт.
В процессе синтеза любого белка, в том числе предназначенного на «экспорт», сигнальные лидеры, будучи расположены на N-конце, образуются первыми. Такие лидеры узнаются особыми рецепторными участками на внешней поверхности эндоплазматического ретикулума, при­чем это происходит даже раньше, чем рибосома полностью завершит синтез бел­ка. Гидрофобная жирорастворимая часть лидирующей последовательности проникает сквозь мембрану внутрь цистерн эндоплазматического ретикулума, прота­скивая за собой растущую полипептидную цепь. Внутри цистерн под действием особой пептидазы сигнальный лидер от­щепляется. После этого зрелый белок на­правляется в аппарат Гольджи, инкапсу­лируется и в виде секреторного пузырька покидает наконец клетку.

Белки являются структурными блоками клетки, а также осуществляют большую часть её функций. Биосинтез белка является одним из основополагающих процессов клетки.
Расшифровка генетического кода, правил, по которым нуклеотидная последовательность РНК переводится в аминокислотную последовательность полипептида, позволила понять принцип биосинтеза белка и связанные с этих явления.
Синтез протеина начинается с построения цепи матричной РНК из ДНК по принципу комплементарности.
После определенных преобразований молекула матричной РНК становится матрицей для построения по ней белка.
Биосинтез белка происходит в рибосомах, которые состоят из белков и рРНК. Рибосомы диссоциируют на две неравные субъединицы.

  • Прокароты: 70S→50S + 30S
  • Эукариоты: 80S→60S + 40S

Транспортная РНК состоит из небольшого числа нуклеотидов (73-97), некоторые из которых могут быть модифицированы. тРНК имеют общее строение:

  • универсальная CCA последовательность
  • акцепторный стебель
  • D шпилька
  • T шпилька
  • Антикодоновая шпилька

Транспортные РНК выполняют акцепторную и адапторную функции.
Рост полипептида в рибосоме начинается с N-конца добавлением новых аминокислотных остатков и завершается на C-конце.
Для синтез белка необходима активация аминокислот. Аминокислоты активируются в цитозоле аминоацил-тРНК синтетазой. Эти ферменты катализируют образование аминоацил-тРНК и расщепление АТФ на АМФ и пирофосфаты (PPi). Точность белкового синтеза зависит от правильного протекания этой реакции.
Непосредственный синтез белка (трансляция) проходит в три стадии.

  • Инициация белкового синтеза включает в себя образование комплекса из малой рибосомной субъединицы, мРНК, ГТФ, fMet-tRNAfMet, факторов инициации и большой рибосомной субъединицы. ГТФ гидролизуется с образованием ГМФ и фосфата.
  • На стадии элонгации ГТФ и факторы элонгации учавствуют в процессе связывания аминоацил-тРНК, нагруженной аминокислотой, с А-участком рибосомы. Под действием фермента пептидилтрансферазы образуется пептидная связь. Движение рибосомы вдоль мРНК транслоцирует тРНК из А-сайта в Р-сайт за счет энергии гидролиза ГТФ. «Отработавшая» тРНК высвобождается из Е-участка.
  • После повторения нескольких циклов элонгации, на стадии терминации, синтез полипептида останавливается факторами терминации.

Полипептид сворачивается в биологически активную конформацию и транспортируется к «рабочему месту».
Несмотря на множество открытий в биохимии и значимую работу, проделанную разными учеными в области этой науки, некоторые аспекты синтеза белков еще не установлены. Например, зачем нужны молекулы рРНК и как случилось, что они приобрели главенствующую роль в структуре и функции рибосом? На этот и другие вопросы науке предстоит ответить.

  1. Дроздов, А.Л. Биология для физиков и химиков / А.Л. Дроздов. — Владивосток: Изд-во Дальневосточного. ун-та, 2005. — 414 с.
  2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ.-М.: Мир, 1985.-329с.,ил.
  3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ.: —М.: Мир, 1993. — 415 с., ил.
  4. Ратнер В. А.Генетический код как система — Соросовский образовательный журнал, 2000, 6, № 3, с.17-22.
  5. Спирин А. С.Принципы структуры рибосом — Соросовский образовательный журнал, 1998, 4, № 11, с.65-70.
  6. Спирин А.С. Молекулярная биология : рибосомы и биосинтез белка : учебник для студ. высш. проф. образования / А. С. Спирин. — М. : Издательский центр «Академия», 2011. — 496 с., [16] с. цв. ил.
  7. Фаворова О. О. Строение транспортных РНК и их функция на первом (предрибосомном) этапе биосинтеза белков — Соросовский образовательный журнал, 1998, 4, № 11, с.71-77.
  8. Химическая энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия. Под ред. И. Л. Кнунянца. 1988.
  9. Alberts, B., Wilson, J. and Hunt, T. (2008). Molecular biology of the cell. New York: Garland Science.
  10. Itoh, Y., Chiba, S., Sekine, S. and Yokoyama, S. (2009). Crystal structure of human selenocysteine tRNA.Nucleic Acids Research, 37(18), pp.6259-6268.
  11. Itoh, Y., Sekine, S., Suetsugu, S. and Yokoyama, S. (2013). Tertiary structure of bacterial selenocysteine tRNA. Nucleic Acids Research, 41(13), pp.6729-6738.
  12. Lehninger, A., Nelson, D. and Cox, M. (2000). Lehninger principles of biochemistry. New York: Worth Publishers.
  13. Marshall W. Nirenberg — Nobel Lecture: The Genetic Code. Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 29 Mar 2015. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1968/nirenberg-lecture.html
  14. Svidritskiy, E., Brilot, A., Koh, C., Grigorieff, N. and Korostelev, A. (2014). Structures of Yeast 80S Ribosome-tRNA Complexes in the Rotated and Nonrotated Conformations. Structure, 22(8), pp.1210-1218.

Структуры молекул взяты из RCSB Protein Data Bank и ChemSpider

Извините, ничего не найдено.

2. Общая схема биосинтеза белка.

Во всех живых клетках белки синтезируются рибосомами. Рибосома представляет собой крупную макромолекулу со сложной асимметричной четвертичной структурой, построенной из рибонуклеиновых кислот (рибосомных РНК) и белков. Для того чтобы синтезировать белок, рибосома должна быть снабжена:

1. Программой, задающей порядок чередования аминокислотных остатков в • полипептидной цепи белка.

2. Аминокислотным материалом, из которого надлежит строить белок.

3. Энергией.

Сама рибосома обладает каталитической (энзиматической) функцией, ответственной за образование пептидных связей и, соответственно, полимеризацию аминокислотных остатков в полипептидную цепь белка.

Программа, задающая порядок чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи белка, исходит от дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), т. е. Из генома клетки. Отдельные участки двутяжевой ДНК, называемые генами, являются матрицами для синтеза на них однотяжевых цепей РНК. Синтезированные цепи РНК комплиментарны одной из цепей ДНК и, таким образом, точно воспроизводят дезоксирибонуклеотидную последовательность другой цепи ДНК в своей рибонуклеотидной последовательности. Процесс такого копирования гена, осуществляемый ферментом РНК-полимеразой, получил название транскрипции. РНК в течение синтеза и после него, особенно в эукариотических клетках, может подвергаться ряду дополнительных изменений, называемых процессингом, в ходе которых из нее могут быть вырезаны определенные куски нуклеотидной последовательности. Получающаяся РНК поступает далее в рибосомы в качестве программы, определяющую аминокислотную последовательность в синтезируемом белке. Она называется информационной или «мессенджер» РНК (мРНК). Таким образом, именно транскрипция генов и образование мРНК обеспечивают поток информации от ДНК к рибосомам.

Исходным материалом, из которого строится белок, являются аминокислоты. Однако свободные аминокислоты не используются рибосомой, Для того чтобы служить субстратом для рибосомы, аминокислота должна быть активирована с участием сопряженного расщепления АТФ и акцептирована (ковалентно присоединена) специальной молекулой РНК, называемой трансфернои или транспортной РНК (тРНК), с помощью фермента аминоацил-тРНК-синтетезы. Получающиеся аминоацил-тРНК поступают в рибосому в качестве субстрата для синтеза белка. Кроме того, энергия химической связи между аминокислотным остатком и тРНК используется для реакции образования пептидной связи в рибосоме. Таким образом, активация аминокислот и образование аминоацил-тРНК обеспечивают поток, как материала, так и энергии для рибосомного синтеза белка.

Эти три потока (информации, материала и энергии) встречаются в рибосоме. Воспринимая их, рибосома осуществляет перевод, или трансляцию, генетической информации с языка нуклеотидной последовательности мРНК на язык аминокислотной последовательности синтезируемой полипептидной цепи белка. Если представить это в молекулярных терминах, то рибосома последовательно сканирует цепь мРНК (движется вдоль нее) и тоже последовательно выбирает из среды аминоацил-тРНК, в результате чего специфичность аминоацильного остатка выбираемой рибосомой аминоацил-тРНК каждый раз детерминируется специфичностью комбинации нуклеотидов считываемого в данный момент рибосомой отрезка мРНК. Таким образом, возникает проблема генетического кода: какие комбинации нуклеотидов детерминируют, т. е. Кодируют каждую из 20 аминокислот, из которых строятся молекулы белков?

Движение рибосомы вдоль цепи мРНК (или, другими словами, Пропускание цепи мРНК сквозь рибосому) задает строгий временной порядок вхождения в рибосому разных аминоацил-тРНК в соответствии с порядком расположения кодирующих нуклеотидных комбинаций вдоль мРНК. Аминоацильный остаток выбранной аминоацил-тРНК каждый раз ковалентно присоединяется рибосомой к растущей полипептидной цепи. Деацилированная тРНК освобождается из рибосомы в раствор. Так последовательно, шаг за шагом, строится полипептидная цепь белка (см. схему 1).

— трансляция — Биохимия

Трансляция (синтез белка)

Трансляция (англ. translation – перевод) – это биосинтез белка на матрице мРНК.

После переноса информации с ДНК на матричную РНК начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо транскрибировать мРНК с иных участков ДНК.

Биосинтез белков или трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и включает 5 ключевых элементов:

  • матрица – матричная РНК,
  • растущая цепь – полипептид,
  • субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот,
  • источник энергии – ГТФ,
  • рибосомальные белки, рРНК и белковые факторы.

Выделяют три основных стадии трансляции: инициация, элонгация, терминация.

Инициация

Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ-1, ИФ-2, ИФ-3), метионин и тРНК для метионина.

В начале этой стадии формируются два тройных комплекса: 

  • первый комплекс – мРНК + малая субъединица + ИФ-3,
  • второй комплекс – метионил-тРНК + ИФ-2 + ГТФ.

После формирования тройные комплексы объединяются с большой субъединицей рибосомы. В этом процессе активно участвуют белковые факторы инициации, источником энергии служит ГТФ. После сборки комплекса инициирующая метионил-тРНК связывается с первым кодоном АУГ матричной РНК и располагается в П-центре (пептидильный центр) большой субъединицы. А-центр (аминоацильный центр) остается свободным, он будет задействован на стадии элонгации для связывания аминоацил-тРНК.

События стадии инициации

После присоединения большой субъединицы начинается стадия элонгации.

Элонгация

Для этой стадии необходимы все 20 аминокислот, тРНК для всех аминокислот, белковые факторы элонгации, ГТФ. Удлинение цепи происходит со скоростью примерно 20 аминокислот в секунду.

Элонгация представляет собой циклический процесс. Первый цикл (и следующие циклы) элонгации включает три шага:

  1. Присоединение аминоацил-тРНК (еще  второй)  к кодону мРНК (еще второму),  аминокислота при этом встраивается в А-центр рибосомы. Источником энергии служит ГТФ.
  2. Фермент пептидилтрансфераза осуществляет перенос метионина с метионил-тРНК (в П-центре) на вторую аминоацил-тРНК (в А-центре) с образованием пептидной связи между метионином и второй аминокислотой. При этом уже активированная СООН-группа метионина связывается со свободной NH2-группой второй аминокислоты. Здесь источником энергии служит макроэргическая связь между аминокислотой и тРНК.
  1. Фермент транслоказа перемещает мРНК относительно рибосомы таким образом, что первый кодон АУГ оказывается вне рибосомы, второй кодон (на рисунке ) становится напротив П-центра, напротив А-центра оказывается третий кодон (на рисунке ). Для этих процессов необходима затрата энергии ГТФ. Так как вместе с мРНК перемещаются закрепленные на ней тРНК, то инициирующая первая тРНК выходит из рибосомы, вторая тРНК с дипептидом помещается в П-центр.
Последовательность событий стадии элонгации

Второе повторение цикла – начинается с присоединения третьей аминоацил-тРНК к третьему кодону мРНК, аминокислота-3 становится в А-центр. Далее трансферазная реакции повторяется и образуется трипептид, занимающий А-центр, после чего он смещается в П-центр в транслоказной реакции..

В пустой А-центр входит четвертая аминоацил-тРНК и начинается третий цикл элонгации:

Образование пептидной связи при встраивании четвертой аминокислоты в пептид.

Субъединицы рибосомы, большая часть транспортных РНК и матричная РНК не показаны.

Цикл элонгации (реакции 1,2,3) повторяется столько раз, сколько аминокислот необходимо включить в полипептидную цепь.

Терминация

Синтез белка продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ, УГА. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. При вхождении этих кодонов внутрь рибосомы происходит активация белковых факторов терминации, которые последовательно катализируют:

  1. Гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК.
  2. Отделение от П-центра последней, уже пустой, тРНК.
  3. Диссоциацию рибосомы.

Источником энергии для завершения трансляции является ГТФ.

Реакции стадии терминации

Полирибосомы

По причине того, что продолжительность жизни матричной РНК невелика, перед клеткой стоит задача использовать ее максимально эффективно, т.е. получить максимальное количество «белковых копий». Для достижения этой цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются полирибосомы.

Место синтеза белка в клетке создающий ток жидкости



Биосинтез белка в клетке кратко и понятно

Как объяснить, кратко и понятно, что такое биосинтез белка, и какого его значение?

Если вам интересна эта тема, и вы хотели бы подтянуть школьные знания или же повторить пропуски, то эта статья создана для вас.

  1. Что такое биосинтез белка
  2. Транскрипция и трансляция
  3. Схема биосинтеза белка
  4. Последовательность процессоров биосинтеза белка
  5. Какие компоненты клетки участвуют в биосинтезе белка
  6. Каковы особенности реакций биосинтеза белка в клетке
  7. Признаки биосинтеза белка в клетке
  8. Заключение

Что такое биосинтез белка

Сначала стоит ознакомиться с определением биосинтеза. Биосинтезом называется синтез живыми организмами природных органических соединений.

Если быть проще, то это получение различных веществ с помощью микроорганизмов. Этот процесс занимает важную роль во всех живых клетках. Не забываем и о сложном биохимическом составе.

Транскрипция и трансляция

Это два наиглавнейших шага биосинтеза.

Транскрипция с латинского означает «переписывание» – в качестве матрицы применяется ДНК, поэтому происходит синтезирование трёх видов РНК (матричной/информационной, транспортной, рибосомной рибонуклеиновых кислот). Реакция осуществляется с помощью полимеразы (РНК) и с использованием большого количества аденозинтрифосфата.

Выделают два основных действия:

  1. Обозначение конца и начала трансляции присоединением иРНК.
  2. Событие, осуществляемое благодаря сплайсингу, который в свою очередь удаляет неинформационные последовательности РНК, тем самым происходит уменьшение массы матричной рибонуклеиновой кислоты в 10 раз.

Трансляция с латинского означает «перевод» – используется иРНК в качестве матрицы, синтезируются полипептидные цепочки.

Трансляция включает в себя три этапа, которые можно было представить в виде таблицы:

  1. Первый этап. Инициация формирование комплекса, который участвует в синтезе полипептидной цепочки.
  2. Второй этап. Элонгация увеличение размеров этой цепи.
  3. Третий этап. Терминация заключение выше упомянутого процесса.

Схема биосинтеза белка

По схеме видно, как протекает процесс.

Точкой стыковки этой схемы являются рибосомы, в которых синтезируется белок. В простой форме синтез осуществляется по схеме

ДНК &gt, PHK &gt, белок.

Первым начинается этап транскрипции, в котором молекула изменяется в одноцепочную информационную рибонуклеиновую кислоту (иРНК). В ней содержится информация аминокислотной последовательности белка.

Следующей остановкой иРНК будет рибосома, в которой происходит сам синтез. Происходит это путём трансляции, формирования полипептидной цепочки. После этой заурядной схемы, полученный белок транспортируется в разные места, выполняя определённые задачи.

Последовательность процессоров биосинтеза белка

Биосинтез белка – сложный механизм, который включает в себя два выше упомянутых этапа, а именно транскрипцию и трансляцию. Первым происходит транскрибируемый этап (он разделяется на два события).

После идёт трансляция, в которой участвуют все виды РНК, у каждой есть своя функция:

  1. Информационная – роль матрицы.
  2. Транспортная – добавление аминокислот, определение кодонов.
  3. Рибосомная – образование рибосом, которые поддерживают иРНК.
  4. Транспортная – синтез полипептидной цепи.

Какие компоненты клетки участвуют в биосинтезе белка

Как мы уже говорили, биосинтез разделяют на две стадии. В каждой стадии участвуют свои компоненты. На первой стадии это дезоксирибонуклеиновая кислота, информационная и транспортная РНК, нуклеотиды.

Во второй же стадии участвуют компоненты: иРНК, тРНК, рибосомы, нуклеотиды и пептиды.

Каковы особенности реакций биосинтеза белка в клетке

В список особенностей реакций биосинтеза стоит отнести:

  1. Использование энергии АТФ для химических реакций.
  2. Присутствуют ферменты, задача которых ускорять реакции.
  3. Реакция имеет матричный характер, так как белок синтезируется на иРНК.

Признаки биосинтеза белка в клетке

Для такого сложного процесса, конечно же, характерны различные признаки:

  1. Первый из них заключается в том, что присутствуют ферменты, без которых сам процесс был бы невозможен
  2. Задействованы все три вида РНК, из этого можно сделать вывод, что центральная роль принадлежит РНК.
  3. Образование молекул производится мономерами, а именно аминокислотами.
  4. Стоит обозначить так же, что специфичность того или иного белка ориентируется расположением аминокислот.

Заключение

Многоклеточный организм аппарат, состоящий из разных клеточных типов, которые дифференцированы – отличаются структурой и функциями. Кроме белков, присутствуют клетки этих типов, которые синтезируют так же себе подобных, в этом заключается различие.

Источник

Биосинтез белка — понятие, последовательность процессов и основные этапы

Биосинтез белка – важная часть пластического обмена всех клеток. Рассматривает данный процесс наука биология. В результате образуются специфичные вещества, характерные для данного организма. Происходит воспроизведение наследственной информации.

Последовательность процессов биосинтеза белка

Образование белка является многоступенчатым процессом.

Чтобы запустить реакции образования вещества, осуществляется целый ряд последовательных событий:

Транскрипция — это реакции переписывания наследственной информации с макромолекулы ДНК на матричную РНК. Ее называют также информационной. Краткое обозначение: м-РНК, и-РНК. Процесс протекает в ядре клетки.

Перемещение и-РНК к месту синтеза белка.

Трансляция — это перенос информации о чередовании нуклеотидов м-РНК на макромолекулу белка. Процесс идёт вне ядра.

Где происходит синтез белка

Образование высокомолекулярного соединения протекает в цитоплазме. Именно здесь находятся органоиды, на которых осуществляется данный процесс. Рибосома представляет собой две части: малую и большую. Чтобы биосинтез белка начался, необходимо доставить информацию из ядра в цитоплазму.

Ядро эукариот хранит информацию о первичной структуре природных полимеров. Её называют наследственной. Эта важная информация должна быть без искажения перенесена к месту синтеза белка.

С этой целью в ядре идут матричные реакции. На одной из цепей ДНК синтезируется и-РНК. Именно она является посредником между двумя частями клетки.

Этапы биосинтеза белка

Транскрипция

Процесс протекает в ядре. ДНК образована большим количеством нуклеотидов. Это единица макромолекулы. Она включает в свой состав 3 компонента:

углевод, представленный пентозой – дезоксирибозой;

минеральную кислоту – фосфорную;

органическое соединение, относящееся к классу азотистых оснований.

В составе ДНК могут содержаться 4 разных основания. Они имеют краткое обозначение, по первой букве названия:

Именно этими основаниями и отличаются нуклеотиды. Чередование 3 нуклеотидов образует триплет. Один триплет соответствует одной аминокислоте. Вопрос соответствия аминокислот триплетам изучен и указан в таблице генетического кода.

Последовательность триплетов в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты, отвечающей за синтез одного белка, называют геном. Между разными генами расположены триплеты, которые не соответствуют аминокислотам. Их называют стоп-кодонами. Они служат сигналом начала и окончания гена.

Для осуществления транскрипции, участок макромолекулы ДНК раскручивается. Он выполняет роль матрицы. На нём выстраивается и-РНК. Осуществляется синтез по принципу соответствия. Еще его называют комплементарностью.

РНК также имеет нуклеотидное строение. Вместо дезоксирибозы присутствует углевод рибоза. Содержится остаток ортофосфорной кислоты. Третьим компонентом является азотистое основание. Три основания одинаковые – А, Г, Ц в ДНК и РНК. Четвертое основание рибонуклеиновой кислоты – урацил (У).

Комплементарными основаниями являются: Т – А, А – У, Г – Ц, Ц – Г. В парах комплементарных оснований первое соответствует ДНК, второе – РНК. Таким образом, на макромолекуле ДНК по принципу соответствия выстраивается и-РНК. В дальнейшем цепь РНК транспортируется через ядерную мембрану к месту синтеза белка.

Трансляция

Процесс идет на органоидах – рибосомах. Они нанизываются на цепь и-РНК, передвигаются по ней не плавно, а прерывисто. Располагаются таким образом, что внутри рибосомы находится полностью 1-2 триплета. На одну РНК может одновременно нанизываться большое количество рибосом.

В процессе принимают участие т-РНК. Они имеют пространственную структуру, принимают форму трилистника. Верхняя часть листа, то есть молекулы, содержит антикодон. Это триплет, распознающий кодон (один триплет) и-РНК.

Каждая т-РНК транспортирует к рибосоме строго определенную аминокислоту. Если триплет-антикодон т-РНК распознает триплет-кодон и-РНК, тогда аминокислота встраивается в макромолекулу белка. Следующая т-РНК подтаскивает другую аминокислоту, снова идет процесс распознавания. В данном случае также идет матричный процесс сборки белка. РНК служит матрицей для синтеза белка.

Как только белковая молекула синтезирована, она освобождается от рибосомы. Правильное чередование аминокислот в макромолекуле образует первичную структуру белковой молекулы. Она является определяющей, поэтому так важен матричный синтез белков. Другие структуры белковые макромолекулы приобретают самопроизвольно.

Схема биосинтеза белка

Процессы, ведущие к синтезу белка, можно кратко изобразить на схеме:

Первый этап – реакции, идущие в кариоплазме. Раскручивание ДНК. Транскрипция. Образование м-РНК.

Второй этап – транспорт м-РНК к рибосомам.

Третий этап – реакции, идущие в цитоплазме. Трансляция. Биосинтез белковой молекулы, протекающий при участии РНК, клеточных органоидов – рибосом.

Заключение

В реакциях матричного синтеза происходит реализация наследственной информации. В каждом организме синтезируются специфичные белковые молекулы. Они вместе с углеводами и жирами накапливаются в плодах растений. В организмах животных выполняют множество разнообразных функций.

Источник

Где происходит синтез белка? Суть процесса и место синтеза белков в клетке

Процесс белкового биосинтеза чрезвычайно важен для клетки. Поскольку белки являются сложными веществами, которые играют основную роль в тканях, они незаменимы. По этой причине в клетке реализована целая цепь процессов белкового биосинтеза, которая протекает в нескольких органеллах. Это гарантирует клетке воспроизведение и возможность существования.

Сущность процесса биосинтеза белка

Единственное место синтеза белков — это шероховатая эндоплазматическая сеть. Здесь располагается основная масса рибосом, которые ответственны за образование полипептидной цепочки. Однако до того как начнется этап трансляции (процесс синтеза белка), требуется активация гена, в котором хранится информация о белковой структуре. После этого требуется копирование данного участка ДНК (или РНК, если рассматривается бактериальный биосинтез).

После копирования ДНК требуется процесс создания информационной РНК. На ее основании будет выполняться синтез белковой цепочки. Причем все этапы, которые протекают с вовлечением нуклеиновых кислот, должны происходить в ядре клетки. Однако это не место, где происходит синтез белка. Это локация, где осуществляется подготовка к биосинтезу.

Рибосомальный биосинтез белка

Основное место, где происходит синтез белка, — это рибосома, клеточная органелла, состоящая из двух субъединиц. Таких структур в клетке огромное количество, и они в основном расположены на мембранах шероховатой эндоплазматической сети. Сам биосинтез происходит так: образованная в ядре клетки информационная РНК выходит сквозь нуклеарные поры в цитоплазму и встречается с рибосомой. Затем иРНК проталкивается в промежуток между субъединицами рибосомы, после чего происходит фиксация первой аминокислоты.

К месту, где происходит синтез белка, аминокислоты подаются при помощи транспортной РНК. Одна такая молекула может однократно приносить по одной аминокислоте. Они присоединяются по очереди в зависимости от последовательности кодонов информационной РНК. Также синтез может прекращаться на некоторое время.

При продвижении по иРНК рибосома может попадать на участки (интроны), которые не кодируют аминокислоты. В этих местах рибосома просто продвигается по иРНК, но присоединения аминокислот к цепочке не происходит. Как только рибосома достигает экзона, то есть участка, который кодирует кислоту, тогда она снова присоединяется к полипептиду.

Постсинтетическая модификация белков

После достижения рибосомой стоп-кодона информационной РНК процесс непосредственного синтеза завершается. Однако полученная молекула имеет первичную структуру и пока не может выполнять зарезервированных для нее функций. Для того чтобы полноценно функционировать, молекула должна организоваться в определенную структуру: вторичную, третичную или еще более сложную — четвертичную.

Структурная организация белка

Вторичная структура — первая стадия структурной организации. Для ее достижения первичная полипептидная цепочка должна спирализоваться (образовать альфа-спирали) или загибаться (создать бета-слои). Затем, для того чтобы занимать еще меньше места по длине, молекула еще больше стягивается и сматывается в клубок за счет водородных, ковалентных и ионных связей, а также межатомных взаимодействий. Таким образом, получается глобулярная структура белка.

Четвертичная белковая структура

Четвертичная структура самая сложная из всех. Она состоит из нескольких участков с глобулярным строением, соединенных фибриллярными нитями полипептида. Вдобавок третичная и четвертичная структура могут содержать углеводный или липидный остаток, что расширяет спектр функций белка. В частности, гликопротеиды, комплексные соединения белка и углевода, являются иммуноглобулинами и выполняют защитную функцию. Также гликопротеиды располагаются на мембранах клеток и работают рецепторами. Однако модифицируется молекула не там, где происходит синтез белка, а в гладкой эндоплазматической сети. Здесь существует возможность присоединения липидов, металлов и углеводов к доменам белков.

Источник

Что такое биосинтез белка в клетке

В статье мы дадим опре­де­ле­ние био­син­те­зу и рас­смот­рим ос­нов­ные этапы син­те­за белков. Разберёмся, чем трансляция отличается от транскрипции.

В клетках непрерывно идут процессы обмена веществ — процессы синтеза и распада веществ. Каж­дая клет­ка син­те­зи­ру­ет необ­хо­ди­мые ей ве­ще­ства. Этот про­цесс на­зы­ва­ет­ся био­син­те­зом.

Био­син­тез — это про­цесс со­зда­ния слож­ных ор­га­ни­че­ских ве­ществ в ходе био­хи­ми­че­ских ре­ак­ций, про­те­ка­ю­щих с по­мо­щью фер­мен­тов. Биосинтез необходим для выживания — без него клетка умрёт.

Одним из важнейших процессов биосинтеза в клетке является процесс биосинтеза белков, который включает в себя особые реакции, встречающиеся только в живой клетке — это реакции матричного синтеза. Матричный синтез — это синтез новых молекул в соответствии с планом, заложенным в других уже существующих молекулах.

Синтез белка в клетке протекает при участии специальных органелл — рибосом. Это немембранные органеллы, состоящие из рРНК и рибосомальных белков.

Последовательность аминокислот в каждом белке определяется последовательностью нуклеотидов в гене — участке ДНК, кодирующем именно этот белок. Соответствие между последовательностью аминокислот в белке и последовательностью нуклеотидов в кодирующих его ДНК и иРНК определяется универсальным правилом — генетическим кодом.

Информация о белке может быть записана в нуклеиновой кислоте только одним способом — в виде последовательности нуклеотидов. ДНК построена из 4 видов нуклеотидов: аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г), цитозина (Ц), а белки — из 20 видов аминокислот. Таким образом, возникает проблема перевода четырёхбуквенной записи информации в ДНК в двадцатибуквенную запись белков. Генетический код — соотношения нуклеотидных последовательностей и аминокислот, на основе которых осуществляется такой перевод.

Процесс синтеза белка в клетке можно разделить на два этапа: транскрипция и трансляция.

Транскрипция — первый этап биосинтеза белка

Транскрипция — это процесс синтеза молекулы иРНК на участке молекулы ДНК.

Транскрипция (с лат. transcription — переписывание) происходит в ядре клетки с участием ферментов, основную работу из которых осуществляет транскриптаза. В этом процессе матрицей является молекула ДНК.

Спе­ци­аль­ный фер­мент на­хо­дит ген и рас­кру­чи­ва­ет уча­сток двой­ной спи­ра­ли ДНК. Фер­мент пе­ре­ме­ща­ет­ся вдоль цепи ДНК и стро­ит цепь ин­фор­ма­ци­он­ной РНК в со­от­вет­ствии с прин­ци­пом ком­пле­мен­тар­но­сти. По мере дви­же­ния фер­мен­та рас­ту­щая цепь РНК мат­ри­цы от­хо­дит от мо­ле­ку­лы, а двой­ная цепь ДНК вос­ста­нав­ли­ва­ет­ся. Когда фер­мент до­сти­га­ет конца ко­пи­ро­ва­ния участ­ка, то есть до­хо­дит до участ­ка, на­зы­ва­е­мо­го стоп-ко­до­ном, мо­ле­ку­ла РНК от­де­ля­ет­ся от мат­ри­цы, то есть от мо­ле­ку­лы ДНК. Таким об­ра­зом, тран­скрип­ция — это пер­вый этап био­син­те­за белка. На этом этапе про­ис­хо­дит счи­ты­ва­ние ин­фор­ма­ции путём син­те­за ин­фор­ма­ци­он­ной РНК.

Копировать информацию, хотя она уже содержится в молекуле ДНК, необходимо по следующим причинам: синтез белка происходит в цитоплазме, а молекула ДНК слишком большая и не может пройти через ядерные поры в цитоплазму. А маленькая копия её участка — иРНК — может транспортироваться в цитоплазму.

После транскрипции громоздкая молекула ДНК остаётся в ядре, а молекула иРНК подвергается «созреванию» — происходит процессинг иРНК. На её 5’ конец подвешивается КЭП для защиты этого конца иРНК от РНКаз — ферментов, разрушающих молекулы РНК. На 3’ конце достраивается поли(А)-хвост, который также служит для защиты молекулы. После этого проходит сплайсинг — вырезание интронов (некодирующих участков) и сшивание экзонов (информационных участков). После процессинга подготовленная молекула транспортируется из ядра в цитоплазму через ядерные поры.

Транскрипция пошагово:

  1. РНК полимераза садится на 3’ конец транскрибируемой цепи ДНК.
  2. Начинается элонгация — полимераза «скользит» по ДНК в сторону 5’ конца и строит цепь иРНК, комплементарную ДНК.
  3. Полимераза доходит до конца гена, «слетает» с ДНК и отпускает иРНК.
  4. После этого происходит процесс созревания РНК — процессинг.
Проверьте себя: помните ли вы принцип комплементарности? Молекула ДНК состоит из двух спирально закрученных цепей. Цепи в молекуле ДНК противоположно направлены. Остов цепей ДНК образован сахарофосфатными остатками, а азотистые основания одной цепи располагаются в строго определённом порядке напротив азотистых оснований другой — это и есть правило комплементарности.

Трансляция — второй этап биосинтеза белка

Трансляция — это перевод информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот.

Что же происходит в клетке? Трансляция представляет собой непосредственно процесс построения белковой молекулы из аминокислот. Трансляция происходит в цитоплазме клетки. В трансляции участвуют рибосомы, ферменты и три вида РНК: иРНК, тРНК и рРНК. Глав­ным по­став­щи­ком энер­гии при трансляции слу­жит мо­ле­ку­ла АТФ — аде­но­з­ин­три­фос­фор­ная кис­ло­та.

Во время транс­ля­ции нук­лео­тид­ные по­сле­до­ва­тель­но­сти ин­фор­ма­ци­он­ной РНК пе­ре­во­дят­ся в по­сле­до­ва­тель­ность ами­но­кис­лот в мо­ле­ку­ле по­ли­пеп­тид­ной цепи. Этот про­цесс идёт в ци­то­плаз­ме на ри­бо­со­мах. Об­ра­зо­вав­ши­е­ся ин­фор­ма­ци­он­ные РНК вы­хо­дят из ядра через поры и от­прав­ля­ют­ся к ри­бо­со­мам. Ри­бо­со­мы — уни­каль­ный сбо­роч­ный ап­па­рат. Ри­бо­со­ма сколь­зит по иРНК и вы­стра­и­ва­ет из опре­де­лён­ных ами­но­кис­лот длин­ную по­ли­мер­ную цепь белка. Ами­но­кис­ло­ты до­став­ля­ют­ся к ри­бо­со­мам с по­мо­щью транс­порт­ных РНК. Для каж­дой ами­но­кис­ло­ты тре­бу­ет­ся своя транс­порт­ная РНК, ко­то­рая имеет форму три­лист­ни­ка. У неё есть уча­сток, к ко­то­рому при­со­еди­ня­ет­ся ами­но­кис­ло­та и дру­гой три­плет­ный ан­ти­ко­дон, ко­то­рый свя­зы­ва­ет­ся с ком­пле­мен­тар­ным ко­до­ном в мо­ле­ку­ле иРНК.

Це­поч­ка ин­фор­ма­ци­он­ной РНК обес­пе­чи­ва­ет опре­де­лён­ную по­сле­до­ва­тель­ность ами­но­кис­лот в це­поч­ке мо­ле­ку­лы белка. Время жизни ин­фор­ма­ци­он­ной РНК ко­леб­лет­ся от двух минут (как у неко­то­рых бак­те­рий) до несколь­ких дней (как, на­при­мер, у выс­ших мле­ко­пи­та­ю­щих). Затем ин­фор­ма­ци­он­ная РНК раз­ру­ша­ет­ся под дей­стви­ем фер­мен­тов, а нук­лео­ти­ды ис­поль­зу­ют­ся для син­те­за новой мо­ле­ку­лы ин­фор­ма­ци­он­ной РНК. Таким об­ра­зом, клет­ка кон­тро­ли­ру­ет ко­ли­че­ство син­те­зи­ру­е­мых бел­ков и их тип.

Трансляция пошагово:

  1. Рибосома узнаёт КЭП, садится на иРНК.
  2. На Р-сайт рибосомы приходит первая тРНК с аминокислотой.
  3. На А-сайт рибосомы приходит вторая тРНК с аминокислотой.
  4. АК образуют пептидную связь.
  5. Рибосома делает шаг длиною в один триплет.
  6. На освободившийся А-сайт приходит следующая тРНК.
  7. АК образуют пептидную связь.
  8. Процессы 5–7 продолжаются, пока рибосома не встретит стоп-кодон.
  9. Рибосома разбирается, отпускает полипептидную цепь.
По промокоду
BIO92020 вы получите бесплатный доступ к курсу биологии 9 класса. Выберите нужный раздел и изучайте биологию вместе с домашней онлайн-школой «Фоксфорда»!

Резюме

Теперь вы знаете, что биосинтез необходим для выживания — без него клетка умрёт. Процесс биосинтеза белков включает в себя особые реакции, встречающиеся только в живой клетке, — это реакции матричного синтеза.

Син­тез белка со­сто­ит из двух эта­пов: тран­скрип­ции (об­ра­зо­ва­ние ин­фор­ма­ци­он­ной РНК по мат­ри­це ДНК, про­те­ка­ет в ядре клет­ки) и транс­ля­ции (эта ста­дия про­хо­дит в ци­то­плаз­ме клет­ки на ри­бо­со­мах). Эти этапы сменяют друг друга и состоят из последовательных процессов.

Источник

Презентация «Биосинтез белка»

Юсупова Х. М.

Учитель биологии и химии

МКОУ «Зубутли – Миатлинская СОШ»

Продолжить формирование знаний о механизмах биосинтеза белка, показав роль иРНК и тРНК, а так же раскрыть механизмы матричного синтеза полипептидной цепи на рибосомах.

— Рассмотреть принцип, лежащий в основе процесса синтеза и-РНК;

— Определить свойства генетического кода;

— Сформировать знания о механизмах трансляции и транскрипции;

Синтез белка – это сложный многоступенчатый процесс образования белковой молекулы (полимера) из аминокислот (мономеров), который подразделяется на несколько этапов.

ЭТАПЫ СИНТЕЗА БЕЛКА

Необходимые условия

Нуклеиновые кислоты

ТРАНСКРИПЦИЯ

ТРАНСЛЯЦИЯ

Много ферментов

ИНИЦИАЦИЯ

Много энергии (АТФ)

ЭЛОНГАЦИЯ

Рибосомы

ТЕРМИНАЦИЯ

Аминокислоты

ПОСТРАНСЛЯЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ

Ионы Mg 2+

4

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД – система записи генетической информации в молекуле нуклеиновой кислоты о строении молекулы полипептида, количестве, последовательности расположения и типах аминокислот.

Характеристика генетического кода

Вспомним !

СВОЙСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА

Триплетность

Однозначность

Вырожденность

Неперекрываемость

(избыточность)

Непрерывность

Универсальность

РНК

иРНК (мРНК)

тРНК

рРНК

Основная функция трансляции — считывания информации с мРНК аминокислот

Транспортировка аминокислот к месту синтеза белка

Перенос информации о первичной структуре белков от ДНК к местам синтеза белков

3-5% всей РНК в клетке.

80% всей РНК клетки

15% всей клеточной РНК.

Общая принципиальная схема биосинтеза белка.

Транскрипция

Молекула ДНК

Комплементарная мРНК (иРНК)

Белок

АТФ

ЯДРО

Трансляция

2

Удлинение полипептидной цепи

3

1

Окончание синтеза

Начало синтеза

Посттрансляционная

модификация

Формирование вторичной, третичной и четвертичной структуры белка при участии ферментов и с затратой энергии

третичная

вторичная

четвертичная

Список использованных источников

  • Кравченко К.В. Молекулярная биология. –М.: Эксмо, 1989
  • Тимолянова Е.К. Медицинская генетика/Серия «Медицина для вас». – Ростов н/Д: Феникс, 2003. – 304 с.
  • Реймерс Н.Ф. Основные биологические понятия и термины : Кн. Для учителя. – М.: Просвещение, 1988. 319 с. – ISBN 5-09-000278-9
  • Шерснев М.П. Химия и биология нуклеиновых кислот: Кн. Для учащихся 10-11 кл. сред. Шк. – М.: Просвещение, 1990. – 160 с. – ISBN 5—09-001421-3
  • Франк-Каменецкий М.Д. Самая главная молекула. М.: Наука, 1983. – 160 с.
  • Трансляционная модификация

http://www.ebio.ru/images/08010502.jpg

7. Трансляция

http://images.nature.web.ru/nature/2000/12/13/0001157658/1.gif

8. Транскрипция

http://img.lenta.ru/news/2005/10/20/dna/picture.jpg

9. Третичный белок

http://chem.kcn.ru/science/Katz1/mediator34/hemoglobin.jpg

Спасибо за внимание

По всем возникшим вопросам обращайтесь на почту: [email protected]

Биосинтез Белка — Всё для чайников

Биосинтез Белка

Подробности
Категория: Биология

Документальные учебные фильмы. Серия «Биология».

 Информационная РНК (рибонуклеиновая кислота), несущая сведения о первичной структуре белковых молекул, синтезируется в ядре. Пройдя через поры ядерной оболочки, и-РНК направляется к рибосомам, где осуществляется расшифровка генетической информации — перевод ее с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот.

 Аминокислоты, из которых синтезируются белки, доставляются к рибосомам с помощью специальных РНК, называемых транспортными (т-РНК). Эти небольшие молекулы, состоящие из 70-90 нуклеотидов, способны сворачиваться таким образом, что образуют структуры, напоминающие по форме лист клевера. В клетке имеется столько же разных типов т-РНК, сколько типов кодонов, шифрующих аминокислоты. На вершине каждого «листа» т-РНК имеется последовательность трех нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам кодона в и-РНК. Такая последовательность нуклеотидов в структуре т-РНК называется антикодоном. Специальный фермент «узнает» антикодон и присоединяет к «основанию листа» т-РНК не какую угодно, а определенную, «свою» аминокислоту. В этом состоит первый этап синтеза.
 Для того чтобы аминокислота включилась в цепь белка, она должна оторваться от т-РНК. На втором этапе синтеза белка т-РНК выполняет функцию переводчика с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот. Такой перевод происходит на рибосоме. В ней имеется два участка. на одном т-рНК получает команду от и-РНК — антикодон узнает кодон, на другом — выполняется приказ — аминокислота отрывается от т-РНК.

 Третий этап синтеза белка заключается в том, что фермент синтеза присоединяет оторвавшуюся от т-РНК аминокислоту к белковой молекуле. Информационная РНК непрерывно скользит по рибосоме, каждый триплет сначала попадает в первый участок, где узнается антикодоном т-РНК, затем на второй участок. Сюда же переходит т-РНК с присоединенной к ней аминокислотой, здесь аминокислоты отрываются от т-РНК и соединяются друг с другом в той последовательности, в которой триплеты следуют один за другим.

Схема биосинтеза белка.

 Когда на рибосоме в первом участке оказывается один из трех триплетов, являющихся знаками препинания между генами, это означает, что синтез белка завершен. Готовая цепь белка отходит от рибосомы.

 Процесс синтеза белковой молекулы требует больших затрат энергии. На соединение каждой аминокислоты с т-РНК расходуется энергия одной молекулы АТФ. Средний по размерам белок состоит из 500 аминокислот, следовательно, столько же молекул АТФ расщепляется в процессе его синтеза. Кроме того, энергия нескольких молекул АТФ нужна для движения и-РНК по рибосоме.

 Для увеличения производства белков и-РНК часто одновременно проходит не через одну, а через несколько рибосом последовательно. Такую структуру, объединенную одной молекулой и-РНК, называют полисомой. На каждой рибосоме в таком, похожем на нитку бус, конвейере последовательно синтезируются несколько молекул одинаковых белков.

Синтез белков на полисоме.

 Аминокислоты бесперебойно поставляются к рибосомам с помощью т-РНК. Отдав аминокислоту, молекула т-РНК тут же соединяется с другой такой же аминокислотой. Высокая слаженность всех «служб комбината» по производству белков позволяет в течение нескольких минут синтезировать молекулы, состоящие из сотен аминокислот. Синтез белка на рибосомах носит название трансляции.

 

Биосинтез белка (реализация наследственной информации)

Важнейшие функции организма — обмен веществ, рост, развитие, передача наследственности, движение и др. — осуществляются в результате множества химических реакций с участием белков, нуклеиновых кислот и других биологически активных веществ. При этом в клетках непрерывно синтезируются разнообразные соединения: строительные белки, белки-ферменты, гормоны. В ходе обмена эти вещества изнашиваются и разрушаются, а вместо них образуются новые. Поскольку белки создают материальную основу жизни и ускоряют все реакции обмена веществ, жизнедеятельность клетки и организма в целом определяется способностью клеток синтезировать специфические белки. Их первичная структура предопределена генетическим кодом в молекулеДНК.

Молекулы белков состоят из десятков и сотен аминокислот (точнее, из аминокислотных остатков). Например, в молекуле гемоглобина их около 600, и они распределены в четыре полипептидные цепочки; в молекуле рибонуклеазы таких аминокислот 124 и т. д.

Главная роль в определении первичной структуры белка принадлежит молекулам ДНК. Разные ее участки кодируют синтез разных белков, следовательно, одна молекула ДНК участвует в синтезе многих индивидуальных белков. Свойства белков зависят от последовательности аминокислот в полипептидной цепи. В свою очередь чередование аминокислот определяется последовательностью нуклеотидов в ДНК, и каждой аминокислоте соответствует определенный триплет. Экспериментально доказано, что, например, участок ДНК с триплетом ААЦ соответствует аминокислоте лейцину, триплет АЦЦ — триптофану, триплет АЦА-цистеину и т.д. Распределив молекулу ДНК на триплеты, можно представить, какие аминокислоты и в какой последовательности будут располагаться в молекуле белка. Совокупность триплетов составляет материальную основу генов, а каждый ген содержит информацию о структуре специфического белка (ген — это основная биологическая единица наследственности; в химическом отношении ген есть участок ДНК, включающий несколько сотен пар нуклеотидов).

Генетический код — исторически сложившаяся организация молекул ДНК и РНК, при которой последовательность нуклеотидов в них несет информацию о последовательности аминокислот в белковых молекулах. Свойства кода: триплетность (кодон), неперекрываемость (кодоны следуют друг за другом), специфичность (один кодон может определять в полииептидной цепи только одну аминокислоту), универсальность (у всех живых организмов один и тот же кодон обусловливает включение в полипептид одну и ту же аминокислоту), избыточность (для большинства аминокислот существует несколько кодонов). Триплеты, не несущие информации об аминокислотах, являются стоп триплетами, обозначающими место начала синтеза и-РНК. (В.Б. Захаров. Биология. Справочные материалы. М.,1997)

Поскольку ДНК находится в ядре клетки, а синтез белка происходит в цитоплазме, существует посредник, передающий информацию с ДНК на рибосомы. Таким посредником служит и РНК, на которую нуклеотидная последовательность переписывается, в точном соответствии с таковой на ДНК — по принципу комплементарности. Этот процесс получил название транскрипции и протекает как реакция матричного синтеза. Он характерен только для живых структур и лежит в основе важнейшего свойства живого — самовоспроизведения. Биосинтезу белка предшествует матричный синтез иРНК на нити ДНК. Возникшая при этом иРНК выходит из ядра клетки в цитоплазму, где на нее нанизываются рибосомы, сюда же с помощью тРЙК доставляются аминокислоты.

Синтез белка — сложный многоступенчатый процесс, в котором участвуют ДНК, иРНК, тРНК, рибосомы, АТФ и разнообразные ферменты. Вначале аминокисдоты в цитоплазме активируются с помощью ферментов и присоединяются к тРНК (к участку, где расположен нуклеотид ЦЦА). На следующем этапе идет соединение аминокислот в таком порядке, в каком чередование нуклеотидов с ДНК передано на иРНК. Этот этап называется трансляцией. На нити иРНК размещается не одна рибосома, а группа их — такой комплекс называется полисома (Н.Е. Ковалев, Л.Д. Шевчук, О.И. Щуренко. Биология для подготовительных отделений медицинских институтов).

Схема Биосинтез белка

Синтез белка состоит из двух этапов — транскрипции и трансляции.

I. Транскрипция (переписывание) — биосинтез молекул РНК, осуществляется в хромосомах на молекулах ДНК по принципу матричного синтеза. При помощи ферментов на соответствующих участках молекулы ДНК (генах) синтезируются все виды РНК (иРНК, рРНК, тРНК). Синтезируется 20 разновидностей тРНК, так как в биосинтезе белка принимают участие 20 аминокислот. Затем иРНК и тРНК выходят в цитоплазму, рРНК встраивается в субъединицы рибосом, которые также выходят в цитоплазму.

II. Трансляция (передача) — синтез полипептидных цепей белков, осуществляется в рибосомах. Она сопровождается следующими событиями:

1. Образование функционального центра рибосомы — ФЦР, состоящего из иРНК и двух субъединиц рибосом. В ФЦР всегда находятся два триплета (шесть нуклеотидов) иРНК, образующих два активных центра: А (аминокислотный) — центр узнавания аминокислоты и П (пептидный) — центр присоединения аминокислоты к пептидной цепочке.

2. Транспортировка аминокислот, присоединенных к тРНК, из цитоплазмы в ФЦР. В активном центре А осуществляется считывание антикодона тРНК с кодоном иРНК, в случае комплементарностн возникает связь, которая служит сигналом для продвижения (скачок) вдоль иРНК рибосомы на один триплет. В результате этого комплекс «кодон рРНК и тРНК с аминокислотой» перемещается в активный центр П, где и происходит присоединение аминокислоты к пептидной цепочке (белковой молекуле). После чего тРНК покидает рибосому.

3. Пептидная цепочка удлиняется до тех пор, пока не закончится трансляция и рибосома не соскочит с иРНК. На одной иРНК может умещаться одновременно несколько рибосом (полисома). Полипептидная цепочка погружается в канал эндоплазматиче-ской сети и там приобретает вторичную, третичную или четвертичную структуру. Скорость сборки одной молекулы белка, состоящего из 200-300 аминокислот, составляет 1-2 мин. Формула биосинтеза белка: ДНК (транскрипция) —> РНК (трансляция) —> белок.


Завершив один цикл, полисомы могут принять участие в синтезе новых молекул белка.

Отделившаяся от рибосомы молекула белка имеет вид нити, которая биологически неактивна. Биологически функциональной она становится после того, как молекула приобретает вторичную, третичную и четвертичную структуру, т. е. определенную пространственно специфическую конфигурацию. Вторичная и последующие структуры белковой молекулы предопределены в информации, заложенной в чередовании аминокислот, т. е. в первичной структуре белка. Иначе говоря, программа образования глобулы, ее уникальная конфигурация определяются первичной структурой молекулы, которая в свою очередь строится под контролем соответствующего гена.

Скорость синтеза белка обусловлена многими факторами : температурой среды, концентрацией водородных ионов, количеством конечного продукта синтеза, присутствием свободных аминокислот, ионов магния, состоянием рибосом и др.

Биосинтез белка — обзор

Механизм действия ингибиторов синтеза белка

Синтез белка происходит в цитоплазме на рибонуклеопротеиновых частицах, рибосомах. Матричная РНК, которая содержит в своей нуклеотидной последовательности код, управляющий синтезом одной или нескольких полипептидных цепей, синтезируется РНК-полимеразой на ДНК-матрице и транспортируется в цитоплазму, где связывается с рибосомами и управляет размещением аминоацил-транспортные РНК в правильной последовательности.Аминокислота, которая была активирована и этерифицирована до определенного вида тРНК, связывается с рибосомным акцепторным участком посредством кодон-антикодоновых взаимодействий. Пептидилтрансфераза, неотъемлемая часть рибосомы, катализирует образование пептидной связи между карбоксильной группой образующегося пептида (связанной в виде пептидил-тРНК с донорным участком рибосомы) и аминогруппой новой аминокислоты. Образовавшаяся пептидил-тРНК перемещается на донорский сайт ферментом, нуждающимся в GTP, освобождая акцепторный сайт для присоединения следующей аминоацил-тРНК (Watson, 1970).

Взаимосвязь между синтезом белка и физиологическим проявлением радиационного поражения изучалась прежде всего с использованием ингибиторов синтеза белка. Выводы, сделанные в результате этих исследований, основаны на двух предположениях: во-первых, что торможение затрагивает одну и только одну биохимическую реакцию, и, во-вторых, что эта специфическая биохимическая реакция не оказывает быстрого косвенного влияния на общий метаболизм клетки.

Пуромицин, который действует как аналог аминоацил-тРНК (Morris and Schweet, 1961; Rabinovitz and Fisher, 1962), по-видимому, ингибирует синтез белка в прокариотических и эукариотических клетках, высвобождая неполные полипептидные цепи из рибосомы (Allen and Zamecnik , 1962; Натанс, 1964). Циклогексимид может ингибировать инициацию, удлинение или прекращение синтеза белка в эукариотических клетках, блокируя транслокацию, тем самым предотвращая дальнейшее движение рибосомы по матричной РНК (Obrig et al., 1971; Rajalakshmi et al., ). 1971). Хлорамфеникол ингибирует синтез белка в бактериях и избирательно ингибирует синтез белка в митохондриях и хлоропластах изученных эукариотических клеток (Sager, 1972).Этот антибиотик связывается с большой субъединицей рибосомы (Vazquez, 1965) и препятствует образованию пептидной связи (например, Traut, Monro, 1964). Стрептомицин специфически ингибирует микробный и митохондриальный синтез белка, связываясь с малой субъединицей рибосомы (Davies, 1964; Cox et al., 1964) и вызывая неправильное прочтение генетического кода (Davies et al., 1964).

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Инициация синтеза белка

Инициация синтеза белка

Механизм синтеза белка должен выбрать соответствующие начальные точки для считывания мРНК и образования пептидной связи.AUG обычно используется в качестве стартового кодона, и практически все белки начинаются с метионина. AUG также является кодоном метионина, который также встречается внутри белка, поэтому должен существовать механизм, позволяющий различать два типа кодонов метионина.

Этапы инициации происходят на изолированной малой субъединице (30S) прокариотической рибосомы. Рибосомы содержат две субъединицы, 30S и 50S субъединицы, которые объединяются, образуя 70S частицу. (Значения S относятся к скорости, с которой каждый компонент осаждается в ультрацентрифуге; они не всегда складываются.) В целом, субъединица 30S в основном участвует в процессах декодирования и взаимодействия тРНК-мРНК, тогда как субъединица 50S участвует в фактическом синтезе пептидной связи. Рибосомные субъединицы диссоциируют до реакции инициации.

Трансляция инициируется на 5′-конце мРНК. Поскольку РНК синтезируется в 5′-3′-направлении, бактериальная мРНК может начать трансляцию, пока 3′-последовательности все еще транскрибируются. Это важно в нескольких формах биологического контроля.

Для начала синтеза белка используется специальный инициатор тРНК, тРНК мет I (I — инициатор).У бактерий эта инициирующая тРНК несет модифицированную аминокислоту N-формилметионин (fmet). Реакция формилирования переносит формильную группу от формил-тетрагидрофолата к метионил-тРНК met I + . Эта инициирующая тРНК используется для распознавания инициирующих кодонов; он не вставляет met в ответ на внутренний кодон AUG. В качестве дополнительной защиты реакция формилирования гарантирует, что инициатор метионин может находиться только на амино-конце синтезируемого белка.

Этап декодирования синтеза белка включает спаривание оснований между последовательностями кодона мРНК и антикодона тРНК.Дальнейшее спаривание оснований между некодирующими областями мРНК и рРНК необходимо для выбора правильной рамки считывания и кодона инициации. Бактериальные мРНК содержат богатую пуринами последовательность (называемую «Shine-Dalgarno» или RBS , что является аббревиатурой от Ribosome-Binding Sequence) в 5′-нетранслируемой области мРНК. Эта последовательность комплементарна 3′-концу малой субъединицы рРНК, 16S рРНК. См. Рисунок  1.

                        Рисунок 1

После установления спаривания оснований синтез белка начинается с первой AUG ниже по течению от RBS.Эта особенность инициации используется как форма трансляционного контроля. РНК-мессенджеры с наибольшей степенью комплементарности RBS по отношению к 16S рРНК транслируются наиболее эффективно, по-видимому, потому, что они инициируются более эффективно.

Несколько факторов белка участвуют в процессе инициации. Эти факторы обычно не являются частью рибосомы; вместо этого они помогают сформировать активный комплекс инициации. Фактор инициации 3 (IF3) помогает отделить субъединицу 30S от субъединицы 50S и сделать ее доступной для синтеза белка.IF1 связывается с изолированной субъединицей 30S и помогает формировать комплекс между RBS и 16S рРНК. IF2 образует комплекс с fmet-тРНК , встретил , , I и GTP, высвобождая IF3. После того, как комплекс содержит мРНК и инициатор fmet-тРНК, происходит следующее: GTP гидролизуется до GDP, факторы инициации высвобождаются из рибосомы, и субъединица 50S связывается с комплексом, образуя удлиняющуюся рибосому, как показано на рисунке  2.

                          Рисунок 2

границ | Изучение потенциала бесклеточного синтеза белка для расширения возможностей биологических систем

Введение

Синтетическая биология возникла и продолжает развиваться как бурно развивающаяся научная область, сочетающая инженерные принципы с биологическими науками.Он определяется как «проектирование и создание синтетических биологических частей, устройств и систем, не существующих в природе, а также включает в себя перепроектирование природных систем для биотехнологических применений» (Endy, 2005; Khalil and Collins, 2010; Qi и Аркин, 2014; Сингх, 2014а). За последнее десятилетие был разработан и охарактеризован ряд синтетических промоторов, сайтов связывания рибосом, синтетических генов, каркасов и факторов транскрипции для широкого круга организмов и типов клеток (Lutz and Bujard, 1997; Alper et al., 2005; Пфлегер и др., 2006 г.; Вин и Смольке, 2008; Салис и др., 2009). Точно так же синтетические генераторы (Elowitz and Leibier, 2000; Stricker et al., 2008; Danino et al., 2010), тумблеры (Gardner et al., 2000; Atkinson et al., 2003), биологические ворота (Tamsir et al. ., 2011; Moon et al., 2012; Shis and Bennett, 2013; Singh, 2014b), риборегуляторы (Isaacs et al., 2004; Na et al., 2013) и рибопереключатели (Tucker and Breaker, 2005; Blount и Breaker, 2006; Patel et al., 2018) также были разработаны и охарактеризованы для многих организмов.

Синтетические системы использовались в широком спектре биотехнологических приложений, включая обнаружение раковых клеток (Culler et al., 2010; Nissim and Bar-Ziv, 2010), тумблеры для управления метаболическим потоком (Soma et al., 2014). ), осцилляторы для периодической экспрессии генов (Sowa et al., 2014), регуляторы Т-клеток (Chen et al., 2010), искусственное осеменение (Kemmer et al., 2011) и многие другие. Синтетические хромосомы (Gibson et al., 2009, 2010; Kosuri et al., 2010; Kim et al., 2012; Hutchison et al., 2016) и мультиплексная автоматизированная инженерия генома (Wang et al., 2009, 2012; Isaacs et al., 2011; Lajoie et al., 2013; Rovner et al., 2015) также были разработаны с использованием инструменты синтетической биологии.

Охват синтетической биологической инженерии генома был значительным для широкого круга организмов, которые в настоящее время включают бактерии, вирусы, дрожжи, дрозофилу , рыбок данио и клетки млекопитающих (Cong et al., 2013; DiCarlo et al., 2013; Хванг и др., 2013; Цзян и др., 2013 г.; Мали и др., 2013 г.; Порт и др., 2014 г.; Рен и др., 2014; Хисано и др., 2015; Якочюнас и др., 2015; Чжу и др., 2015; Сингх и др., 2017, 2018). С ростом глобальной осведомленности о проблемах здоровья, энергетики и окружающей среды приоритетность исследования и применения синтетической биологии стала неизбежной, учитывая потенциальные возможности, которые могут предложить эти новые науки. Недавние достижения в области инструментов синтетической биологии расширили их использование в фундаментальных науках, биомедицинских науках, биотехнологиях и промышленности.Это расширение и развитие становятся особенно полезными для ускорения изобретений и инноваций в области синтетической биологии.

Устрашающая сложность и барьер, создаваемый клеточной мембраной, вызывают многочисленные трудности, такие как трудности стандартизации эксперимента, проблемы несовместимости и изменчивость. Для решения этих проблем в качестве ключевого инструмента, который может работать без использования живых клеток, появились системы бесклеточного синтеза белка (CFPS), также известные как синтез белка in vitro .Эти системы позволяют напрямую контролировать транскрипцию, трансляцию и метаболизм в формате открытого кода (Carlson et al., 2012; Lu, 2017; Moore et al., 2017; Jiang et al., 2018; Yue et al., 2019). ). CFPS представляет собой исторически важный компонент в области биохимии, должным образом признавая новаторские усилия, предпринятые лауреатом Нобелевской премии Эдуардом Бюхнером (Нобелевская премия по химии 1907 г.) для открытия ферментации в экстрактах клеток дрожжей (YCE) (Buchner, 1897 г.). С тех пор он был перепрофилирован для понимания биологических процессов, в первую очередь способствуя открытию генетического кода благодаря использованию экстракта клеток Escherichia coli Ниренбергом и его коллегами (Nirenberg and Matthaei, 1961; Matthaei et al., 1962), что в конечном итоге привело к тому, что они выиграли и разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1968 году вместе с Хар Гобиндом Хораной и Робертом Холли.

С развитием синтетической биологии (Gibson et al., 2010) бесклеточные системы заняли научную нишу, помогая лучше понять генные сети и пути биосинтеза (Hodgman and Jewett, 2012; Koch et al., 2018). ). CFPS требует основного механизма РНК-полимеразы, аппарата трансляции (рибосомы, тРНК-синтазы и факторы трансляции), молекул, генерирующих энергию, и их кофакторов, субстратов и матриц ДНК или плазмид для получения желаемых продуктов.CFPS использовался для многочисленных экспериментов, включая производство белков, которые должны быть включены в токсичные аминокислоты, такие как канаванин (Worst et al., 2015), включение ортогональных генетических кодов (Chemla et al., 2015; Des Soye et al. al., 2015), производство терапевтических препаратов (Zawada et al., 2011), тестирование сложных генных сетей (Shin and Noireaux, 2012; Takahashi et al., 2015a,b), сборка бактериофагов (Shin et al., 2012 ), и многое другое. В настоящем обзоре мы освещаем недавний прогресс и использование CFPS в биомедицинских, терапевтических, промышленных и биотехнологических приложениях.

Подготовка систем CFPS

Для производства интересующего белка в системах CFPS используются компоненты сырых клеточных лизатов микроорганизмов, растений или животных для получения энергии и синтеза белка. Обычно используются неочищенные экстракты E. coli , ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы (WGE), клеток насекомых (Kigawa et al., 2004; Liu et al., 2005; Schwarz et al., 2007) или системы очищенные рекомбинантные элементы (PURE) (Shimizu et al., 2001; Kuruma and Ueda, 2015), которые имеются в продаже.Подготовка системы CFPS представляет собой простой процесс, при котором интересующие клетки выращивают в течение ночи, разбавляют и выращивают до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,8–1,0, после чего клетки собирают и обрабатывают ультразвуком для извлечения клеточного лизата. Буферная смесь, дополненная необходимыми кофакторами, источниками энергии, нуклеотидами, субстратами, аминокислотами и тРНК, добавляется к клеточному экстракту, чтобы превратить его в CFPS и бесклеточную систему транскрипции-трансляции (TX-TL) (Rustad et al. , 2017). Сравнение преимуществ систем CFPS перед аналогами на живых клетках приведено в таблице 1.Хотя стоимость систем CFPS остается относительно высокой, ее можно снизить за счет регенерации энергии и кофакторов (Kim and Swartz, 2001; Woodyer et al., 2006).

Таблица 1 . Сравнение обычных живых клеток и систем CFPS.

Общая схема системы CFPS показана на рисунке 1, демонстрирующем эксперимент с одной пробиркой с соответствующими буферами, содержащими необходимый клеточный лизат и ДНК (линейную или плазмидную), а также соответствующие источники энергии, нуклеотиды, аминокислоты, соли и кофакторы. , которые в целом поддерживают реакцию для получения интересующего продукта.Продукты CFPS могут различаться по многочисленным химическим или биологическим компонентам, включая вирусы, терапевтические средства, антитела, химические вещества, биотопливо и белки. При производстве таких химических веществ существуют непосредственные преимущества, которые системы CFPS имеют по сравнению с альтернативными системами in vivo , особенно с учетом относительной скорости, простоты и эффективности технологии. Как правило, системы in vivo требуют много времени и, как правило, имеют больше шагов, чем системы CFPS (показаны на рисунке 2).

Рисунок 1 . Схематическое изображение системы CFPS, выполненной в одной пробирке, для которой требуются клеточный лизат, источники энергии, нуклеотиды, аминокислоты, соли, кофакторы, линейная или плазмидная ДНК и вода/буфер для поддержания реакции. Такая система может быть использована для синтеза вирусов, антител, терапевтических и высокопроизводительных белков.

Рисунок 2 . Сравнение обычной системы in vivo и системы CFPS. Система in vivo способна производить рекомбинантные белки или терапевтические соединения, подобные системе CFPS, хотя для достижения эквивалентного результата требуется больше экспериментальных этапов и времени.

Несмотря на это, существует желание дальнейшего снижения стоимости и увеличения выхода продукта CFPS, особенно с учетом периода полураспада реакции, и, соответственно, исследователи вложили свое время и усилия в поиск альтернатив соединениям, которые можно использовать в качестве субстратов. для синтеза белка в системах CFPS (Zemella et al., 2015). Использование фосфоенолпирувата (ФЕП) в качестве источника энергии приводит к быстрому накоплению фосфатов из-за присутствия фосфатазы в лизате клеток (Zemella et al., 2015), что, в свою очередь, приводит к уменьшению количества АТФ из среды CFPS (Calhoun, Swartz, 2005). Известно также, что накопление фосфата ингибирует синтез белка в бесклеточной среде из-за снижения концентрации свободного магния в реакционной системе (Kim and Swartz, 1999). Использование глюкозо-6-фосфата вместо PEP в качестве источника энергии приводит к более высокому выходу белка в бесклеточной среде (Calhoun and Swartz, 2005). Имитация физиологии цитоплазмы — еще один способ увеличить выход белка в бесклеточных системах.Jewett и Swartz (2004) продемонстрировали, что имитация pH цитоплазмы и использование соответствующих буферов в реакционных системах увеличивает выход синтеза белка при использовании пирувата в качестве источника энергии. Была предпринята аналогичная попытка получить высокий выход белков при использовании более дешевого субстрата. В исследовании использовали фруктозо-1,6-бисфосфат в качестве источника энергии для синтеза белка и получили титр белков 1,3 мг/мл с расчетной стоимостью продуктивности около 0,5 долларов США за миллиграмм белка (Kim et al., 2007).

Исследователи разработали протокол, с которым могут легко работать даже неспециалисты (Levine et al., 2019). Протокол основан на выращивании клеток E. coli в обогащенной среде с использованием колбы с перегородкой и подготовке ее лизата посредством обработки ультразвуком. При добавлении соответствующих реагентов и других субстратов протокол, разработанный Levine et al. (2019) удалось получить 0,9 мг/мл зеленого флуоресцентного белка суперпапки (sfGFP) за 5 часов реакции по цене 21 доллар США за миллиграмм синтезированного белка.Также было проведено исследование, которое позволяет исследователям транскрибировать и транслировать интересующий белок способом in vitro с использованием лизата термофильного организма, названного Sulfolobus solfataricus (Lo Gullo et al., 2019). Протокол позволяет пользователю экспрессировать активный белок при высокой температуре. Установлено, что оптимальная температура для проведения реакции составляет 70°С без добавления экзогенных компонентов. Однако авторы пришли к выводу, что разработанный протокол еще не подходит для крупномасштабного производства рекомбинантного белка (Lo Gullo et al., 2019). Из-за высокой скорости синтеза белка, обнаруженной у Vibrio natriegens , ее экстракт может выступать в качестве потенциального кандидата на высокую скорость СХБС. В связи с этим была разработана очень универсальная платформа V. natriegens CFPS путем обработки клеток ультразвуком, что устраняет необходимость в дорогостоящих инструментах. Титр 1,6 ± 0,05 мг/мл sfGFP был получен в периодическом режиме CFPS, доказывая, что система CFPS на основе V. natriegens была почти такой же хорошей, как текущая CFPS, в которой E.coli предлагает. При лиофилизации активные экстракты сохраняли свойства биосинтеза и способность продуцировать антимикробные пептиды (Des Soye et al., 2018). Точно так же был разработан протокол, в котором используются обычные лабораторные инструменты, а клеточный экстракт может быть приготовлен в течение 1–2 дней с использованием ультразвука. Более 0,26 мг/мл белка sfGFP было синтезировано в течение 3 часов после начала реакции с использованием разработанного протокола путем включения экстрактов V. natriegens (Wiegand et al., 2019).

Традиционно исследования мембранных белков проводят путем получения стабильных выходов целевых белков в виде преципитатов без использования структур, имитирующих мембраны (Zemella et al., 2015). Это приводит к относительно трудоемким этапам очистки и повторного растворения, которые могут изменить характеристики целевого белка. Мембраноподобные структуры, включающие детергенты (такие как Triton X-100 и Digitonin), нанодиски и липосомы, использовались для облегчения правильной укладки мембранных белков в бесклеточной среде (Zemella et al., 2015). Сгущение, вызванное высокой концентрацией макромолекул, влияет на константы равновесия и кинетические скорости экспериментов, включая бесклеточные эксперименты на основе TX-TL (Minton, 2001). Учитывая это, Rustad et al. (2017) синтезировали бактериофаги MS2, ΦX174 и T7 в отдельных реакциях OnePot с использованием бесклеточной системы TX-TL на основе E. coli . Чтобы лучше имитировать физиологию цитоплазмы, они исследовали воздействие путем изменения концентрации магния и калия, а также путем увеличения молекулярной скученности при добавлении ПЭГ 8000 (до 4.5% мас./об.), что продемонстрировало сильное влияние на синтез фага. Для дальнейшего изучения влияния скопления макромолекул в системе CFPS было предложено уравнение для описания in vitro биомимикрии скопления среды, присутствующей в E. coli в требуемом объеме реакционной смеси с использованием ее лизата (Khambhati et al. ., 2019а). Сан и др. (2013) разработали новый метод с использованием штамма E. coli BL21 Rosetta 2, способный получить доступ как к эндогенному, так и к экзогенному клеточному механизму E.coli для синтеза белка. Они использовали измельчение гранул вместо гомогенизации и обработку ультразвуком для лизиса клеток, чтобы избежать нагревания образца, и использовали использование 3-фосфоглицериновой кислоты в качестве источника энергии, отметив более высокий выход, чем PEP и креатинфосфат. По сравнению с коммерчески доступными бесклеточными системами, это исследование продемонстрировало снижение затрат на 98% при материальных затратах 0,011 долларов США на микролитр клеточной реакции, в результате чего было получено 0,75 мг/мл GFP.

С развитием систем CFPS исследователи также попытались использовать нерибосомные пути биосинтеза для производства циклических пептидов in vitro.Геринг и др. (2016) использовали PEP в качестве источника энергии для синтеза дикетопиперазина D-Phe-L-Pro (DKP), циклического дипептида. ДКП получали путем бесклеточной коэкспрессии плазмид, содержащих гены GrsA и GrsB1 . Кроме того, для приготовления клеточных лизатов использовали штамм E. coli BL21 Star [DE3]. Для перевода GrsA и GrsB1 в их функциональные формы Bodipy-CoA и Sfp добавляли непосредственно в систему после инкубации плазмид в течение 17 часов.Система состояла из эксперимента с одним сосудом, в котором титр DKP был равен 0,012 мг/мл. Включение неканонических аминокислот (NCAA) в полипептиды придает новые функциональные возможности и химические свойства целевому белку, но остается трудной задачей для выполнения in vivo из-за его токсичности (Worst et al., 2016). Чтобы решить эту проблему, Worst et al. (2016) создали бесклеточный протокол TX-TL, который позволяет успешно включать L-канаванин (вместо L-аргинина) и L-гидроксилизин (заменяющий L-лизин) в белки, тем самым расширяя потенциал для новых функциональные возможности, которые следует добавлять к белкам, избегая при этом риска клеточной токсичности.Эти исследования показывают, что бесклеточные системы могут быть ценным инструментом для производства сложных молекул. Была разработана экономически эффективная система OnePot PURE, которая предлагает исследователям выращивать 36 основных белков-продуцирующих клонов E. coli в одной колбе и очищать их с помощью одного метода очистки Ni-NTA. Установлено, что нормированное улучшение стоимости разработанного метода по сравнению с существующей системой PURE составляет 14 раз при стоимости 0,09 долларов США за микролитр реакции с титром 0.156 мг/мл белка (Lavickova and Maerkl, 2019).

Возможные области применения систем CFPS

Производительность, стоимость, масштаб и сложность рекомбинантных белков быстро расширили использование и коммерциализацию систем CFPS (Swartz, 2006). В этом разделе мы освещаем успехи, достигнутые с помощью систем CFPS в многочисленных проектах, направленных на увеличение и улучшение производства ценных продуктов, включая белки, ферменты и терапевтические средства. Потенциальные области применения систем CFPS представлены на рисунке 3.

Рисунок 3 . Многочисленные потенциальные применения систем CFPS для содействия высокопроизводительному производству белка, включая производство антител, белков с неестественными аминокислотами, терапевтических средств, вирусов и вирусоподобных частиц, а также генных цепей.

Высокопроизводительные белки

В постгеномную эру высокопроизводительные платформы CFPS привлекли большое внимание из-за их многочисленных преимуществ, которые включают (i) прямое использование матриц ПЦР, чтобы избежать исчерпывающих этапов клонирования, (ii) экономически эффективные реакции, (iii) потенциальные для миниатюризации, а также автоматизации с помощью микрожидкостных чипов и (iv) отсутствия барьера клеточной стенки, что позволяет легко манипулировать реакциями.Использование систем CFPS может быть лучшим выбором для мечения благодаря включению неприродных аминокислот (UAA), что очень полезно для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рентгеноструктурного анализа (Sawasaki et al., 2002; Jin and Хонг, 2018). Соответственно, CFPS продемонстрировал эффективность для легкого включения меченых аминокислот и высокой экспрессии белка, что позволяет лучше анализировать ЯМР (Sawasaki et al., 2002; Morita et al., 2003; Ozawa et al., 2004; Takai et al., 2008). ).

Системы

CFPS использовались для крупномасштабного синтеза белковых библиотек для исследований функциональной геномики.Массивы белков in situ (PISA) использовались для быстрого и эффективного создания систем CFPS для изучения взаимодействия белков на биочипах (He and Taussig, 2007; He et al., 2008). Системы CFPS на основе WGE использовались для синтеза 13 364 белков человека, создавая инфраструктуру для фабрики белков человека. Заметные результаты этого включают обнаружение 58 из 75 синтезированных ферментов фосфатазы человека как функциональных, а затем их печать на предметных стеклах для создания функционального белкового микрочипа (Goshima et al., 2008).

Клеточная линия яичника китайского хомячка (CHO)

признана безопасной и наиболее подходящей для промышленного производства белка. Клеточный лизат CHO содержит микросомы и может также содержать белки, включая дисульфидизомеразу или связывающий белок иммуноглобина, которые необходимы для образования дисульфидных мостиков и правильной укладки белков с дисульфидными мостиками. Эти особенности можно использовать для синтеза белков, которые трудно экспрессировать, путем обеспечения бесклеточных систем с непрерывным потоком лизата клеток CHO.Оптимизация условий реакции CFPS позволила получить до 0,98 мг/мл мембранного белка (Thoring et al., 2017). Помимо лизата клеток CHO, культивированные клетки Spodoptera frugiperda 21 также использовались для использования преимуществ транслокационно активных микросом. При сочетании внутренних сайтов посадки рибосом (IRES) и трансляции белков реакции непрерывного обмена CFPS продукция рецепторов эпидермального фактора роста достигала 0,285 мг/мл (Quast et al., 2016). Точно так же 0,7 мг/мл белка оболочки вируса (gp67) также получали из лизатов клеток насекомых (Merk et al., 2015). Системы CFPS могут быть дополнительно расширены для экспрессии и тестирования более высоких библиотек в 384-луночных форматах, что позволяет проводить сложные исследования и эксперименты с высокой пропускной способностью достаточно быстрее, быстрее и с меньшими затратами.

Белковые продукты играют жизненно важную роль в современной медицине. Значительную часть белков, используемых в биофармацевтике и промышленности, трудно экспрессировать, так как они часто слишком сложны и токсичны или относятся к мембранным белкам, которые трудно получить с помощью живых клеток.Следовательно, основной целью системы CFPS является регулирование и оптимизация продукции белка 90–115 in vitro 90–116 . Высокий уровень белковой токсичности может привести к гибели живых клеток во время клонирования генов и экспрессии in vivo . Токсичные белки могут нарушать метаболические пути биосинтеза и, как правило, ингибировать деление клеток. Следовательно, их трудно экспрессировать в больших количествах in vivo . Несколько высокотоксичных белков уже были экспрессированы и выделены из бесклеточных систем, включая эндонуклеазы рестрикции (Goodsell, 2002), цитолетальный токсин растяжения (Ceelen et al., 2006) и белок, связывающий микротрубочки человека (Betton, 2003). Поскольку рост и деление клеток не зависят, системы CFPS можно использовать в качестве альтернативной и отличной платформы для производства токсинов. Мембранные белки продолжают привлекать внимание ученых из-за их потенциала в качестве мишеней для лекарственных средств, хотя сверхэкспрессия таких белков остается критическим узким местом в ходе исследований из-за их сложной структуры, потенциальной токсичности, утомительной подготовки и низкой эффективности.В ряде исследований было высказано предположение, что системы CFPS можно использовать для сверхэкспрессии мембранных белков, при этом успехи были продемонстрированы для ряда мембранных белков, которые включают рецептор, связанный с G-белком (Orbán et al., 2015), вакцинные антигены (Welsh et al. ., 2012; Lu et al., 2014) и тетрациклиновый насос TetA (Wuu and Swartz, 2008). В связи с этим через систему CFPS была экспрессирована неприродная и высокотоксичная (в контексте живых клеток) аминокислота канаванин, аналог аргинина, который мог бы служить возможным антиметаболитом и органическим аллелохимическим агентом (Worst et al. ., 2015).

Система

CFPS даже использовалась для включения UAA с использованием ортогональной тРНК, производя 0,9–1,7 мг/мл растворимых вариантов sfGFP, содержащих либо п-азидо-L-фенилаланин (pAzF), либо п-пропаргилокси-L-фенилаланин (pPaF). , который накапливался в растворе CFPS (Albayrak, Swartz, 2013). Соответственно, CFPS использовался для включения нестандартных аминокислот (nsAA) для создания белков и ферментов с новыми свойствами, обновленными структурными элементами и важными функциями (Hong et al., 2014). Для препаратов клеточного лизата использовали клеток E. coli , лишенных RF1 (фактор высвобождения 1), белка, который, как известно, терминирует аппарат, поддерживающий трансляцию. Чтобы включить сайт-специфические nsAA, был использован механизм подавления янтаря, при котором 13 вхождений янтарного стоп-кодона (UAG) были переназначены синонимичным кодоном цвета охры (UAA) (rEc.E13.ΔprfA) (рис. 4). Было отмечено, что максимальная продукция составляет 0,19 ± 0,02 мг/мл растворимого sfGFP, который содержит либо один pPaF, либо п-ацетил-L-фенилаланин (pAcF) в своей последовательности (Hong et al., 2014). В другом исследовании сайт-специфическая интеграция UAA использовалась для расширения разнообразия белков и протеомного кода (Shrestha et al., 2014). Затраты на потребление были снижены на 55% за счет использования альтернативных источников энергии (таких как глюкоза). Шаблоны линейной экспрессии (LET) использовались для экспрессии и включения UAA, поскольку использование систем на основе LET снижает трудозатраты по сравнению с in vivo или производством CFPS на основе плазмид. Затраты труда сокращаются с точки зрения шагов, необходимых для производства.Для системы на основе LET требуется всего четыре этапа: ПЦР, CFPS, очистка и анализ, тогда как для in vivo и CFPS на основе плазмид требуются дополнительные этапы, включающие синтез плазмидной библиотеки, трансформацию в экспрессионный штамм (для в vivo CFPS), очистка плазмид (для CFPS на основе плазмид) и рост клеток вместе с их поддержанием ( in vivo ). С той же точки зрения UAA были включены в конкретные места с использованием системы CFPS E.coli в сочетании с аминоацил-тРНК-синтетазой и супрессорной тРНК произошли от Methanocaldococcus jannaschii , которые давали высокий титр (до 1 мг/мл) белков, несущих встроенные UAA в определенных местах (Ozawa and Loh, 2014). Впоследствии, неочищенные клеточные экстракты геномно перекодированного штамма E. coli (MCJ.559), лишенного RF1 и отключенного для пяти отрицательных генов эффекторных нуклеаз ( rna, rnb, csdA, mazF и endA ), использовали для произвести 0.55 ± 0,04 мг/мл sfGFP, содержащего pAcF, который был дополнительно увеличен до 1,3 мг/мл с использованием полунепрерывной системы (Hong et al., 2015).

Рисунок 4 . Для включения неприродных аминокислот используются тРНК, подавляющие янтарь. Штамм, имеющий RF1, будет создавать конкуренцию между янтарной супрессорной тРНК и RF1 за связывание с сайт-специфическим янтарным кодоном, который представлен на рисунке. Чтобы избежать этого конкурентного связывания, клеточный экстракт готовят с использованием штамма, в котором отсутствует RF1.Рисунок воспроизведен с разрешения Schoborg and Jewett (2018) © John Wiley and Sons, Inc.

Еще одним подходом является создание тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы для расширения генетического кода за счет включения nsAA (Martin et al., 2018). Была разработана платформа CFPS с использованием MAGE в E. coli посредством делеции RF1 (Martin et al., 2018). На этой оптимизированной платформе первоначально был получен титр sfGFP до 1,78 мг/мл, который при удлинении за счет включения 40 идентичных остатков pAcF в эластин-подобный полипептид продуцировал 0.096 мг/мл желаемого полипептида с точностью 98% (Martin et al., 2018). Эта система может быть полезна для включения других UAA для понимания новых аспектов разнообразия и функциональности белков. Кроме того, был разработан эффективный и действенный протокол для строго регулируемого добавления UAA в определенный участок белка (Gao et al., 2019). Компоненты ортогональной системы трансляции добавляли отдельно, а ортогональные тРНК добавляли косвенно (Gao et al., 2019).

Выход мембранного белка посредством бесклеточной экспрессии намного меньше по сравнению с немембранными белками (Krishnan et al., 2019). Таким образом, были предприняты усилия по увеличению выхода мембранных белков за счет бесклеточной экспрессии путем разработки протокола с использованием детергента и липидного нанодиска (рис. 5). Результаты показали, что детергенты, такие как Brij-35 и Brij-78, подходят для солюбилизации мембранного белка субъединицы S фотосистемы II (PSBS) (Krishnan et al., 2019). Одной из причин этого может быть длинная цепь полиоксиэтилен-алкиловых эфиров, присутствующая в детергентах Brij-35 и Brij-78, наряду с их гидрофильной головкой, которая способствует солюбилизации белка PSBS.Кроме того, разработанный бесклеточный протокол облегчает экспрессию белка PSBS с использованием системы непрерывного обмена при температуре 30 ° C с титром 500 нг / мкл реакционной системы. Очистке и рефолдингу белка PSBS способствовало использование детергента n-додецил-β-D-мальтозида (Krishnan et al., 2019).

Рисунок 5 . Для производства мембранных белков с помощью платформ CFPS используется несколько структур, имитирующих мембраны. (A) липидный бислой, (B) липосома, (C) мицелла, (D) бицелла, (E) нанодиск и (F) связанная двухслойная липидная мембрана.Рисунок воспроизведен с разрешения (Schoborg and Jewett, 2018) © John Wiley and Sons, Inc.

Терапия

Многочисленные исследования подчеркивают существенную функциональную эффективность рекомбинантных белков, полученных из систем CFPS. CFPS был признан жизнеспособным вариантом для производства терапевтических белков (Tran et al., 2018). С помощью бесклеточных систем с использованием Е.coli клеточные экстракты (Kim and Swartz, 2004; Yin and Swartz, 2004). Терапевтическое значение урокиназной протеазы связано с ее активностью в качестве тромболитического агента, помогающего в лечении заболеваний, связанных с тромбами. Ключевая роль протеазы урокиназы заключается в преобразовании плазминогена в плазмин, что способствует растворению тромбов (Craik et al., 2011). Точно так же варианты тканевого активатора плазминогена могут быть использованы в качестве лекарств для лечения острого ишемического инсульта (Zivin, 2009).Однако восстанавливающая активность дисульфида в лизате клеток затрудняет образование дисульфидных связей в белках. Эта проблема может быть решена путем разработки адаптированного метода, в котором клеточные экстракты при обработке йодацетамидом перед инициацией реакций синтеза белка отменяют восстанавливающую активность дисульфида, присутствующего в лизате клеток (Kim and Swartz, 2004; Yin and Swartz, 2004). Кроме того, использование очищенной дисульфидизомеразы DsbC и окислительно-восстановительного буфера глутатиона в реакционной системе позволяет образовывать активную урокиназную протеазу (0.04 мг/мл), который содержит шесть дисульфидных связей в своей конечной выраженной структуре. Кроме того, при использовании Skp (периплазматический шаперон E. coli ) и органических соединений спермидина и путресцина в реакционной системе был получен белок-активатор плазминогена тканевого типа человека с повышенной растворимостью и титром (до 0,06 мг/мл). в который было добавлено несколько других органических химикатов, чтобы сохранить более естественную среду (Yin and Swartz, 2004). Сводка терапевтических белков, которые были произведены системами CFPS, представлена ​​в таблице 2.

Таблица 2 . Список терапевтических белков, производимых с помощью CFPS.

Слитые белки гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) представляют собой мощные иммунотерапевтические вакцины против В-клеточной лимфомы (Yang et al., 2005). Для проявления правильной биологической активности этих белков как GM-CSF, так и scFv В-клеточной лимфомы идиотипа должны образовывать две разные дисульфидные связи, и конъюгация должна происходить на амино-конце GM-CSF, чтобы получить биологически функциональный продукт на конце. конец (Янг и др., 2005). В сконструированной системе CFPS для получения активных конъюгатов использовали экстракт клеток E. coli , предварительно обработанный йодоацетамидом (IAM), содержащим сульфгидрильный окислительно-восстановительный буфер, и был достигнут титр 0,043 мг/мл конъюгатов 38C13 B-лимфоцитов Id scFv ( Ян и др., 2005).

Терапевтическое значение инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) для лечения некоторых заболеваний центральной нервной системы, включая предменструальный синдром (ПМС) и синдром Ретта у детей, огромно (Costales and Kolevzon, 2016).Лизаты клеток E. coli использовали в системе CFPS для получения до 0,4 мг/мл IGF-I (Swartz, 2006). Человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (rhGM-CSF) также может действовать как терапевтический белок. Он был произведен Sutro Biopharma Inc. с использованием системы CFPS объемом 100 литров, которая является одной из крупнейших систем CFPS, используемых на сегодняшний день. Это знаменательный пример, который продемонстрировал присущий CFPS потенциал для производства терапевтических белков, и в их системе CFPS они могли производить до 0.7 мг/мл rhGM-CSF в течение 10 ч инкубации (Zawada et al., 2011). Возможные применения rhGM-CSF включают помощь в иммунотерапии рака и заживлении хронических ран (Vanitha et al., 2017; Brem et al., 2018).

CFPS является важной платформой, которая может быстро и экономично синтезировать важные с медицинской точки зрения молекулы; однако тип CFPS может повлиять на конечный результат. В этом контексте были созданы две платформы E. coli CFPS, одна из которых была основана на клеточном экстракте, а другая представляла собой универсальную бесклеточную платформу.Родовая платформа показала более высокую экспрессию терапевтических белков, фрагментов антител и вакцин с получением титров 0,71, 0,23 и 0,3 мг/мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). Позже были получены противораковые агенты hGM-CSF, hG-CSF и человеческий интерферон альфа-2b (hIFNα2b) до 0,823 ± 0,060, 0,619 ± 0,068 и 0,692 ± 0,046 мг/мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). . Также была проанализирована возможность производства ряда потенциальных вакцин с производством на основе CFPS мышиного scFv (Mvlvh) и человеческого scFv (Hvlvh), а также слитых белков бактериального белка иммунитета (im9) Im9-hvlvh, mGM-Im9- mvlvh и mGM-Im9-hvlvh, где титр 0.519 ± 0,038, 0,455 ± 0,007, 0,441 ± 0,021, 0,628 ± 0,056 и 0,591 ± 0,048 мг/мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). Кроме того, до 0,4 мг/мл консенсусного интерферона cIFN-α также было достигнуто с помощью системы CFPS лизата клеток E. coli (El-Baky et al., 2011). Потенциальное применение этого соединения связано с его способностью в качестве противоракового препарата, поскольку оно продемонстрировало противораковые эффекты во время их исследований in vitro (El-Baky et al., 2011).

Ранее для производства онконазы, препарата для лечения злокачественной мезотелиомы, живые клетки E. coli обычно подвергали лизису, после чего белок очищали от телец включения, обнаруженных в осадках клеток (Salehi et al., 2016 ). Проблема была решена с помощью нового метода, который имеет дополнительное преимущество прямой и немедленной характеристики онконаза без необходимости трудоемких стадий очистки. Метод может быть использован для получения до 0.03 мг/мл онконазы в активной форме, при этом около 80% массы приходится на растворимую онконазу (Salehi et al., 2016).

Стрептокиназа, важный фермент тромболитической терапии, была получена в концентрации до 0,5 мг/мл в течение 2,5 часов инкубации через CFPS с использованием клеточных лизатов HeLa и CHO таким образом, что полученный белок не был ни гликозилирован, ни дисульфидными связями. После первоначальной характеристики было доказано, что он функционально эффективен с точки зрения активности и результатов.Кроме того, использование технологии инертной очистки для очистки белков давало лучший выход по сравнению со стандартными технологиями аффинной хроматографии (Tran et al., 2018). 0,013 мг/мл вариабельного фрагмента одноцепочечного антитела (scFv) против О-антигена Salmonella получали с помощью CFPS с WGE (Kawasaki et al., 2003). Полученный продукт может иметь диагностическое и иммунотерапевтическое применение благодаря более короткому времени выведения из тканей и пониженной иммуногенности (Anand et al., 1991).

WGE использовался для сверхэкспрессии 124 генов из генома Plasmodium falciparum для помощи в разработке вакцины против малярии (Tsuboi et al., 2008, 2010). Из 124 генов 93 гена (74%) экспрессировались в растворимой форме. Интересно, что было обнаружено, что использование нативных кодонов в генах приводит к более высокому результату по сравнению с использованием генов с оптимизированными кодонами. Подобным образом системы CFPS использовались для экспрессии ботулинических токсинов с получением титра до 1 мг/мл (Zichel et al., 2010). Использование систем CFPS для производства ботулинической вакцины могло бы устранить проблему смещения кодонов, с которой столкнулись при производстве in vivo рекомбинантной цепи Hc ботулинического токсина при использовании E. coli и дрожжей Pichia pastoris в качестве хозяина. организмы. Кроме того, была разработана новая система CFPS на основе Saccharomyces cerevisiae для производства белков и терапевтических средств. При тестировании системе удалось получить титр до 0.007 мг/мл люциферазы светлячка в периодических реакциях. В этой системе были устранены такие факторы, как дорогие реагенты и дополнительные этапы обработки (Hodgman and Jewett, 2013).

Любой терапевтический белок, полученный из E. coli , требует обширных и дорогостоящих стадий очистки, чтобы производитель мог избежать накопления эндотоксина E. coli в конечном продукте. Наличие эндотоксина в продукте потенциально может привести к септическому шоку у пациента (Wilding et al., 2019). Система CFPS, полученная из лизата клеток ClearColi ® , может действовать как раствор для производства бесклеточно опосредованных терапевтических белков, не содержащих эндотоксинов. Клетки ClearColi ® лишены эндотоксина, который обычно обнаруживается в других клетках E. coli ; однако протокол приготовления экстракта немного отличается от другого штамма E. coli из-за его пониженной скорости роста и чувствительности к осмолярности (Wilding et al., 2019). Исследование продемонстрировало продукцию кризантаспазы из лизата клеток ClearColi ® , содержащего восстановленный E.coli эндотоксин, таким образом устраняя дорогостоящие и трудоемкие этапы его очистки от эндотоксина. Титр полученной кризантаспазы был сравним с титром экстракта штамма E. coli BL21, т. е. около 1 мг/мл. Crisantaspase — это терапевтический белок, одобренный FDA для лечения рака (Wilding et al., 2019).

Гликопротеины

обладают огромным терапевтическим потенциалом, хотя требуют обширных и дорогостоящих стадий очистки, что создает проблемы для их производства (Daniel et al., 2019). Эти белки производятся в клеточном компартменте, называемом аппаратом Гольджи, где белок подвергается серии реакций для его гликозилирования. Лишь немногие из причин низкого выхода белкового синтеза в бесклеточной системе связаны с конкурирующими реакциями и образованием нежелательных побочных продуктов (Daniel et al., 2019). Однако клетка не сталкивается с упомянутыми проблемами, поскольку она локализует конкретную реакцию в определенном месте посредством компартментализации. Обучаясь на клетках, была разработана методика Golgi-on-chip для достижения компартментализации в бесклеточной системе для специфического синтеза гликопротеинов (Daniel et al., 2019).

Вирусы и вирусоподобные частицы

Вирусы — это мелкие инфекционные агенты, неспособные к самовоспроизведению и использующие для своего размножения механизмы хозяина. Вирусы могут физически и метаболически реконструировать клетку-хозяина, чтобы создать оптимальную среду для их репликации (Chukkapalli et al., 2012). Вирусы, способные инфицировать большое количество различных типов клеток, генетически модифицированные вирусы, переносящие чужеродную ДНК, внесли большой вклад в разработку экспериментальных методов генной терапии.По сравнению с исследованиями in vivo системы CFPS на основе ДНК предоставляют инструмент для исследования сложных биологических систем с большей степенью контроля и свободы, чем другие методы (Shin et al., 2012). Для поддержки изучения сложных биологических систем Shin et al. (2012) продемонстрировали репликацию, синтез и самосборку бактериофагов T7 и ΦX174 in vitro , чтобы установить тот факт, что большие программы ДНК могут быть эффективно экспрессированы вне клетки (в их случае, в пробирке) через бесклеточные Системы TX–TL.Им удалось собрать от 0,1 до 1 миллиарда функциональных фагов с использованием 1 нМ генома (целевая ДНК). Первая партия фагов начинала синтезироваться через 1 ч инкубации, а их накопление продолжалось в течение 5 ч. Также сообщалось, что добавление dNTP увеличило продукцию фага почти в 200 раз, и дальнейшие исследования показали, что после четвертого часа инкубации геномная ДНК начала деградировать, способствуя наблюдаемой остановке синтеза. Несмотря на то, что недостаток тиоредоксина в цитозоле имеет тенденцию нарушать репликацию ДНК 90–115 in vivo 90–116, было подчеркнуто, что отсутствие тиоредоксина в этих бесклеточных системах TX–TL не препятствует продукции фагов (Shin et al., 2012).

VLP представляют собой многобелковые структуры, средний размер которых составляет 25–100 нм, способны к самосборке и могут систематически имитировать конформацию белков, обнаруженных в нативном вирусе (Roldão et al., 2010; Carlson et al., 2012). . Эти бионаноматериалы лишены генетической информации и, как таковые, не могут самовоспроизводиться, но благодаря их способности отображать вирусные поверхностные белки высокой плотности они могут успешно проникать в живую клетку. Эти частицы образуются при гетерологичной экспрессии вирусных белков одного и того же или разных вирусов в системе или спонтанно во время жизненного цикла вируса внутри клетки (Chroboczek et al., 2014). Эти пустые оболочки (без вирусного генома) могут быть использованы в качестве безопасных вакцин из-за их способности вызывать иммунный ответ и отсутствия саморепликации. Стимуляция врожденного иммунитета с помощью VLP облегчается за счет паттерн-распознающих рецепторов и толл-подобных рецепторов и индукции сильного гуморального ответа. Это дополнительно усиливается за счет лучшего поглощения, процессинга и представления антигенпрезентирующими клетками благодаря высокоспецифическим структурам и мультимерным антигенам VLP (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).Помимо вакцинации, VLP заинтересовались в областях генной терапии, доставки лекарств, нанотехнологий и диагностики (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).

При обычном производстве VLP на основе клеток они были получены in vivo и их сборка была отделена от большого пула белков ex vivo . В обычных клеточных системах сталкиваются с многочисленными трудностями, такими как низкий выход, низкая растворимость белков бактериофагов, отсутствие посттранскрипционных модификаций, сложности с экспрессией вирусных белков млекопитающих, меньшая стабильность VLP, образование дорогостоящих продуктов и трудности разделения. морфологически сходных белков-загрязнителей в разных системах-хозяевах (Pattenden et al., 2005). Соответственно, ряд исследований пытались решить эти проблемы. В исследовании Банди и соавт. (2008) построили систему CFPS на основе E. coli- для образования VLP. Было перечислено несколько преимуществ по сравнению с используемыми в настоящее время клеточными системами, включая перенаправление метаболических ресурсов в большей степени на транскрипцию и трансляцию in vitro , одноэтапную очистку, а также восстановление и устранение трудоемких процедур клеточной трансформации. Для повышения стабильности VLP Bundy and Swartz (2011) контролировали окислительно-восстановительный потенциал реакционной системы, что позволило им контролировать образование дисульфидных связей между мономерами капсида, тем самым изменяя стабильность VLP.В другом исследовании Patel и Swartz (2011) были получены ВПЧ бактериофагов Qβ и MS2, которые обладали способностью связываться с азид- и алкин-содержащими множественными белками, включая фрагмент антитела scFv и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). ) вместе, нуклеиновые кислоты и цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ). В своем эксперименте они продуцировали азидные и алкиновые аналоги метионина на поверхности ВПЧ. Белки, нуклеиновые кислоты и ПЭГ были конъюгированы на поверхности VLP посредством реакции, катализируемой Cu(I).Их система производила 0,3 мг/мл ВПЧ, которые включали до 85% аналогов метионина. Однако было обнаружено, что биологическая активность GM-CSF снижается в 3–5 раз после его комбинирования с VLP. Patel and Swartz (2011) пришли к выводу, что молекулярное скопление белка scFv на поверхности VLP и кривизна VLP препятствует доступу GM-CSF к рецепторам GM-CSF, что приводит к снижению биологической активности конъюгированного GM-CSF.

В целом, системы CFPS продемонстрировали большой потенциал для преодоления существующих в настоящее время проблем, связанных с вирусом in vivo и продукцией VLP.Необходимы дальнейшие исследования и лучшая оптимизация протоколов CFPS для повышения надежности и эффективности этого метода при рассмотрении вопроса о создании вирусов и VLP. В ближайшем будущем системы CFPS вполне могут заменить используемые в настоящее время клеточные методы в производственных масштабах, учитывая преимущества систем CFPS по сравнению с устоявшимися методами.

Биозащита на основе CFPS

Биоизоляция — это аспект биологической безопасности в отношении организмов и видов, которые могут представлять риск для здоровья человека и экологии, и конкретно включает их физическое сдерживание в безопасных зонах с целью запрета их выпуска в более широкое сообщество.Несмотря на широкое применение и большие успехи, многие современные стратегии биосдерживания могут оказаться недостаточно эффективными для решения современных задач, особенно когда речь идет о высвобождении и распространении новых трансгенов и/или трансгенных организмов (Lee et al., 2018). Соответственно, существует острая необходимость в разработке новых технологий для борьбы с рисками биозащиты, которые угрожают биобезопасности и биозащищенности, и эти технологии в конечном итоге будут способствовать резкому снижению потенциальной серьезности и опасности, представляемой генетически модифицированными организмами.Среди многих новых стратегий, которые были предложены на сегодняшний день, был предложен ряд из них, которые включают бесклеточные системы (Lee et al., 2018). Преимущество получения белков с помощью систем CFPS таким образом связано с их способностью оставаться абиотическими, лишенными большинства нормальных биотических процессов клеток, в то же время вовлекая гены и ДНК, которые будут делиться, дублироваться и мутировать. Ряд применений с этими системами уже добился успеха, включая биосинтез терапевтических средств и инкапсуляцию механизмов транскрипции/трансляции в везикулы.Во всех случаях использование систем CFPS означало, что экспериментальный процесс представлял меньший риск биобезопасности, чем с живыми системами, что часто может быть недооцененным аспектом бесклеточных систем в целом.

Кроме того, изоляция систем CFPS, основанных на ксенобиологическом происхождении, может ограничить распространение загрязнения, которое может возникнуть в результате поглощения/рассеивания трансгенных материалов, и, таким образом, обеспечить еще одну степень безопасности на уровне их биозащиты. Системы CFPS использовались для облегчения включения NCAA посредством переназначения кодонов (Hong et al., 2014), что еще больше повышает биобезопасность за счет наличия модифицированных организмов, которые переназначают использование кодонов, достаточно чуждых природным организмам, чтобы создать сильный барьер против генетического загрязнения (Lee et al., 2018). Этот вид ксенобиологического барьера биологической безопасности является преднамеренно искомой целью для области ксенобиологии или ксенонуклеиновых кислот, и преимущества от использования бесклеточных систем подчеркивают явный и сильный потенциал этих технологий для усиления стратегий биосдерживания в будущем.

Заключение и замечания на будущее

Синтетическая биология — это современная и инновационная научная дисциплина, целью которой является улучшение существующей производственной практики, решение проблем низкой урожайности и плохого соотношения затрат и продукции, а также проблемы существующей практики, которая неизбежно наносит ущерб нашим экосистемам в результате загрязнения. . В любом из этих случаев было бы благоразумно рассмотреть альтернативы, и именно в синтетической биологии были найдены новые и альтернативные способы изготовления многих продуктов с добавленной стоимостью с убедительными достижениями и всегда плодородной основой для выращивать будущие продукты и отрасли.В этом контексте мы рассмотрели и обсудили CFPS, охватив его многочисленные успехи, достигнутые на сегодняшний день, и широкий потенциал для его развития, а также некоторые необходимые необходимые шаги.

Системы

CFPS предлагают заметное научное влияние, которое может стимулировать развитие во многих областях высокопроизводительного производства, ориентируя технологию на создание ценных продуктов, включая белки, терапевтические средства и вирусы / VLP. Для улучшения методов производства белка системы CFPS продемонстрировали большую эффективность для получения высоких уровней экспрессии, чистоты и выхода, в дополнение к более легкому включению меченых аминокислот, факторов, которые позволяют лучше анализировать ЯМР белковых структур (Morita et al. ., 2003; Одзава и др., 2004 г.; Такай и др., 2008).

Относительная простота работы с системами CFPS означает, что трудоемкие и трудоемкие процессы клонирования могут быть сведены к минимуму, а это означает, что большие библиотеки функциональных белков могут быть созданы проще, чем раньше (Sawasaki et al., 2002; Liu et al. ., 2019; Rolf et al., 2019), способствуя их функциональному изучению и использованию в биочипах (He and Taussig, 2007; He et al., 2008), микрочипах (Goshima et al., 2008) и технологиях с непрерывным потоком ( Широков и др., 2002). Эти результаты показывают, что системы CFPS могут быть легко расширены и использованы для экспрессии, а также для тестирования библиотек высших белков, предназначенных для многолуночных форматов и экспериментов, что позволяет проводить очень сложные исследования и эксперименты с высокой пропускной способностью, которым помогает эта технология. быстрее, чем при меньших затратах по сравнению с текущей практикой. Соответственно, областью дальнейших исследований будет проверка полного потенциала систем CFPS и их применимости для помощи другим типам сложных и высокопроизводительных экспериментов.

Несмотря на большой прогресс в биологической области науки, многие белки по-прежнему трудно экспрессировать in vivo , что связано с их сложностью или токсичностью, а также с проблемами солюбилизации/очистки, особенно для мембранных белков. Мы обсудили ряд сложных белков, которые уже были получены с помощью систем CFPS, включая несколько эндонуклеаз рестрикции (Goodsell, 2002), белок, связывающий микротрубочки человека (Betton, 2003), и цитолетальный токсин, вызывающий растяжение (Ceelen et al., 2006), а также некоторые мембранные белки, в том числе тетрациклиновый насос TetA (Wuu and Swartz, 2008), вакцинные антигены (Welsh et al., 2012; Lu et al., 2014) и рецептор, сопряженный с G-белком (Orbán и др., 2015). Экспрессия этого ряда сложных белков очень вдохновляет, поскольку она может быть переведена на другие сложные белки. Важность, которую белковые и ферментные продукты играют в современной медицине и биологических исследованиях, нельзя недооценивать, и, соответственно, из этого следует, что одним из компонентов развития этой технологии может быть просто ее строгое применение к белкам, которые остаются слишком сложными для изучения. .CFPS может привести к новым открытиям в различных областях, которые могут произвести революцию во многих медицинских методах лечения, а также в биомедицинских исследованиях рака, вирусных инфекций (через человеческие рецепторы) и устойчивости к антибиотикам, среди многих других.

Используемые в настоящее время клеточные лизаты получены из E. coli , зародышей пшеницы, ретикулоцитов кролика и клеток насекомых (Kigawa et al., 2004; Liu et al., 2005; Schwarz et al., 2007) с промышленными системами. PURE также используется (Shimizu et al., 2001; Курума и Уэда, 2015). Было бы очень интересно использовать другие источники бесклеточных материалов и субстратов, особенно для решения одной из проблем в системах CFPS, которая касается посттрансляционных модификаций продуктов. Эти модификации включают гликозилирование, образование дисульфидных связей и правильную укладку белка. Соответственно, дальнейшее развитие систем CFPS будет включать в себя тестирование и анализ новых клеточных лизатов с целью определения лучших из них для всех возможных желаемых модификаций, проект, который в конечном итоге может превратиться в форму in silico , как и во многих других синтезах белков и платформы для помощи в проектировании.

В настоящее время бесклеточные системы используются для экономически эффективного обнаружения штаммов вирусов Эбола, Зика и денге (Pardee et al., 2014, 2016; Gootenberg et al., 2017; Khambhati et al., 2019b), болезней которые часто затрагивают более бедные районы мира со сложными проблемами доступности. Изобретение более дешевых и портативных тестов, в которых используются бесклеточные системы, может произвести революцию в методах выявления и лечения этих смертельных заболеваний, снизив их нагрузку на здоровье человека.Мы считаем, что в будущем CFPS сможет более жестко бороться с этими заболеваниями, поскольку ущерб, который они наносят людям и сообществам, слишком велик. Осуществив эти мощные методы выявления этих заболеваний, мы оценили потенциал их адаптации к новым вирусным вспышкам в будущем, чтобы помочь в более эффективном ведении болезней, чем раньше. Это также должно быть расширено для других болезней мира, которые по-прежнему трудно диагностировать и лечить, где это когда-либо уместно.

В других областях системы CFPS использовались в широком диапазоне экспериментов, включая производство белков, включающих токсичные аминокислоты, такие как канаванин (Worst et al., 2015), интеграцию ортогональных генетических кодов (Chemla et al., 2015; Des Soye et al., 2015), производство терапевтических препаратов (Zawada et al., 2011), сборка бактериофагов (Shin et al., 2012) и многие другие. Многие из этих экспериментов дают четкое указание на будущую работу, которую необходимо выполнить для систем CFPS.С одной стороны, бесклеточные системы TX-TL позволили включить L-канаванин и L-гидроксилизин в белки, открыв дверь для будущих исследований этих и других замен аминокислот. Преимущество здесь в том, что с расширением основного языка белков они теперь способны обладать новыми функциями, которые в противном случае были бы токсичны для живых клеток, открывая совершенно новый мир для модифицированных функций белков и ферментов, которые раньше не рассматривались. Бесклеточная генерация cIFN-α с хорошими выходами является еще одним захватывающим результатом, который также требует дальнейшей разработки, чтобы подтвердить его потенциал в качестве нового противоракового лечения, выходящего за рамки его текущего мастерства in vitro (El-Baky et al. др., 2011).

Существует потребность в большем количестве и более качественных лекарств против бесчисленных форм рака, и этот результат демонстрирует, что системы CFPS могут быть хорошо адаптированы для их синтеза или для улучшения существующих методов. Родственным результатом, который следует изучить в дальнейшем, является бесклеточный синтез вирусов/VLP. Вирусы и VLP могут использоваться для разработки экспериментальных методов генной терапии, доставки лекарств, диагностических инструментов и приложений нанотехнологий (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).Системы CFPS продемонстрировали исключительную способность генерировать вирусы/VLP, превосходя примерно методов in vivo , и важность и потенциал этих видов таковы, что вполне вероятно, что бесклеточные системы могут заменить клеточные методы с будущей целью. области, чтобы распространить этот прогресс на масштабы промышленного производства (Bundy et al., 2008; Patel and Swartz, 2011).

Во всех этих аспектах использование систем CFPS позволило биологам продвинуться вперед в каждой из этих отдельных областей, обнаруживая новые результаты и открытия.В целом, мы считаем, что этот ряд исследований, в которых были использованы бесклеточные экспрессионные системы, предлагает очень многообещающую веру в то, что эти системы могут быть повторно использованы во многих других научных исследованиях, предлагая преимущества, которые позволяют проводить бесчисленное множество других интересных и убедительных экспериментов. , быстрее и с меньшими затратами, аналогично тем, о которых мы говорили. Даже в самых незначительных случаях, если использование этих систем может сэкономить деньги и время, это вполне может открыть дверь для снижения барьеров, позволяющих войти многим ученым и их проектам, предлагая большее разнообразие идей и экспериментов.Наконец, мы считаем, что системы CFPS, которые мы обсуждали, уже добились многочисленных успехов, и с нынешними темпами развития современной науки и синтетической биологии ясно, что должны последовать новые разработки и инновации. Мы должны экстраполировать эти успехи на решение многих существующих мировых проблем новыми, более безопасными, эффективными и экологичными способами, чтобы принести пользу здоровью планеты и, в конечном итоге, избавиться от нашей зависимости от невозобновляемых и загрязняющих окружающую среду источников ценных продуктов и энергии.

Вклад авторов

KK, GB, NG, DB и VS разработали и написали рукопись. ВКонтакте и ДБ провели корректуру и дали замечания и предложения. VS контролировал и завершил рукопись.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

GB и NG выражают благодарность Образовательному фонду Пури в Индии за предоставление стипендии для младших исследователей для выполнения этой работы.

Сокращения

АТФ, аденозинтрифосфат; CFPS, бесклеточный синтез белка; CHO, яичник китайского хомячка; GM-CSF, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; IRES, внутренние сайты входа в рибосомы; LETs, шаблон линейного выражения; MAGE, мультиплексная автоматизированная инженерия генома; ncAAs, неканонические аминокислоты; ЯМР, ядерный магнитный резонанс; nsAAs, нестандартные аминокислоты; pAcF, п-ацетил-L-фенилаланин; ПЭГ, полиэтиленгликоль; ФЕП, фосфоенолпируват; PISA, массив белков in situ; pPaF, п-пропаргилокси-L-фенилаланин; PSBS, субъединица S фотосистемы II; PURE, очищенные рекомбинантные элементы; RF1, фактор высвобождения 1; scFv, вариабельный фрагмент одноцепочечного антитела; sfGFP, зеленый флуоресцентный белок суперпапки; TX–TL, транскрипция–трансляция; UAA, ненатуральные аминокислоты; доллар США, доллар США; ВПЧ, вирусоподобные частицы; WGE, экстракт зародышей пшеницы; YCE, Экстракты клеток дрожжей; IGF-I, инсулиноподобный фактор роста-I.

Каталожные номера

Албайрак, К., и Шварц, Дж. Р. (2013). Бесклеточное совместное производство ортогональной транспортной РНК активирует эффективное сайт-специфическое включение неприродных аминокислот. Рез. нуклеиновых кислот. 41, 5949–5963. doi: 10.1093/nar/gkt226

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Альпер Х., Фишер К., Невойгт Э. и Стефанопулос Г. (2005). Настройка генетического контроля с помощью промоутерной инженерии. Проц. Натл.акад. науч. США 102, 12678–12683. doi: 10.1073/pnas.0504604102

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ананд Н. Н., Мандал С., Маккензи С. Р., Садовска Дж., Сигуршельд Б., Янг Н. М. и соавт. (1991). Бактериальная экспрессия и секреция различных одноцепочечных генов Fv , кодирующих белки, специфичные для O-антигена Salmonella серотипа B. Дж. Биол. хим. 266, 21874–21879.

Реферат PubMed | Академия Google

Аткинсон, М.Р., Саважо, М.А., Майерс, Дж.Т., и Нинфа, А.Дж. (2003). Развитие генетической схемы, демонстрирующей тумблер или колебательное поведение у Escherichia coli . Сотовый 113, 597–607. doi: 10.1016/S0092-8674(03)00346-5

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Brem, H., Howell, R., Criscitelli, T., Senderowicz, A., Siegart, N., Gorenstein, S., et al. (2018). Практическое применение гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) у больных с ранами. Хирург. Технол. Междунар. 32, 61–66. Получено с: http://surgicaltechnology.com/32-Wound-Healing.htm#977

Реферат PubMed | Академия Google

Бюхнер, Э. (1897 г.). Alkoholische gährung ohne hefezellen. Бер. Дт. Химия. Гэс. 30, 117–124. doi: 10.1002/cber.18970300121

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Банди, Б. К., Францишкович, М. Дж., и Шварц, Дж. Р. (2008). Escherichia coli на основе бесклеточного синтеза вирусоподобных частиц. Биотехнология. биоинж. 100, 28–37. дои: 10.1002/бит.21716

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Карлсон, Э. Д., Ган, Р., Ходжман, К. Э., и Джуэтт, М. К. (2012). Бесклеточный синтез белка: приложения достигают совершеннолетия. Биотехнология. Доп. 30, 1185–1194. doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.09.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Селен, Л. М., Декостер, А., Дукатель, Р., и Хазебрук, Ф.(2006). Цитолетальный токсин вызывает гибель клеток, создавая узкое место в клеточном цикле. Микробиолог. Рез. 161, 109–120. doi: 10.1016/j.micres.2005.04.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чемла Ю., Озер Э., Шлезингер О., Нуаро В. и Альфонта Л. (2015). Генетически расширенный бесклеточный синтез белка с использованием эндогенной пирролизильной ортогональной системы трансляции. Биотехнология. биоинж. 112, 1663–1672. дои: 10.1002/бит.25587

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен, Ю.Ю., Дженсен, М.К., и Смольке, К.Д. (2010). Генетический контроль пролиферации Т-клеток млекопитающих с помощью синтетических регуляторных систем РНК. Проц. Натл. акад. науч. США 107, 8531–8536. doi: 10.1073/pnas.1001721107

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Конг Л., Ран Ф. А., Кокс Д., Лин С., Барретто Р., Хабиб Н. и соавт. (2013). Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas. Наука 339, 819–823. doi: 10.1126/science.1231143

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Косталес, Дж., и Колевзон, А. (2016). Терапевтический потенциал инсулиноподобного фактора роста-1 при заболеваниях центральной нервной системы. Неврологи. Биоповедение. Ред. 63, 207–222. doi: 10.1016/j.neubiorev.2016.01.001

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Culler, S.J., Hoff, K.G., and Smolke, C.Д. (2010). Перепрограммирование клеточного поведения с помощью РНК-контроллеров, реагирующих на эндогенные белки. Наука 330, 1251–1255. doi: 10.1126/science.11

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Daniel, S., Aquino, A., DeLisa, M., Jaroentomeechai, T., Liu, H.Y., Manzer, Z., et al. (2019). Golgi-on-a-chip для бесклеточного бионанопроизводства белковых терапевтических средств. Биофиз. Дж. 116:1а. doi: 10.1016/j.bpj.2018.11.025

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Дес Сой, Б.Дж. Д., Дэвидсон С. Р., Вайншток М. Т., Гибсон Д. Г. и Джуэтт М. К. (2018). Создание высокопродуктивной платформы бесклеточного синтеза белка, полученной из Vibrio natriegens . Синтезатор ACS. биол. 7, 2245–2255. doi: 10.1021/acssynbio.8b00252

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Des Soye, BJD, Patel, JR, Isaacs, FJ, and Jewett, M.C. (2015). Перепрофилирование аппарата перевода для синтетической биологии. Курс.мнение хим. биол. 28, 83–90. doi: 10.1016/j.cbpa.2015.06.008

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

ДиКарло, Дж. Э., Норвилл, Дж. Э., Мали, П., Риос, X., Аах, Дж., и Черч, Г. М. (2013). Геномная инженерия Saccharomyces cerevisiae с использованием систем CRISPR-Cas. Рез. нуклеиновых кислот. 41, 4336–4343. doi: 10.1093/nar/gkt135

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эль-Баки, Н. А., Омар, С. Х., и Редван, Э.М. (2011). Противораковая активность консенсусного интерферона-альфа человека, синтезированного в бесклеточной системе. Protein Expr. Очист. 80, 61–67. doi: 10.1016/j.pep.2011.07.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гибсон, Д.Г., Гласс, Дж.И., Лартиг, С., Носков, В.Н., Чуанг, Р.Ю., Алгир, М.А., и соавт. (2010). Создание бактериальной клетки, контролируемой химически синтезированным геномом. Наука 329, 52–56. doi: 10.1126/наука.11

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гибсон, Д. Г., Янг, Л., Чуанг, Р. Ю., Вентер, Дж. К., Хатчисон, К. А., и Смит, Х. О. (2009). Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен тысяч оснований. Нац. Методы 6, 343–345. doi: 10.1038/nmeth.1318

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Геринг А.В., Ли Дж., МакКлюр Р.А., Томсон Р.Дж., Джуэтт М.С. и Келлехер Н.Л. (2016). In vitro Реконструкция биосинтеза нерибосомных пептидов непосредственно из ДНК с использованием бесклеточного синтеза белка. Синтезатор ACS. биол. 6, 39–44. doi: 10.1021/acssynbio.6b00160

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гёрке, А. Р., и Шварц, Дж. Р. (2008). Разработка платформ бесклеточного синтеза белков для белков, связанных дисульфидными связями. Биотехнология. биоинж. 99, 351–367. дои: 10.1002/бит.21567

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гутенберг, Дж.С., Абудайе О.О., Ли Дж.В., Эсслетцбихлер П., Дай А.Дж., Йонг Дж. и др. (2017). Обнаружение нуклеиновой кислоты с помощью CRISPR-Cas13a/C2c2. Наука 356, 438–442. doi: 10.1126/science.aam9321

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гошима Н., Кавамура Ю., Фукумото А., Миура А., Хонма Р., Сатох Р. и др. (2008). Фабрика белков человека для преобразования транскриптома в протеом , экспрессируемый in vitro . Нац. Методы 5, 1011–1017.doi: 10.1038/nmeth.1273

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хисано Ю., Сакума Т., Накаде С., Ога Р., Ота С., Окамото Х. и др. (2015). Точная внутрирамочная интеграция экзогенной ДНК, опосредованная системой CRISPR/Cas9 у рыбок данио. науч. Респ. 5:8841. дои: 10.1038/srep08841

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ходжман, К.Э., и Джуэтт, М.К. (2013). Оптимизированные методы приготовления экстракта и условия реакции для улучшения синтеза белка вне клеток дрожжей. Биотехнология. биоинж. 110, 2643–2654. дои: 10.1002/бит.24942

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hong, S.H., Kwon, Y.C., Martin, R.W., Des Soye, B.J., de Paz, A.M., Swonger, K.N., et al. (2015). Улучшение бесклеточного синтеза белка с помощью геномной инженерии Escherichia coli , лишенного фактора высвобождения 1. Chembiochem 16, 844–853. doi: 10.1002/cbic.201402708

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хонг, С.Х., Нтай И., Хаймович А.Д., Келлехер Н.Л., Айзекс Ф.Дж. и Джуэтт М.К. (2014). Бесклеточный синтез белка из Escherichia coli с дефицитом фактора высвобождения 1 активирует эффективное и множественное сайт-специфическое включение нестандартных аминокислот. Синтезатор ACS. биол. 3, 398–409. дои: 10.1021/sb400140t

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хатчисон, К.А., Чуанг, Р.Ю., Носков, В.Н., Асад-Гарсия, Н., Диринк, Э., Иллисман, М.Х. и др. (2016). Дизайн и синтез минимального бактериального генома. Наука 351:aad6253. doi: 10.1126/science.aad6253

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hwang, W.Y., Fu, Y., Reyon, D., Maeder, M.L., Tsai, S.Q., Sander, J.D., et al. (2013). Эффективное редактирование генома у рыбок данио с использованием системы CRISPR-Cas. Нац. Биотехнолог. 31, 227–229. doi: 10.1038/nbt.2501

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Айзекс, Ф.J., Carr, P.A., Wang, H.H., Lajoie, M.J., Sterling, B., Kraal, L., et al. (2011). Точные манипуляции с хромосомами in vivo обеспечивают замену кодонов по всему геному. Наука 333, 348–353. doi: 10.1126/science.1205822

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Айзекс, Ф.Дж., Дуайер, Д.Дж., Динг, К., Первоучин, Д.Д., Кантор, Ч.Р., и Коллинз, Дж.Дж. (2004). Сконструированные риборегуляторы обеспечивают посттранскрипционный контроль экспрессии генов. Нац. Биотехнолог. 22, 841–847. дои: 10.1038/nbt986

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Jakočiunas, T., Bonde, I., Herrgård, M., Harrison, S.J., Kristensen, M., Pedersen, L.E., et al. (2015). Мультиплексная инженерия метаболических путей с использованием CRISPR/Cas9 в Saccharomyces cerevisiae . Метаб. англ. 28, 213–222. doi: 10.1016/j.ymben.2015.01.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джуэтт, М.C. и Шварц, Дж. Р. (2004). Имитация цитоплазматической среды Escherichia coli активирует долгоживущий и эффективный бесклеточный синтез белка. Биотехнология. биоинж. 86, 19–26. дои: 10.1002/бит.20026

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цзян, Л., Чжао, Дж., Лиан, Дж., и Сюй, З. (2018). Бесклеточный синтез белка позволил быстро создать прототип для метаболической инженерии и синтетической биологии. Синтез. Сист. Биотехнолог. 3, 90–96. doi: 10.1016/j.synbio.2018.02.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф. и Марраффини Л. А. (2013). Редактирование бактериальных геномов под контролем РНК с использованием систем CRISPR-Cas. Нац. Биотехнолог. 31, 233–239. doi: 10.1038/nbt.2508

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джин, X., и Хонг, С. Х. (2018). Бесклеточный синтез белка для производства «трудно экспрессируемых» белков. Биохим. англ. J. 138, 156–164. doi: 10.1016/j.bej.2018.07.013

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Кавасаки Т., Гауда М.Д., Савасаки Т., Такай К. и Эндо Ю. (2003). Эффективный синтез белка, содержащего дисульфид, в периодической бесклеточной системе из зародышей пшеницы. евро. Дж. Биохим. 270, 4780–4786. doi: 10.1046/j.1432-1033.2003.03880.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Кеммер, К., Флури, Д. А., Витчи, У., Пассероб, А., Гуцвиллер, А., и Фуссенеггер, М. (2011). Сеть дизайнеров, координирующая искусственное осеменение крупного рогатого скота путем высвобождения имплантированных сперматозоидов, запускаемого овуляцией. J. Выпуск управления 150, 23–29. doi: 10.1016/j.jconrel.2010.11.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хамбхати К., Гохил Н., Бхаттачарджи Г., Панчасара Х. и Сингх В. (2019a). Уравнение для биоимитации скопления макромолекул с использованием штамма Escherichia coli MG1655. Биофиз. хим. 254, 106244. doi: 10.1016/j.bpc.2019.106244

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кигава Т., Ябуки Т., Мацуда Н., Мацуда Т., Накадзима Р., Танака А. и др. (2004). Приготовление экстракта клеток Escherichia coli для высокопродуктивной бесклеточной экспрессии белка. Дж. Структура. Функц. Геномика 5, 63–68. doi: 10.1023/B:JSFG.0000029204.57846.7d

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ким, Д.М. и Шварц, Дж. Р. (1999). Продление бесклеточного синтеза белка с помощью новой системы регенерации АТФ. Биотехнология. биоинж. 66, 180–188.

Реферат PubMed | Академия Google

Ким Д.М. и Шварц Дж.Р. (2001). Регенерация аденозинтрифосфата из промежуточных продуктов гликолиза для бесклеточного синтеза белка. Биотехнология. биоинж. 74, 309–316. дои: 10.1002/бит.1121

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ким, Д.М. и Шварц, Дж. Р. (2004). Эффективное производство биоактивного белка с множественными дисульфидными связями с использованием модифицированных экстрактов Escherichia coli . Биотехнология. биоинж. 85, 122–129. дои: 10.1002/бит.10865

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Kim, H., Han, H., Ahn, J., Lee, J., Cho, N., Jang, H., et al. (2012). Синтез ДНК дробовика для высокопроизводительного конструирования больших молекул ДНК. Рез. нуклеиновых кислот .40:е140. doi: 10.1093/nar/gks546

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ким, Т.В., Кеум, Дж.В., О, И.С., Чой, К.Ю., Ким, Х.К., и Ким, Д.М. (2007). Экономичная и высокопроизводительная система бесклеточного синтеза белка, использующая фруктозо-1,6-бисфосфат в качестве источника энергии. Дж. Биотехнология. 130, 389–393. doi: 10.1016/j.jbiotec.2007.05.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кох, М., Фаулон, Дж. Л., и Борковски, О. (2018). Модели для бесклеточной синтетической биологии: сделать прототипирование проще, лучше и быстрее. Перед. биоинж. Биотехнолог. 6:182. doi: 10.3389/fbioe.2018.00182

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Косури С., Ерошенко Н., Лепруст Э. М., Супер М., Уэй Дж., Ли Дж. Б. и соавт. (2010). Масштабируемый синтез генов путем селективной амплификации пулов ДНК из высокоточных микрочипов. Нац. Биотехнолог. 28, 1295–1299.doi: 10.1038/nbt.1716

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кришнан, М., де Леу, Т.Дж.Дж.Ф., и Пандит, А. (2019). Бесклеточная растворимая экспрессия мембранного белка PsbS. Protein Expression Purif. 159, 17–20. doi: 10.1016/j.pep.2019.02.010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лажуа, М.Дж., Ровнер, А.Дж., Гудман, Д.Б., Эрни, Х.Р., Хаймович, А.Д., Кузнецов, Г., и соавт. (2013).Геномно перекодированные организмы расширяют биологические функции. Наука 342, 357–360. doi: 10.1126/science.1241459

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Дж. В., Чан, С. Т. Ю., Сломович, С., и Коллинз, Дж. Дж. (2018). Системы биологической защиты нового поколения для искусственных организмов. Нац. хим. биол. 14, 530–537. doi: 10.1038/s41589-018-0056-x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Левин, М.З., Грегорио, Н. Э., Джуэтт, М. К., Уоттс, К. Р., и Оза, Дж. П. (2019). Бесклеточный синтез белка на основе Escherichia coli : протоколы для надежной, гибкой и доступной платформенной технологии. Дж. Вис. Эксп. 144:58882. дои: 10.3791/58882

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Лю Д.В., Завада Дж.Ф. и Шварц Дж.Р. (2005). Оптимизация подготовки экстракта Escherichia coli S30 для экономичного бесклеточного синтеза белка. Биотехнология.прог. 21, 460–465. дои: 10.1021/bp049789y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, В. К., Чжан, Л., Чен, М., и Ли, Дж. (2019). Бесклеточный синтез белка: последние достижения в области источников бактериальных экстрактов и расширенные области применения. Биохим. англ. J. 141, 182–189. doi: 10.1016/j.bej.2018.10.023

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ло Гулло Г., Маттоссович Р., Перуджино Г., Ла Теана А., Лондей П.и Бенелли, Д. (2019). Оптимизация системы транскрипции/трансляции in vitro на основе лизата клеток sulfolobussolfataricus. Археи 2019:9848253. дои: 10.1155/2019/9848253

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лу, Ю., Уэлш, Дж. П., и Шварц, Дж. Р. (2014). Получение и стабилизация тримерного стволового домена гемагглютинина гриппа для потенциально широко защитной вакцины против гриппа. Проц. Натл. акад.науч. США 111, 125–130. doi: 10.1073/pnas.1308701110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лутц Р. и Бужар Х. (1997). Независимая и жесткая регуляция единиц транскрипции в Escherichia coli посредством регуляторных элементов LacR/O, TetR/O и AraC/I1-I2. Рез. нуклеиновых кислот. 25, 1203–1210. doi: 10.1093/нар/25.6.1203

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мали, П., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., et al. (2013). Инженерия генома человека с помощью РНК с помощью Cas9. Наука 339, 823–826. doi: 10.1126/science.1232033

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Martin, R.W., Des Soye, B.J., Kwon, Y.C., Kay, J., Davis, R.G., Thomas, P.M., et al. (2018). Бесклеточный синтез белка из геномно перекодированных бактерий позволяет включать мультисайтовые включения неканонических аминокислот. Нац.коммун. 9:1203. doi: 10.1038/s41467-018-03469-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маттеи, Дж. Х., Джонс, О. В., Мартин, Р. Г., и Ниренберг, М. В. (1962). Характеристики и состав кодирующих единиц РНК. Проц. Натл. акад. науч. США 48, 666–677. doi: 10.1073/pnas.48.4.666

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мерк, Х., Рюс, Р. Б., Глесс, К., Бейер, К., Донг, Ф., Дётш, В., и другие. (2015). Биосинтез мембранозависимых белков в лизатах клеток насекомых: определение ограничивающих параметров для фолдинга и процессинга. биол. хим. 396, 1097–1107. doi: 10.1515/hsz-2015-0105

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Минтон, А. П. (2001). Влияние скопления макромолекул и удержания макромолекул на биохимические реакции в физиологических средах. Дж. Биол. хим. 276, 10577–10580. doi: 10.1074/jbc.Р100005200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мун, Т.С., Лу, К., Тамсир, А., Стэнтон, Б.К., и Фойгт, К.А. (2012). Генетические программы, построенные из многоуровневых логических вентилей в одиночных ячейках. Природа 491, 249–253. doi: 10.1038/nature11516

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мур, С.Дж., Макдональд, Дж.Т., и Фримонт, П.С. (2017). Бесклеточная синтетическая биология для разработки прототипов in vitro . Биохим. соц. Транс. 45, 785–791. дои: 10.1042/BST20170011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Морита, Э. Х., Савасаки, Т., Танака, Р., Эндо, Ю., и Коно, Т. (2003). Бесклеточная система зародышей пшеницы — это новый способ скрининга фолдинга и функционирования белков. Науки о белках. 12, 1216–1221. doi: 10.1110/ps.0241203

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

На, Д., Ю, С. М., Чанг, Х., Пак, Х., Парк, Дж. Х., и Ли, С. Ю. (2013). Метаболическая инженерия Escherichia coli с использованием синтетических малых регуляторных РНК. Нац. Биотехнолог. 31, 170–174. doi: 10.1038/nbt.2461

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ниренберг, М. В., и Маттеи, Дж. Х. (1961). Зависимость синтеза внеклеточного белка в 90–115 E. coli от встречающихся в природе или синтетических полирибонуклеотидов 90–116 . Проц. Натл. акад. науч. США 47, 1588–1602.doi: 10.1073/pnas.47.10.1588

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Орбан Э., Провербио Д., Хабершток С., Дётч В. и Бернхард Ф. (2015). Бесклеточная экспрессия рецепторов, связанных с G-белком. Методы Мол. биол. 2015, 171–195. дои: 10.1007/978-1-4939-2230-7_10

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Одзава, К., Хедлам, М.Дж., Шеффер, П.М., Хендерсон, Б.Р., Диксон, Н.Е., и Оттинг, Г. (2004). Оптимизация системы Escherichia coli для бесклеточного синтеза селективно меченных 15N белков для экспресс-анализа с помощью ЯМР-спектроскопии. евро. Дж. Биохим. 271, 4084–4093. doi: 10.1111/j.1432-1033.2004.04346.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Одзава, К., и Лох, К.Т. (2014). Сайт-специфическое включение неприродных аминокислот в белки путем бесклеточного синтеза белка. Методы Мол. биол. 1118, 189–203. дои: 10.1007/978-1-62703-782-2_12

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Парди К., Грин А. А., Ферранте Т., Кэмерон Д.Э., Далей Кейсер А., Инь П. и др. (2014). Синтетические генные сети на бумажной основе. сотовый 159, 940–954. doi: 10.1016/j.cell.2014.10.004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Pardee, K., Green, A.A., Takahashi, M.K., Braff, D., Lambert, G., Lee, J.W., et al. (2016). Быстрое и недорогое обнаружение вируса Зика с помощью программируемых биомолекулярных компонентов. Сотовый 165, 1255–1266. doi: 10.1016/j.cell.2016.04.059

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Патель, К.Г. и Шварц, Дж. Р. (2011). Функционализация поверхности вирусоподобных частиц путем прямой конъюгации с использованием азидно-алкиновой клик-химии. Биоконъюг. хим. 22, 376–387. дои: 10.1021/bc100367u

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Патель С., Панчасара Х., Брэддик Д., Гохил Н. и Сингх В. (2018). Синтетические малые РНК: текущее состояние, проблемы и возможности. Дж. Сотовый. Биохим. 119, 9619–9639. doi: 10.1002/jcb.27252

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Паттенден, Л.К., Мидделберг А.П., Ниберт М. и Липин Д.И. (2005). К препаративному и крупномасштабному прецизионному производству вирусоподобных частиц. Тенденции биотехнологии. 23, 523–529. doi: 10.1016/j.tibtech.2005.07.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пфлегер Б.Ф., Питера Д.Дж., Смольке К.Д. и Кислинг Д.Д. (2006). Комбинаторная инженерия межгенных областей в оперонах настраивает экспрессию нескольких генов. Нац. Биотехнолог. 24, 1027–1032. дои: 10.1038/nbt1226

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Порт, Ф., Чен, Х.М., Ли, Т., и Буллок, С.Л. (2014). Оптимизированные инструменты CRISPR/Cas для эффективной инженерии зародышевой линии и соматического генома у Drosophila . Проц. Натл. акад. науч. США 111, E2967–E2976. doi: 10.1073/pnas.1405500111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кваст, Р. Б., Соннабенд, А., Стеч, М., Вюстенхаген, Д. А., и Кубик, С. (2016). Высокопроизводительный бесклеточный синтез человеческого EGFR с помощью IRES-опосредованной трансляции белка в формате бесклеточной реакции непрерывного обмена. науч. Респ. 6:30399. дои: 10.1038/srep30399

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рен, С., Ян, З., Сюй, Дж., Сунь, Дж., Мао, Д., Ху, Ю., и др. (2014). Повышенная специфичность и эффективность системы CRISPR/Cas9 с оптимизированными параметрами sgRNA у Drosophila . Cell Rep. 9, 1151–1162. doi: 10.1016/j.celrep.2014.09.044

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рольдао, А., Мельядо, М.К.М., Кастильо, Л.Р., Каррондо, М.Дж., и Алвес, П.М. (2010). Вирусоподобные частицы в разработке вакцин. Expert Rev. Вакцины 9, 1149–1176. doi: 10.1586/erv.10.115

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рольф, Дж., Розенталь, К., и Лютц, С. (2019). Применение бесклеточного синтеза белка для более быстрой разработки биокатализаторов. Катализаторы 9:190. doi: 10.3390/catal90

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ровнер, А.Дж., Хаймович, А.Д., Кац, С.Р., Ли, З., Гроум, М.В., Гассавей, Б.М., и соавт. (2015). Перекодированные организмы, сконструированные так, чтобы они зависели от синтетических аминокислот. Природа 518, 89–93. doi: 10.1038/nature14095

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рустад М., Истлунд А., Маршалл Р., Джардин П. и Нуаро В.(2017). Синтез инфекционных бактериофагов в системе бесклеточной экспрессии на основе E. coli . Дж. Вис. Опыт . 17:126. дои: 10.3791/56144

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Салехи, А.С., Смит, М.Т., Беннетт, А.М., Уильямс, Дж.Б., Питт, В.Г., и Банди, Британская Колумбия (2016). Бесклеточный белковый синтез цитотоксического противоракового препарата: производство онконазы и бесклеточная система с простым добавлением воды. Биотехнология. J. 11, 274–281. дои: 10.1002/биот.201500237

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Салис, Х.М., Мирский, Э.А., и Фойгт, К.А. (2009). Автоматизированный дизайн сайтов связывания синтетических рибосом для контроля экспрессии белка. Нац. Биотехнолог. 27, 946–950. doi: 10.1038/nbt.1568

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Савасаки Т., Огасавара Т., Моришита Р. и Эндо Ю. (2002). Система бесклеточного синтеза белка для высокопроизводительной протеомики. Проц. Натл. акад. науч. США 99, 14652–14657. doi: 10.1073/pnas.232580399

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шоборг, Дж. А., и Джуэтт, М. К. (2018). «Бесклеточный синтез белка: новая технология для понимания, использования и расширения возможностей биологических систем», в Синтетическая биология: части, устройства и приложения , под ред. С. Смольке, С.Ю. Ли, Дж. Нильсен и Г. Стефанопулос (Вайнхайм: John Wiley and Sons, Inc.), 309–330. дои: 10.1002/9783527688104.ch25

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Schwarz, D., Junge, F., Durst, F., Frölich, N., Schneider, B., Reckel, S., et al. (2007). Препаративная масштабная экспрессия мембранных белков в Escherichia coli на основе бесклеточных систем непрерывного обмена. Нац. протокол 2, 2945–2957. doi: 10.1038/nprot.2007.426

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Симидзу Ю., Иноуэ А., Томари Ю., Судзуки Т., Йокогава Т., Нисикава К. и др. (2001). Бесклеточная трансляция, восстановленная очищенными компонентами. Нац. Биотехнолог. 19, 751–755. дои: 10.1038/

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шин, Дж., Джардин, П., и Нуаро, В. (2012). Репликация генома, синтез и сборка бактериофага Т7 в одной бесклеточной реакции. Синтезатор ACS. биол. 1, 408–413. doi: 10.1021/sb300049p

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шин, Дж.и Нуаро, В. (2012). Набор инструментов для бесклеточной экспрессии E. coli : применение к схемам синтетических генов и искусственным клеткам. Синтезатор ACS. Биол . 1, 29–41. дои: 10.1021/sb200016s

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ширбагаи З. и Болхассани А. (2016). Различные применения вирусоподобных частиц в биологии и медицине: системы вакцинации и доставки. Биополимеры 105, 113–132. дои: 10.1002/бип.22759

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Широков В.А., Симоненко П.Н., Бирюков С.В., Спирин А.С. (2002). «Бесклеточные системы трансляции с непрерывным потоком и с непрерывным обменом и реакторы», в Cell-Free Translation Systems , под ред. А. С. Спирина (Берлин: Springer Nature), 91–107. дои: 10.1007/978-3-642-59379-6_8

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Шис, Д.Л., и Беннетт, М.Р. (2013). Библиотека синтетических транскрипционных логических элементов AND, созданная с использованием расщепленных мутантов РНК-полимеразы T7. Проц. Натл. акад.науч. США 110, 5028–5033. doi: 10.1073/pnas.1220157110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шреста, П., Смит, М.Т., и Банди, Британская Колумбия (2014). Бесклеточное включение неестественных аминокислот с альтернативными энергетическими системами и матрицами линейной экспрессии. Н. Биотехнолог. 31, 28–34. doi: 10.1016/j.nbt.2013.09.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сингх В., Гохил Н., Рамирес Гарсия Р., Брэддик Д. и Фофие С.К. (2018). Последние достижения в технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для биологических и биомедицинских исследований. Дж. Сотовый. Биохим. 119, 81–94. doi: 10.1002/jcb.26165

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сома Ю., Цуруно К., Вада М., Йокота А. и Ханаи Т. (2014). Перенаправление метаболического потока с центрального метаболического пути на синтетический с помощью метаболического тумблера. Метаб. англ. 23, 175–184. doi: 10.1016/j.ymben.2014.02.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сова, С.В., Балдеа, М., и Контрерас, Л.М. (2014). Оптимизация производства метаболитов с использованием периодических колебаний. Вычисление PLoS. биол. 10:e1003658. doi: 10.1371/journal.pcbi.1003658

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Стрикер, Дж., Куксон, С., Беннетт, М. Р., Мазер, У. Х., Цимринг, Л. С., и Хасти, Дж.(2008). Быстрый, надежный и настраиваемый синтетический генератор генов. Природа 456, 516–519. doi: 10.1038/nature07389

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сан, З.З., Хейс, К.А., Шин, Дж., Кашера, Ф., Мюррей, Р.М., и Нуаро, В. (2013). Протоколы для внедрения системы бесклеточной экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии. Дж. Вис. Эксп. 79:e50762. дои: 10.3791/50762

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Такахаши, М.К., Чаппелл Дж., Хейс С.А., Сан З.З., Ким Дж., Сингхал В. и др. (2015а). Быстрое определение быстрой динамики генетической схемы РНК с помощью бесклеточных систем транскрипции-трансляции (TX-TL). Синтезатор ACS. биол. 4, 503–515. дои: 10.1021/sb400206c

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Takahashi, M.K., Hayes, C.A., Chappell, J., Sun, Z.Z., Murray, R.M., Noireaux, V., et al. (2015б). Характеристика и прототипирование генетических сетей с бесклеточными реакциями транскрипции-трансляции. Методы 86, 60–72. doi: 10.1016/j.ymeth.2015.05.020

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Такаи, К., Савасаки, Т., и Эндо, Ю. (2008). Разработка ключевых технологий высокопроизводительного бесклеточного производства белка с использованием экстракта зародышей пшеницы. Доп. Белок хим. Структура биол. 75, 53–84. doi: 10.1016/S0065-3233(07)75002-7

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тамсир, А., Tabor, JJ, and Voigt, CA (2011). Надежные многоклеточные вычисления с использованием генетически закодированных вентилей НЕ-ИЛИ и химических «проводов». Природа 469, 212–215. doi: 10.1038/nature09565

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Торинг, Л., Дондапати, С.К., Стеч, М., Вюстенхаген, Д.А., и Кубик, С. (2017). Высокопроизводительное производство «трудно экспрессируемых» белков в бесклеточной системе непрерывного обмена на основе лизатов клеток CHO. науч. Респ. 7:11710. doi: 10.1038/s41598-017-12188-8

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Tran, K., Gurramkonda, C., Cooper, M.A., Pilli, M., Taris, J.E., Selock, N., et al. (2018). Бесклеточное производство терапевтического белка: экспрессия, очистка и характеристика рекомбинантной стрептокиназы с использованием лизата CHO. Биотехнология. биоинж. 115, 92–102. дои: 10.1002/бит.26439

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цубои, Т., Такео, С., Арумугам, Т. У., Оцуки, Х., и Тории, М. (2010). Система бесклеточного синтеза белка зародышей пшеницы: ключевой инструмент для открытия нового кандидата на вакцину против малярии. Acta Trop. 114, 171–176. doi: 10.1016/j.actatropica.2009.10.024

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цубои Т., Такео С., Ирико Х., Джин Л., Цучимочи М., Мацуда С. и др. (2008). Системное производство белков малярии на основе бесклеточных зародышей пшеницы для открытия новых кандидатов на вакцины. Заразить. Иммун. 76, 1702–1708. doi: 10.1128/IAI.01539-07

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ванита, С., Чаубей, Н., Гош, С.С., и Санпуи, П. (2017). Рекомбинантный человеческий гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (hGM-CSF): возможность опосредованной наночастицами доставки в иммунотерапии рака. Биоинженерия 8, 120–123. дои: 10.1080/21655979.2016.1212136

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, Х.Х., Хуанг П.Ю., Сюй Г., Хаас В., Марблстоун А., Ли Дж. и др. (2012). Мультиплексированный in vivo His-метка ферментативных путей для in vitro мультиферментный катализ в одном сосуде. Синтезатор ACS. биол. 1, 43–52. дои: 10.1021/sb3000029

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Wang, H.H., Isaacs, FJ, Carr, P.A., Sun, Z.Z., Xu, G., Forest, C.R., et al. (2009). Программирование клеток с помощью мультиплексной инженерии генома и ускоренной эволюции. Природа 460, 894–898. doi: 10.1038/nature08187

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Welsh, J.P., Lu, Y., He, X.S., Greenberg, H.B., and Swartz, J.R. (2012). Бесклеточная продукция тримерных белков головного домена гемагглютинина гриппа в качестве вакцинных антигенов. Биотехнология. биоинж. 109, 2962–2969. дои: 10.1002/бит.24581

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Виганд, Д. Дж., Ли, Х.Х., Остров Н. и Черч Г.М. (2019). Экспрессия бесклеточного белка с использованием быстрорастущей бактерии Vibrio natriegens . Дж. Вис. Эксп. 145, е59495. дои: 10.3791/59495

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Wilding, K.M., Hunt, J.P., Wilkerson, J.W., Funk, P.J., Swensen, R.L., Carver, W.C., et al. (2019). Безэндотоксиновый Бесклеточный синтез белка на основе E. coli : подходы к удалению эндотоксина до экспрессии для производства противораковых терапевтических средств по требованию. Биотехнология. Дж . 14:e1800271. doi: 10.1002/биот.201800271

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Worst, E.G., Exner, M.P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., et al. (2015). Бесклеточная экспрессия с токсичной аминокислотой канаванином. Биоорг. Мед. хим. лат. 25, 3658–3660. doi: 10.1016/j.bmcl.2015.06.045

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Худший, Э.Г., Экснер, М.П., ​​Де Симон, А., Шенкельбергер, М., Нуаро, В., Будиса, Н., и соавт. (2016). Остаточно-специфическое включение неканонических аминокислот в модельные белки с использованием бесклеточной системы транскрипции-трансляции Escherichia coli . Дж. Вис. Эксп. 114:e54273. дои: 10.3791/54273

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Вуу, Дж. Дж., и Шварц, Дж. Р. (2008). Бесклеточное производство интегральных мембранных белков с высоким выходом без рефолдинга или детергентов. Биохим. Биофиз. Акта 1778, 1237–1250. doi: 10.1016/j.bbamem.2008.01.023

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ян Дж., Кантер Г., Волошин А., Мишель-Рейделле Н., Велкин Х., Леви Р. и соавт. (2005). Быстрая экспрессия белков вакцины против В-клеточной лимфомы в бесклеточной системе. Биотехнология. биоинж. 89, 503–511. дои: 10.1002/бит.20283

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Завада, Дж. Ф., Yin, G., Steiner, A.R., Yang, J., Naresh, A., Roy, S.M., et al. (2011). От микромасштаба до масштабирования производства бесклеточного цитокина — новый подход к сокращению сроков разработки производства белка. Биотехнология. биоинж. 108, 1570–1578. дои: 10.1002/бит.23103

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Земелла, А., Торинг, Л., Хоффмайстер, К., и Кубик, С. (2015). Внеклеточный синтез белка: плюсы и минусы прокариотических и эукариотических систем. Chembiochem 16, 2420–2431. doi: 10.1002/cbic.201500340

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhu, W., Lei, R., Le Duff, Y., Li, J., Guo, F., Wainberg, M.A., et al. (2015). Система CRISPR/Cas9 инактивирует латентную провирусную ДНК ВИЧ-1. Ретровирусология 12, 22. doi: 10.1186/s12977-015-0150-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Зихель Р., Мимран А., Керен А., Барнеа А., Стейнбергер-Леви И., Маркус Д. и соавт. (2010). Эффективность потенциальной трехвалентной вакцины на основе Hc-фрагментов ботулинических токсинов A, B и E, полученных в системе бесклеточной экспрессии. клин. Вакцина Иммунол. 17, 784–792. doi: 10.1128/CVI.00496-09

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Зивин, Дж. А. (2009). Терапия острого инсульта с использованием тканевого активатора плазминогена (tPA), поскольку он был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). Энн. Нейрол. 66, 6–10.doi: 10.1002/ana.21750

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Синтез пептидов | Термо Фишер Сайентифик

Пептиды используются для получения эпитоп-специфических антител, картирования эпитопов антител и сайтов связывания ферментов, а также для разработки новых ферментов, лекарств и вакцин. В то время как синтез пептидов раньше был трудоемким и давал низкие выходы, улучшенные методы производства и пептидная химия сделали синтез пептидов более доступным для общих исследовательских целей.


Введение в синтез пептидов

Синтез пептидов характеризуется образованием пептидной связи между двумя аминокислотами. Хотя окончательного определения пептида не существует, обычно он относится к гибким (небольшим вторичным структурам) цепям, состоящим из 30-50 аминокислот.

Способность образовывать пептидные связи для связывания аминокислот существует более 100 лет, хотя первые синтезированные пептиды, включая окситоцин и инсулин, появились только через 50-60 лет, что свидетельствует о сложной задаче химического синтеза цепей. аминокислот (1).За последние 50 лет достижения в области химии и методов синтеза белка достигли такой степени, что сегодня синтез пептидов является обычным подходом даже в высокопроизводительных биологических исследованиях и разработке продуктов и лекарств (2).

Преимущество современных стратегий синтеза пептидов заключается в том, что, помимо возможности создавать пептиды, обнаруженные в биологических образцах, можно использовать творческий подход и воображение для создания уникальных пептидов для оптимизации желаемой биологической реакции или другого результата.На этой странице освещаются важные аспекты синтеза пептидов, наиболее распространенные методы синтеза и очистки, а также сильные и слабые стороны соответствующих стратегий.


Применение синтетических пептидов

Изобретение синтеза пептидов в пятидесятых и шестидесятых годах стимулировало развитие различных областей применения, в которых сегодня используются синтетические пептиды, включая разработку эпитоп-специфических антител против патогенных белков, изучение функций белков, а также идентификацию и характеристику белки.Кроме того, синтетические пептиды используются для изучения взаимодействий фермент-субстрат в важных классах ферментов, таких как киназы и протеазы, которые играют решающую роль в передаче клеточных сигналов.

В клеточной биологии связывание с рецептором или специфичность распознавания субстрата вновь открытыми ферментами часто можно изучать с помощью наборов гомологичных синтетических пептидов. Синтетические пептиды могут напоминать встречающиеся в природе пептиды и действовать как лекарства от рака и других серьезных заболеваний. Наконец, синтетические пептиды используются в качестве стандартов и реагентов в приложениях, основанных на масс-спектрометрии (МС).Синтетические пептиды играют центральную роль в обнаружении, характеристике и количественном анализе белков с помощью МС, особенно тех, которые служат ранними биомаркерами заболеваний.


Процесс синтеза пептидов

Синтез пептидов чаще всего происходит путем связывания карбоксильной группы поступающей аминокислоты с N-концом растущей пептидной цепи. Этот синтез C-to-N противоположен биосинтезу белка, во время которого N-конец поступающей аминокислоты соединяется с C-концом белковой цепи (N-to-C).Из-за сложной природы синтеза белка in vitro добавление аминокислот к растущей пептидной цепи происходит точным, ступенчатым и циклическим образом. И хотя обычные методы синтеза пептидов имеют некоторые важные отличия, все они следуют одному и тому же поэтапному методу добавления аминокислот по одной к растущей пептидной цепи.

Снятие защиты пептида

Поскольку аминокислоты имеют несколько реакционноспособных групп, синтез пептидов необходимо проводить осторожно, чтобы избежать побочных реакций, которые могут уменьшить длину и вызвать разветвление пептидной цепи.Для облегчения образования пептидов с минимальными побочными реакциями были разработаны химические группы, которые связываются с реакционноспособными группами аминокислот и блокируют или защищают функциональную группу от неспецифической реакции.

Очищенные отдельные аминокислоты, используемые для синтеза пептидов, вступают в реакцию с этими защитными группами перед синтезом, а затем определенные защитные группы удаляются из вновь добавленной аминокислоты (стадия, называемая снятием защиты) сразу после связывания, чтобы обеспечить доступ к следующей входящей аминокислоте связываться с растущей пептидной цепью в правильной ориентации.Как только синтез пептида завершен, все оставшиеся защитные группы удаляются из возникающих пептидов. Обычно используются три типа защитных групп, в зависимости от метода синтеза пептидов, которые описаны ниже.

N-концы аминокислот защищены группами, которые называются «временными» защитными группами, поскольку они относительно легко удаляются, позволяя образовать пептидную связь. Две распространенные N-концевые защитные группы  – это трет-бутоксикарбонил ( Boc ) и 9-флуоренилметоксикарбонил ( Fmoc ), и каждая группа имеет определенные характеристики, определяющие их применение.Boc требует, чтобы из вновь добавленной аминокислоты была удалена умеренно сильная кислота, такая как трифторуксусная кислота (TFA), в то время как Fmoc представляет собой неустойчивую к основаниям защитную группу, которая удаляется слабым основанием, таким как пиперидин.

Химия Boc была впервые описана в 1950-х годах и требует кислых условий для снятия защиты, в то время как Fmoc, о котором не сообщалось в течение следующих двадцати лет, расщепляется в мягких щелочных условиях (3,4,5,6). Из-за мягких условий снятия защиты химия Fmoc чаще используется в коммерческих условиях из-за более высокого качества и большего выхода, тогда как Boc предпочтительнее для синтеза сложных пептидов или когда требуются неприродные пептиды или аналоги, чувствительные к основанию.

Использование C-концевой защитной группы  зависит от типа используемого пептидного синтеза; в то время как для жидкофазного синтеза пептидов требуется защита С-конца первой аминокислоты (С-концевая аминокислота), для твердофазного синтеза пептидов этого не требуется, поскольку твердая подложка (смола) действует как защитная группа для единственного С -концевая аминокислота, требующая защиты (см. Стратегии синтеза белков).

Боковые цепи аминокислот представляют широкий спектр функциональных групп и, следовательно, являются местом значительной реактивности боковых цепей во время синтеза пептидов.Из-за этого требуется множество различных защитных групп, хотя обычно они основаны на бензильной (Bzl) или трет-бутильной (tBu) группе. Конкретные защитные группы, используемые во время синтеза данного пептида, варьируются в зависимости от последовательности пептида и типа используемой защиты N-конца (см. следующий абзац). Защитные группы боковой цепи известны как постоянные защитные группы, поскольку они могут выдерживать несколько циклов химической обработки на этапе синтеза и удаляются только во время обработки сильными кислотами после завершения синтеза.

Защита функциональной группы аминокислот. Перед синтезом пептида N-концы и боковые цепи аминокислот «защищаются» химическими группами, которые блокируют неспецифические реакции во время синтеза. С-конец С-концевой аминокислоты пептида также защищен для облегчения удлинения пептида в правильной ориентации.


Поскольку в синтезе пептидов обычно используется несколько защитных групп, очевидно, что эти группы должны быть совместимы, чтобы можно было снять защиту с отдельных защитных групп, не затрагивая при этом другие защитные группы. Схемы защиты  поэтому устанавливаются для сопоставления защитных групп таким образом, чтобы снятие защиты с одной защитной группы не влияло на связывание других групп. Поскольку снятие защиты с N-конца происходит непрерывно во время синтеза пептида, были созданы схемы защиты, в которых различные типы защитных групп боковой цепи (Bz1 или tBu) соответствуют либо Boc, либо Fmoc, соответственно, для оптимизированного снятия защиты. Эти схемы защиты также включают каждый из этапов синтеза и расщепления, как описано в таблице и в последующих разделах этой страницы.

Защита Схема удаление защитной группы Муфта Расщепление Wash
Вос / Bzl TFA Муфта
агент
в ДМФ
HF, HBr, TFMSA ДМФ
Fmoc/tBut Пиперидин ТФУ

Растворители для общей схемы защиты .


Процесс удаления защитных групп, особенно в кислых условиях, приводит к образованию катионных частиц, которые могут алкилировать функциональные группы в пептидной цепи.Таким образом, поглотители , такие как вода, анизол или производные тиола, могут быть добавлены в избытке во время стадии снятия защиты для взаимодействия с любым из этих свободных реакционноспособных частиц.

Сочетание аминокислот

Синтетическое связывание пептидов требует активации С-концевой карбоновой кислоты на входящей аминокислоте с использованием карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC). Эти связывающие реагенты реагируют с карбоксильной группой с образованием высокореакционноспособного промежуточного соединения O-ациломочевины, которое быстро вытесняется нуклеофильной атакой с незащищенной первичной аминогруппы на N-конце растущей пептидной цепи с образованием зарождающейся пептидной связи.

Карбодиимиды образуют такое реакционноспособное промежуточное соединение, что может происходить рацемизация аминокислоты. Поэтому часто добавляют реагенты, которые реагируют с промежуточным продуктом O-ациломочевины, включая 1-гидроксибензотриазол (HOBt), который образует менее реакционноспособный промежуточный продукт, снижающий риск рацемизации. Кроме того, побочные реакции, вызванные карбодиимидами, привели к изучению других связующих агентов, включая бензотриазол-1-ил-окси-трис(диметиламино)фосфония гексафторфосфат (ВОР) и 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1, 1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU), оба из которых требуют активирующих оснований для связывания аминокислот.

Схема синтеза пептидов. Сначала снимают защиту с N-концевой защитной группы на С-концевой аминокислоте синтезируемого пептида. После удаления несвязанных защитных групп следующая аминокислота активируется на С-конце связывающим агентом (например, DCC; не показан), который способствует образованию пептидной связи между незащищенным N-концом первой аминокислоты и активированный С-конец входящей аминокислоты. Затем с нового N-конца растущего пептида снимают защиту и связывают со следующей аминокислотой.Этот цикл снятия защиты и связывания повторяется до тех пор, пока не образуется полноразмерный пептид.


Расщепление пептида

После последовательных циклов снятия защиты и связывания аминокислот все оставшиеся защитные группы должны быть удалены из возникающего пептида. Эти группы расщепляются ацидолизом, и химическое вещество, используемое для расщепления, зависит от используемой схемы защиты; сильные кислоты, такие как фтористый водород (HF), бромистый водород (HBr) или трифторметансульфоновая кислота (TFMSA), используются для расщепления групп Boc и Bzl, в то время как относительно более мягкая кислота, такая как TFA, используется для расщепления групп Fmoc и tBut.При правильном выполнении расщепление приводит к удалению N-концевой защитной группы последней добавленной аминокислоты, С-концевой защитной группы (либо химической, либо смолы) из первой аминокислоты и любых защитных групп боковой цепи. Как и в случае снятия защиты, на этом этапе также включаются поглотители для реакции со свободными защитными группами. Из-за важности расщепления для правильного синтеза пептидов этот этап следует оптимизировать, чтобы избежать побочных реакций, катализируемых кислотой.

Схема расщепления пептида после синтеза. Оставшиеся защитные группы N-конца, все защитные группы боковой цепи и защитную группу C-конца или твердую подложку удаляют обработкой сильной кислотой после завершения синтеза пептида.


Стратегии синтеза пептидов

Синтез пептидов в жидкой фазе — это классический метод, который ученые использовали, когда впервые открыли, как генерировать пептиды in vitro, и он до сих пор широко используется для крупномасштабного синтеза. Однако этот метод является медленным и трудоемким, поскольку продукт необходимо вручную удалять из реакционного раствора после каждого этапа.Кроме того, для этого подхода требуется еще одна химическая группа для защиты С-конца первой аминокислоты. Однако преимущество жидкофазного синтеза заключается в том, что, поскольку продукт очищается после каждой стадии, побочные реакции легко обнаруживаются. Кроме того, можно проводить конвергентный синтез, при котором отдельные пептиды синтезируются, а затем соединяются вместе для создания более крупных пептидов.

На сегодняшний день твердофазный синтез пептидов является наиболее распространенным методом синтеза пептидов.Вместо защиты С-конца химической группой С-конец первой аминокислоты соединен с активированной твердой подложкой, такой как полистирол или полиакриламид. Этот тип подхода имеет двойную функцию: смола действует как защитная группа С-конца и обеспечивает быстрый метод отделения растущего пептидного продукта от различных реакционных смесей во время синтеза. Как и во многих других биологических производственных процессах, синтезаторы пептидов были разработаны для автоматизации и высокопроизводительного производства пептидов.


Хотя стратегии синтеза пептидов оптимизированы и могут производиться серийно, процесс получения пептидов далеко не идеален. Такие события, как неполное снятие защиты или реакция со свободными защитными группами, могут вызывать укороченные или делеционные последовательности, изомеры или другие побочные продукты. Эти события могут происходить на любом этапе синтеза пептида, поэтому чем длиннее пептидная последовательность, тем больше вероятность того, что что-то негативно повлияет на синтез целевого пептида.Таким образом, выход пептида обратно пропорционален длине пептида.

Стратегии очистки обычно основаны на сочетании методов разделения, использующих физико-химические характеристики пептидов, включая размер, заряд и гидрофобность. Методы очистки включают:

  • Эксклюзионную хроматографию
  • Ионообменную хроматографию (IEC)
  • Распределительную хроматографию
  • Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)

Обратно-фазовая хроматография (RPC) является наиболее универсальной и использован метод очистки пептидов.В традиционных методах ВЭЖХ неподвижная фаза захватывает полярные гидрофильные молекулы, которые затем дифференциально элюируются за счет увеличения концентрации полярных растворителей в подвижной фазе. В RPC, как следует из названия, гидрофобные молекулы из водных растворов вместо этого захватываются стационарной фазой с использованием гидрофобных н-алкилуглеводородных лигандов C4, C8 или C18, и время их удерживания зависит от гидрофобности молекулы и гидрофобности молекулы. Мобильная фаза.

Для очистки пептидов RPC отделяет целевые пептиды от примесей на этапах синтеза, таких как изомеры, делеционные последовательности, пептидные продукты побочных реакций со свободными связывающими и защитными группами или пептиды, которые подверглись боковым цепным реакциям.

Чистота пептида измеряется как процент целевого пептида по отношению к примесям, которые поглощают на длине волны поглощения пептидной связи (210–220 нм). В продаже имеются различные уровни чистоты в зависимости от применения, в котором будут использоваться пептиды:

  • >95% – Количественные исследования, такие как ЯМР, исследования связывания рецептор-лиганд, ИФА и РИА, производство моноклональных антител, исследования in vivo
  • >80% – Высокопроизводительный скрининг, неколичественное блокирование в Вестерн-блот-анализ, неколичественные исследования фермент-субстрат, аффинная очистка антител и покрытие планшетов для прикрепления клеток
  • >70% – стандарты ELISA, анализы ELISPOT и получение поликлональных антител

  1. Lloyd-Williams P.и другие. (1997) Химические подходы к синтезу пептидов и белков. Бока-Ратон: CRC Press. 278
  2. Merrifield R. B. (1963) Твердофазный синтез пептидов. I. Синтез тетрапептида. Журнал Американского химического общества. 85, 2149-54.
  3. Карпино Л. А. (1957) Окислительные реакции гидразинов. Ив. Удаление азота из 1,1-дизамещенных-2-аренсульфогидразидов1-4. Журнал Американского химического общества. 79, 4427-31.
  4. Маккей Ф. К. и Альбертсон Н.Ф. (1957) Новые группы, маскирующие амины, для синтеза пептидов. Журнал Американского химического общества. 79, 4686-90.
  5. Anderson G.W. and McGregor A.C. (1957) Т-бутилоксикарбониламинокислоты и их использование в синтезе пептидов. Журнал Американского химического общества. 79, 6180-3.
  6. Carpino L.A. and Han G.Y. (1972) Защитная группа для 9-флуоренилметоксикарбонила. Журнал органической химии. 37, 3404-9.

История рибосом раскрывает происхождение современного синтеза белка

Образец цитирования: Harish A, Caetano-Anollés G (2012) История рибосом раскрывает происхождение современного синтеза белка.ПЛОС ОДИН 7(3): е32776. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776

Редактор: Стивен Р. Пру, Калифорнийский университет в Санта-Барбаре, США

Получено: 20 ноября 2011 г.; Принято: 30 января 2012 г.; Опубликовано: 12 марта 2012 г.

Copyright: © 2012 Harish, Caetano-Anolles. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Авторы благодарят Национальный научный фонд (гранты MCB-0343126 и MCB-074983607 для GCA) и United Soybean Board за финансирование. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Трансляция — это сложный и четко скоординированный процесс биосинтеза белка, который опосредован универсальным рибонуклеопротеиновым (RNP) комплексом — рибосомой.Рибосомы состоят из двух основных субъединиц [1]. Малая субъединица (МСУ) состоит из одной молекулы рибосомной РНК (рРНК) и более 20 рибосомных белков (r-белков) в зависимости от вида. Большая субъединица (БСУ) состоит из 2–3 рРНК и более 50 р-белков. Трансляция начинается, когда две субъединицы связываются путем установления межсубъединичных мостиков [2]. SSU опосредует взаимодействия между информационной РНК (мРНК) и транспортными РНК (тРНК) для декодирования генетической информации, а LSU катализирует синтез пептидной связи [3].r-белки обычно занимают периферические области, но имеют удлиненные хвосты, которые проникают в функциональное ядро. В то время как успехи в структурных исследованиях показали широкое посредничество РНК [1], очень рано было признано, что и r-белки, и рРНК необходимы для эффективного функционирования рибосом [4]. Помимо своей роли в сборке и стабильности рибосом, r-белки вносят значительный вклад во все этапы трансляции [5]. Фактически, недавние биохимические и структурные исследования показали, что r-белки стабилизируют и облегчают связывание тРНК и являются определяющими факторами скорости переноса пептидила [6], [7].

Многие теории пытаются объяснить появление рибосомы, в том числе идея о том, что простая примитивная рибосома, которая пассивно способствовала трансляции [8], [9], со временем улучшала свою скорость и точность [10]. Эволюция рибосом также неразрывно связана с эволюцией тРНК и генетического кода. Несколько теорий утверждают, что триплетный генетический код возник до трансляции и имел функции, отличные от существующих молекул [11], [12]. Хотя конкретные модели различаются, большинство теорий предполагают, что трансляция была функциональным захватом примитивного аппарата репликации на основе РНК.Хотя эти теории правдоподобны, они были весьма спекулятивными.

Здесь мы делаем вывод о происхождении и эволюции рибосомного ансамбля из филогенетических методов, примененных непосредственно к структуре РНК [13], [14] или из переписи белковых структур в протеомах [15]. Используемый нами общий подход (рис. 1) применялся в ряде важных приложений, добывая информацию в существующих молекулах и создавая укоренившиеся филогенетические деревья, которые встраивают структуру и функции непосредственно в филогенетический анализ (текст S1).Деревья, полученные в результате анализа структур тысяч молекул РНК и переписи структур белковых доменов в сотнях геномов, показывают, что структура рРНК развивалась постепенно вместе с r-белками. Это также показывает, что универсально консервативные, функционально важные основные компоненты на границе SSU и LSU являются изначальными. Мы также представляем доказательства сходства этого ядра с рибозимами, развившимися in vitro , и показываем, что современный синтез белка, вероятно, развился в результате рекрутирования родственных ранее существовавших функций в первичных молекулах.

Рисунок 1. Экспериментальная стратегия.

Блок-схема слева описывает филогенетическую реконструкцию деревьев молекул и субструктур рРНК. Структуры молекул рРНК были сначала разложены на субструктуры, в том числе спиральные стволовые тракты и непарные области. Структурные особенности этих субструктур (например, длина) были закодированы как филогенетические признаки и присвоены состояниям признаков в соответствии с эволюционной моделью, которая поляризует преобразование признаков в сторону увеличения молекулярного порядка (аргументация признаков).Закодированные символы (символы) располагаются в матрицах данных, которые можно транспонировать для кладистического анализа. Филогенетический анализ с использованием методов МП создает укоренившиеся филогенетические деревья либо молекул, либо субструктур. В этом исследовании представлены только деревья подструктур. Блок-схема справа показывает реконструкцию деревьев протеомов и деревьев структур белковых доменов. Перепись доменных структур в протеомах сотен полностью секвенированных организмов используется для составления матрицы данных и ее транспонированной матрицы, которые затем используются для построения филогеномных деревьев, описывающих эволюцию отдельных белковых структур и целых молекулярных репертуаров соответственно.Элементы матрицы (g) представляют геномное изобилие архитектур (на уровне FSF иерархической классификации структуры) в протеомах. Деревья протеомов будут описаны в другом месте, но они в значительной степени соответствуют традиционной классификации. В дерево субструктур рРНК и дерево белковых доменов встроены временные шкалы, определяющие возраст молекулярных структур. Эти возрасты можно «нарисовать» на двухмерных или трехмерных структурных моделях рибосомы, создав эволюционные тепловые карты. Эволюционная информация из структур РНК и белков, наконец, объединяется для создания модели структурной эволюции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g001

Результаты и обсуждение

История рРНК показывает, что наследственное ядро ​​процессивности предшествует возникновению пептидилтрансферазного центра (PTC)

Интуитивно понятно, что большой и сложный молекулярный ансамбль, такой как рибосома, должен развиваться посредством поэтапного процесса, в котором структурные компоненты постепенно добавляются к расширяющимся молекулам. Это делает возраст этих компонентов обязательно разным.Вдохновленная открытием симметрии в области, в которой находится PTC, и происхождения, включающего структурную дупликацию [16], третичная структура была использована для выводов и моделирования эволюции LSU рРНК. Эти исследования предполагают, что спиральные взаимодействия повторяют молекулярный рост [17], а структуры растут в виде концентрических оболочек из древнего ядра, включающего ПТЦ [18], [19]. Однако они не используют систематическую сравнительную или филогенетическую структуру и ограничиваются LSU рРНК в доступных кристаллических структурах.Напротив, здесь мы выводим историю полного ансамбля RNP, используя филогенетические методы, использующие стандартные принципы кладистики, широко используемые, например, при анализе морфологических характеристик организмов. Общие производные признаки структуры, определенные с помощью кристаллографии и сравнительного анализа последовательностей, рассматриваются как филогенетические признаки и используются для построения структурных филогений (рис. 1). Мы отмечаем, что исторические утверждения, которые мы представляем, обязательно происходят из рибосомных структур, существующих сегодня, а не из тех, которые были утеряны или являются гипотетическими.

Филогении структурных элементов рРНК, уходящие корнями в поляризующее изменение характера (от предков к производным), обеспечивают хронологию аккреции субструктур в молекулах (Текст S1). Следовательно, дерево само по себе становится моделью структурной эволюции. Мы реконструировали универсальное дерево спиральных элементов рРНК, присутствующих во всех трех надцарствах жизни (рис. 2). Деревья, описывающие отдельную эволюцию спиралей в SSU или LSU рРНК, построенные на основе структурных данных примерно 20 000 молекул рРНК, в значительной степени конгруэнтны и подтверждают историю рРНК (рис. S1).Эти структурные деревья поддерживаются тремя фундаментальными и хорошо обоснованными предположениями: (i) рРНК можно рассматривать как трехмерное (3D) расположение спиралей [20], (ii) топологические ограничения вторичной структуры в значительной степени определяют глобальную структуру РНК [21] , и (iii) рРНК может быть разложена на спирали для эволюционного изучения [13], [17]. Количество внутренних узлов, определяющих ответвления от корня к каждому листу дерева, монотонно увеличивается со временем. Поэтому мы рассчитали относительный возраст каждой спирали рРНК как расстояние узлов ( nd ), относительное количество узлов вдоль ветвей деревьев (таблица S1).Эти относительные возрасты использовались для окрашивания вторичных и трехмерных структурных представлений рибосомы (эволюционные тепловые карты) (рис. 2) и для построения временных шкал аккреции компонентов рибосомы и связанных с ними функций (рис. 3).

Рис. 2. Эволюция структуры рРНК.

Строгий консенсус 6 самых экономичных деревьев (33 876 шагов; CI = 0,168615, RI = 0,710934; HI = 0,831385; g 1  = −1,425648) сохраняется после he по относительному возрасту ( и ) сохранившихся (помечены таксоны) или эволюционирующих (узлы) спиральных элементов структуры.Всего было объединено и проанализировано 92 информативных признака, представляющих структуру SSU и LSU рРНК у 93 организмов из трех надцарств. Значения поддержки начальной загрузки (BS) > 50% показаны для отдельных узлов. На верхней и средней панелях показаны эволюционные тепловые карты вторичных и кристаллических структур (2WDK и 2WDL) рРНК Thermus thermophillus рРНК SSU и LSU, соответственно, со спиралями, окрашенными в соответствии с их возрастом ( и ). На нижней панели показано первичное ядро ​​процессивности, выделенное в рибосомном ансамбле 70S.Функциональные центры выделены на дереве и тепловых картах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g002

Рис. 3. Хронология развития функциональных центров рибосомы.

A , Относительный возраст ( и ) различных спиралей рРНК (цветные кружки) увеличивается слева направо, а функциональные элементы SSU и LSU обозначены квадратами и ромбами соответственно. Круговые диаграммы под каждой временной точкой показывают процент спиралей SSU и LSU, появляющихся в это время, а два периода эволюционного перехода заштрихованы. B , Хронология конструкций мостов. Возраст мостиковых взаимодействий определяется как возраст первого акцепторного элемента донорно-акцепторной пары, образующей мостик (красные линии). C , Хронология спиралей, которые взаимодействуют с различными плечами тРНК. D , Временные линии спиралей, образующих функциональные центры рибосомы. PTC выделен красным прямоугольником. E , История функций. Ширина стрелок изображает увеличение элементов, образующих центр, и время, затраченное на его развитие. F , Хронология взаимодействий A-минор в SSU и LSU рРНК. Имена с заглавными буквами обозначают донора, а строчными буквами указывают на акцептора взаимодействия ля-минор.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g003

Филогенетические деревья показывают, что предпоследний спиральный ствол h54 в SSU рРНК является самым старым (рис. 2). Эта спираль является основным компонентом функционального реле, которое связывает процессы в сайте декодирования SSU с LSU-центрированными процессами, такими как образование пептидной связи и высвобождение факторов элонгации, тем самым модулируя межсубъединичные взаимодействия [22].Временная шкала срастания спиральных сегментов молекулярного ансамбля показывает одновременную структурную диверсификацию двух основных субъединиц (рис. 3А) и пропорциональное увеличение размера субъединиц при и >0,3 (рис. 4). Он также раскрывает функциональное происхождение рибосом, демонстрируя раннее появление и скоординированную эволюцию функционально важных областей для рибосомной процессивности в SSU рРНК, ответственных за декодирование мРНК, транслокацию тРНК и активность хеликазы мРНК (рис. 3D и E).Их происхождение ( и  = 0,0–0,3) предшествует субструктурам LSU, которые составляют ПТК, большинство из которых появляются вместе на и ∼0,3 (желтые спирали H73–H75, H89 и H90 на рис. 2; рис. 3E). Примечательно, что быстрое и скоординированное появление субструктур PTC в деревьях (особенно молекулярное видообразование H74 и H90) (рис. 2) подтверждает возможное событие дупликации, ответственное за появление PTC [16]. Управляемое фактором удлинения G (EF-G), древнее ядро ​​процессивности выполняет механически сложную функцию храповика субъединиц относительно друг друга и поддержания рамки считывания и точности перевода.Напротив, активность синтеза пептидных связей у более производных PTC проще (зависит исключительно от близости и ориентации субстратов тРНК [23]) и требует критических контактов с первичным ядром (Text S2).

Рис. 4. Эволюционная аккреция молекулярных структур и установление ля-минорных взаимодействий.

A. Кумулятивные графики, описывающие рибосомную аккрецию спиралей рРНК и r-белков на временной шкале эволюции. Временные шкалы вверху показывают первое появление отдельных структурных доменов в субъединицах рРНК.Периоды эволюционного перехода выделены серым цветом. Обратите внимание на быстрое увеличение структурной сложности после первого перехода, когда объединились процессивность и синтез пептидов. B. Накопление А-минорных взаимодействий, связанных с отдельными субъединицами рРНК в рибосомной истории. Графики описывают кумулятивное количество взаимодействий A-минор в зависимости от возраста рибосом, поскольку взаимодействия накапливаются на временной шкале эволюции структуры рРНК. Быстрое увеличение числа А-минорных взаимодействий после первого перехода, где сошлись процессивность и синтез пептидов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g004

Мы подчеркиваем, что функциональное ядро ​​включает две субъединицы и является более старым, чем другие области рибосомного комплекса. Функциональные ядра отдельных субъединиц расположены в центре трехмерных структур соответствующих субъединиц. Паттерны срастания спиралей в нашей модели также согласуются с моделями PTC-first, которые сосредоточены исключительно на LSU рРНК [17], [18], [19]. Подробное сравнение молекулярной аккреции (рис. S2) показывает, что модели эволюции LSU рРНК могут быть согласованы (текст S2).Однако мы отмечаем преимущества хронологии спиралей как в SSU, так и в LSU рРНК, особенно в сочетании с хронологией взаимодействующих r-белков.

История межсубъединичного моста указывает на раннюю независимую эволюцию субъединиц

Две основные рибосомальные субъединицы связываются и сообщаются посредством межсубъединичных мостиков и тРНК на интерфейсе, почти лишенном белков [2]. Поскольку межсубъединичные мостиковые взаимодействия удерживают рибосомный комплекс вместе, мы сопоставили эти взаимодействия, чтобы оценить, когда основные функции рибосомы действуют согласованно.Рисунок 3B и таблица S2 показывают хронологию установления межсубъединичного моста. Мост B5 — самый старый, впервые установленный между h54 и h37 ( и  = 0,17). За этим начальным мостиковым контактом последовало появление h34-опосредованных контактов в мостиках B2b и B2c ( и  = 0,22). Эти первые три моста включают некоторые из самых старых спиралей SSU и LSU (h54, h34, H67 и h37). Далее следуют мосты B6 и B7b, предшествующие формированию ПТК ( nd  = 0,28–0,29). Они также включают h54 и h34, но устанавливают контакты с древним r-белком L2.Затем был установлен мост B1a ( и  = 0,48), за которым последовало относительно быстрое появление мостов B4, B7a, B3 и B2a ( и  = 0,63–0,67). Наконец, B1b и B8 появляются довольно поздно в эволюции рРНК ( и  = 0,91). Эта прогрессия мостиковых взаимодействий (красная пунктирная линия, рис. 3B) соответствует постепенному срастанию рибосомных субструктур. Мосты B5, B2b, B7a, B3 и B2a образуют функциональное ядро ​​межсубъединичных контактов. Мутации в любом из этих контактов нарушают ассоциацию субъединиц и точность трансляции [24].Интересно, что около половины этого функционального ядра (B5, B2b) и примерно половина всех спиралей, участвующих в мостиковых контактах, происходят одновременно с центром процессивности SSU, в то время как другая половина функционального ядра (B7a, B3, B2a) и остальные мосты возникают после установления PTC. Таким образом, история функций и взаимодействий предполагает, что две субъединицы сначала функционировали независимо и что произошел «основной переход» в эволюции трансляции на и ∼0.30 объединили две субъединицы в современный белковый биосинтетический ансамбль. Этот переход, вероятно, совпал с эволюцией тРНК клеверного листа.

Третичные взаимодействия увеличиваются после первого основного перехода

Вторичная структура рРНК

во многом определяется расщеплением оснований и стабилизируется двухвалентными катионами и r-белками [25]. Однако множественные третичные взаимодействия РНК-РНК и РНК-белок между мотивами вторичной структуры, такие как псевдоузлы, тетрапетли и взаимодействия A-минор, обеспечивают дополнительную стабильность.А-минорные взаимодействия были впервые описаны в кристаллической структуре LSU рРНК и обычно образованы высококонсервативными наборами нуклеотидов [26]. Помимо стабилизации структуры рРНК, А-минорные взаимодействия играют роль в декодировании мРНК [20]. Степень участия А-минорных взаимодействий в функции рибосом побудила к изучению их роли в эволюции LSU рРНК. Исследование основано на предположении, что акцепторные спирали, в которые встраиваются аденозиновые стеки, эволюционировали раньше, чем донорные спирали [17].Мы нанесли на карту все известные взаимодействия A-минор как в SSU, так и в LSU рРНК (рис. 3F). В самом деле, большинство спиралей эволюционировали до образования соответствующих им аденозиновых стеков. Интересно, что >90% этих взаимодействий происходят после первого крупного перехода (рис. 4), начиная сразу после развития ПТК и достигая пика примерно во время развития центра, ассоциированного с ГТФазой (см. ниже). Во время храпового движения транслокации мРНК-тРНК в цикле элонгации требуются очень большие конформационные изменения [27].Мы предполагаем, что А-минорные и другие третичные взаимодействия развились для стабилизации и поддержания структуры рибосом во время элонгации, что привело к увеличению рибосомной процессивности. Редкость A-минорных взаимодействий перед основным переходом означает, что ранняя структура прото-рибосом в основном стабилизировалась r-белками или их предшественниками. Хотя другие третичные взаимодействия РНК могли играть роль, это маловероятно, поскольку они не так распространены, как взаимодействия A-minor, и в них обычно участвуют белки [28].Также возможно, что меньшее количество спиральных структур проторибосомы может не нуждаться в третичных взаимодействиях, чтобы быть стабильными.

тРНК находится в центре рибосомной эволюции

Предлагаемый основной переход соответствует не только быстрому развертыванию PTC и мостов, которые связывают субъединицы, но также и взаимодействиям с полной молекулой тРНК в сайтах A, P и E PTC (рис. 3C). тРНК имеют две структурно и функционально независимые половины с независимым эволюционным происхождением [29], [30].Каждая половина взаимодействует почти исключительно с одной из двух рибосомных субъединиц [31], древняя верхняя половина (состоящая из плеч акцептора и TΨC) с LSU, а производная нижняя половина (антикодоновые и дигидроуридиновые плечи) с SSU. В самом деле, временная шкала взаимодействий тРНК (рис. 3С) показывает, что среди известных взаимодействий тРНК-рРНК, происходящих до основного перехода, многие включали древние спирали SSU и относительно недавнее плечо антикодона. После перехода большинство контактов тРНК-рРНК включало более новые спирали LSU и более старую половину молекулы тРНК.Установление критических контактов TΨC и SSU ( nd  = 0,30–0,37) следует за появлением PTC ( nd  = 0,30) и делает это плечо тРНК единственной областью, способной взаимодействовать с двумя субъединицами. Контакты с акцепторным плечом тРНК, необходимые для переноса пептидила, верности и всех этапов трансляции, произошли позже ( и  = 0,44–0,7). Эти замечательные паттерны предполагают, что взаимодействия субъединиц с полной современной структурой тРНК клеверного листа были задействованы для трансляции после основного перехода и что рибосома была построена вокруг тРНК или тРНК-подобных структур (текст S3).

Структурная филогеномика показывает, что рибосома является древним коэволюционирующим комплексом RNP

r-белков тесно связаны с рибосомами, они очень древние, и их структуры обеспечивают уникальное окно в раннюю эволюцию белков [32]. Чтобы определить их относительный возраст, мы создали филогеномное дерево, которое описывает эволюцию белковых доменов на уровне структурной сложности складчатого суперсемейства (FSF) (рис. 5А). Дерево доменной структуры имеет корни (текст S4), было создано на основе глобальной геномной структурной переписи в 749 протеомах с использованием установленной методологии и обеспечивает временную шкалу появления белков в белковом мире, которая имеет значительную предсказательную силу [15], [33]. ].

Рис. 5. Относительный возраст r-белков и их взаимодействие со спиралями рРНК.

A , Основа универсального дерева, описывающего эволюцию 1730 доменных структур FSF из 749 геномов (541 383 шага; CI = 0,028, RI = 0,783; g1 = −0,111). Диаграмма Венна показывает возникновение FSF в трех надцарствах. B , спирали рРНК, устанавливающие контакты с универсальными r-белками. Относительный возраст спиралей рРНК ( и ) увеличивается слева направо, а r-белки упорядочены по возрасту (снизу вверх) с соответствующим значением и P .Количество нуклеотидов в каждый момент времени, участвующих в РНК-белковых взаимодействиях, пропорционально размеру квадратов (SSU) и ромбоидов (LSU). Контакты r-белков окрашены в соответствии с возрастом спирали, которая образует самый древний контакт или как следует из рисунка S2. C , Эволюционная тепловая карта r-белков SSU. D , Эволюционная тепловая карта LSU r-белков. Трехмерные структуры показывают относительный возраст спиралей рРНК и относительный возраст взаимодействующих с ними r-белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g005

Мы проверили существование коэволюционных закономерностей, изучив возраст универсальных r-белков ( nd P ) (таблица S3) и возраст спиралей рРНК ( и ), с которыми они связываются (рис. 5В; таблица S4). Коэволюция здесь определяется как изменение РНК, которое отвечает на изменение белков, и наоборот. Таким образом, эта концепция подразумевает одновременное существование молекулярных компонентов, которые так или иначе взаимодействуют друг с другом.Усовершенствованные линейные скрытые марковские модели (HMM) структурного распознавания, которые мы используем в нашей структурной переписи, могут надежно идентифицировать домены r-белка в протеомах даже при наличии структурно неупорядоченных областей, которые располагаются глубоко в ядре рибосомы (см. Методы). Мы не ожидаем, что существование этих неструктурированных хвостов будет искажать геномную распространенность доменов и влиять на оценки относительного возраста. Точно так же мы не ожидаем, что неструктурированные (непарные) области структурных элементов рРНК повлияют на реконструкцию дерева, возраст спиралей рРНК или выводы нашего исследования.Примечательно, что самые старые r-белки, S12 и S17 ( nd P  = 0,018), взаимодействуют с самой старой (h54) и второй по возрасту (h21) спиралями SSU рРНК, и, что не менее примечательно, линейная корреляция между возрастом наиболее древний контакт рРНК (полученный из анализа структуры РНК) и возраст r-белков (полученный из переписи доменов в белках) не ослабевает до и ∼0,35 и и P ∼0,2 (штриховые линии, рисунок 5B). Корреляция [ nd P  = −0.535 и +0,009; R 2  = 0,961; F = 221,3, P <0,0001] был поразительным в течение ранней истории рибосом (рис. S3) и убедительно свидетельствует о том, что и РНК, и белки коэволюционируют вместе, поскольку РНК-белковые взаимодействия формируются с недавно развитыми областями рибосомы. Паттерн конгруэнтности также определяет общую тенденцию, которая связывает временные линии белков и РНК и показывает, что r-белки постоянно рекрутировались на протяжении всей рибосомной эволюции (рис. 4). Отметим, что ранние белки, S12 и S17, также взаимодействуют со спиралями h4, h5, h9 и h32, которые получены сравнительно недавно ( nd  = 0.33–0,44). Точно так же многие белки начинают взаимодействовать с более новыми областями рРНК по мере их развития. Белки, появляющиеся после основного перехода, также взаимодействуют со старыми областями рРНК. Это указывает на то, что предшественники r-белков взаимодействовали с прото-рибосомой на очень раннем этапе эволюции, и новые взаимодействия постоянно устанавливались по мере того, как структура рРНК развивалась за счет приращения новых субструктур, а также по мере того, как размер r-белков увеличивался в процессе эволюции, чтобы соответствовать росту спирали и приращению. (Рисунок 5C и D; Рисунок S4).Мы также отмечаем, что рРНК и r-белки могли существовать до того, как установились взаимодействия. Однако поразительное совпадение относительных возрастов рРНК и р-белков, а также соответствие этих возрастов положениям взаимодействующих сегментов РНК-белок в трехмерной молекулярной структуре (более старые компоненты в ядре рибосомного комплекса сменяются более новыми). компоненты к периферии) вряд ли может быть случайным совпадением. Вместо этого его следует рассматривать как свидетельство совместной эволюции с самых ранних стадий.

Самые ранние пептидные цепи, скорее всего, были синтезированы примитивными способами, возможно, путем автокатализа и/или нерибосомного синтеза пептидов (NRPS) [34], [35], поскольку современная рибосомная трансляция еще не развилась. Подробная модель раннего происхождения первичных полипептидов и трансляции, основанная на филогеномных данных [36], предполагает, что происхождение современной биохимии связано с клеточными мембранами, ацилированием тиоэфиров и нерибосомным лигированием пептидов [37]. Фактически, временные шкалы структур белковых доменов на уровне структурной абстракции фолд-семейства показывают развитие доменных структур с двумя активными центрами (каталитическое редактирование), способными к двухстадийному (активация-ацилирование) каталитическому процессу, развитому до r-белков и современная рибосома [36], [37].Эти доменные структуры присутствуют в современных ацил-КоА-синтетазах, аминоацил-тРНК-синтетазах (AARS) и ацилирующих доменах NPRS [37]. Химические свойства этих доменов позволяют передавать очень разнообразный набор аминокислотных фрагментов множеству субстратов, свойство, которое по-прежнему связано с биосинтезом белка в линиях сборки NRPS [35] и AARS-гомологов модулей NRPS [38]. Это связывает рибосомный и нерибосомный синтез пептидов.

Биохимические исследования рибосом, обедненных несколькими r-белками [39], и структурные исследования LSU, выявившие отсутствие белков в PTC, были приняты за доказательство того, что рибосома является рибозимом [40].При этом р-белкам отводилась лишь вспомогательная роль в функционировании рибосом. Однако новые открытия о r-белках и каталитическом механизме рибосомы поставили под сомнение эти взгляды [41]. Биохимические исследования и структуры с более высоким разрешением интактных рибосом с тРНК показали, что r-белок L27 стабилизирует тРНК P-сайта в PTC [6], а L16 облегчает связывание аминоацил-тРНК с сайтом A у бактерий [7]. Мутации в этих двух белках существенно снижают скорость переноса пептидила.Таким образом, рибосомальный катализ является свойством интегрированного комплекса РНП, а не ограниченного участка функциональных групп РНК в каталитическом центре [41]. И белок, и РНК играют решающую роль, и их нельзя заменить друг другом. Наш филогеномный анализ теперь дает убедительные доказательства в пользу тесной взаимозависимости r-белков и рРНК (рис. 5, рис. S4).

Случайные полипептиды размером с небольшой белок могут складываться в 3D-конформации в отсутствие отбора [42].Таким образом, ранние пептиды были структурированы и, вероятно, перестроены и помогли стабилизировать РНК, делая возможными структурные конформации рРНК, иначе невозможные при простых взаимодействиях РНК-РНК [43]. Эти изменения вызвали небольшие улучшения в скорости и точности трансляции, что дало сильные избирательные преимущества клеткам, которые их несли. Мы предполагаем, что сложная функциональность рибосом возникла в результате кооперативного взаимодействия рРНК и р-белков (или их предшественников), которые существовали с самых ранних стадий эволюции рибосом.До настоящего времени in vitro пептидилтрансферазная активность, катализируемая безбелковой рРНК, полученной из существующей рРНК или рибозимов, не продемонстрирована [44]. Возможно, изначальная кооперативность комплекса РНП объясняет, почему такие попытки не увенчались успехом.

Филогеномика раскрывает раннее происхождение r-белков и фактор-опосредованный второй переход в рибосомной эволюции

Древо доменной структуры показывает, что S12 и S17 ( nd P  = 0,018) являются не только самыми старыми r-белками, но и появляются после важнейших метаболических белков в начале белкового мира (рис. 5А), в начале период «архитектурной диверсификации» (Эпоха 1) [33], [36].Современное ядро ​​трансляции RNP возникло вскоре после этого, одновременно с L3, L2 и L24 ( nd P  = 0,05–0,2), но задолго до многих других r-белков (большинство из которых появляются вместе в узком временном интервале, nd P  = 0,40–0,53) и задолго до возникновения сверхцарств в диверсифицированном мире (рис. 5А). «Разрыв» в открытии новых белков на и P  = 0,32–0,40 свидетельствует о фундаментальном пересмотре механизма биосинтеза белков, после чего белковые инновации значительно усиливаются.Этот второй крупный переход в рибосомной эволюции совпадает с появлением белкового комплекса L7/L12 на уровне nd P  = 0,42 и сопровождается быстрой диверсификацией r-белка (рис. 5В). Комплекс L7/L12 стимулирует активность ГТФазы EF-G, рибосомного фактора, который катализирует удлинение и отвечает за заметное увеличение процессивности рибосомы (текст S4).

Рибосомное ядро ​​имеет сходные структурные особенности с

In Vitro Эволюция РНК-лигазы и полимеразных рибозимов

Отсутствие природных RNP-полимераз, кроме рибосомы, представляет собой пробел в эволюционной непрерывности, препятствующий филогенетическому анализу функции рибосом.Однако биосинтез РНК (репликация) и белков (трансляция) имеют общие процессивные прочтения РНК. Поиск сходства последовательности и структуры между in vitro выбранными рибозимами РНК-репликазы и рРНК может выявить сдвиги в функциях в ходе эволюции (кооптация) (текст S5). Субструктуры рибозимов РНК-лигазы L1 [45], РНК-полимеразы [46] и AARS [47] (рис. 6А) и тРНК (используемые в качестве контроля) были сопоставлены с субструктурами гипотетических предковых SSU и LSU рРНК (реконструированных непосредственно из наших деревьев). ; Рисунок S5).На рисунке 6B показана статистика выравнивания для субструктур рибозима лигазы. Статистически значимое сходство было обнаружено преимущественно между первичными спиралями рРНК ( и <0,3) и каталитическими спиралями рибозимов лигазы и полимеразы, но не с субструктурами молекул AARS или тРНК (рис. S6). Субструктуры, имеющие общие структурные особенности с рибозимами, были частью функциональных центров (44%), большинство из которых способствовало либо взаимодействию нуклеотидов, либо образованию пептидных связей, либо играло структурную вспомогательную роль (рис. 6С) и представляло половину всех функциональных субструктур.Таким образом, вполне вероятно, что рибосомное каталитическое ядро ​​происходит из процессивных субструктур, общих для репликации и трансляции, и является потомком примитивного шаблонного комплекса. Эти результаты в сочетании с биохимическими данными, показывающими, что процессивная функция PTC (высвобождение пептида) является более консервативной и каталитически ограничивающей, чем его центральная биосинтетическая функция (синтез пептидных связей) [48], предоставляют важные доказательства в пользу функционального рекрутирования. Поскольку структурные компоненты прото-рибосомы, участвующие в тРНК, мРНК и межсубъединичных взаимодействиях, старше других, эти результаты также подтверждают репликативное происхождение тРНК [30], [49].

Рисунок 6. Сходство структур наследственной рРНК с эволюционировавшими in vitro рибозимами.

A , Модели вторичной и третичной структуры рибозимов РНК-лигазы L1, РНК-полимеразы и аминоацил-тРНК-синтетазы (AARS). Длинная спираль (стебель A) молекулы РНК-лигазы L1 с тремя стеблями содержит каталитический сайт и соединение трех спиральных областей P1–P2, P4–P5 и P6–P7 в центре структуры РНК-полимеразы, похожей на треногу. является каталитическим центром. B , Оценки выравнивания (верхние панели) и тесты статистической значимости Z-оценки (нижние панели) для индивидуальных выравниваний лигазы L1 и спиралей рРНК разного возраста. Z-показатели были получены путем сопоставления 1000 рандомизированных последовательностей. Оценки выравнивания структур с Z-оценкой более 3 (горизонтальная пунктирная линия) являются значимыми при уровне достоверности 0,01% и окрашены в красный цвет. C , Структурный состав (круговые диаграммы) и частота (столбики) спиралей рРНК разного возраста, имеющих общие структурные особенности с рибозимами.Помечены только спирали, связанные с функциональными центрами (зеленые круги).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g006

Древние белки OB-складки, связанные с репликацией, были задействованы для ранней функции рибосом

Самые старые r-белки участвуют в различных аспектах рибосомной процессивности и внерибосомных функциях, связанных с репликацией. Например, S12 участвует в перемещении мРНК, транслокации тРНК и формирует реле сигнала, которое передает EF-Tu распознавание правильной тРНК во время декодирования [50].S17 является одним из первых белков, стабилизирующих конформации 16S рРНК, запускающие процесс сборки SSU [25]. Аналогичным образом, L3 поддерживает конформацию PTC и является аллостерическим переключателем, модулирующим связывание факторов элонгации [51], а L2, помимо важности для ассоциации субъединиц [52], связывается с РНК-полимеразой для модуляции транскрипции [53]. Примечательно, что эти первичные r-белки имеют древний структурный дизайн, OB-складку и родственные Sh4-подобные небольшие β-бочкообразные складки. Факторы инициации трансляции, белки, связывающие тРНК, включая AARS, белки, связывающие ДНК, такие как ДНК-лигаза Т7, и белки, связывающие теломеры, имеют одинаковое расположение складок [54].Следовательно, РНК-связывающие и ДНК-связывающие белки имеют общее эволюционное происхождение, предполагая, что древние r-белки и гомологи изначально были частью примитивного механизма репликации, который диверсифицировался и был кооптирован для современной трансляции. Эта древняя репликативная функция, скорее всего, включала процессивность и биосинтетическую активность, которые, как мы полагаем, сегодня остаются скрытыми в функции рибосом (рис. S7).

Постепенная эволюция функциональной новизны — ожидаемый результат

Происхождение эволюционной новизны путем рекрутирования или кооптации ранее существовавших модулей хорошо известно в классических исследованиях «эво-дево» [55], [56] и хорошо изучено в случае вторичных структур РНК [56], [57]. ], [58].Кроме того, было признано, что генетический код связывает репликацию и экспрессию генов, которые, таким образом, тесно связаны между собой [10], [12]. Наши результаты согласуются с концепцией эволюционной преемственности, где фенотипические переходы в эволюционирующих структурах РНК связаны нейтральной сетью, а небольшие изменения в последовательности приводят к новым структурам и функциям [58], [59], [60]. Многие важные аспекты существующей функции рибосом подтверждают наши выводы:

  1. Функциональная устойчивость каталитических комплексов зависит от структурной стабильности [61], [62], что является результатом «канализации» структур в сторону повышения устойчивости к возмущениям [56].Рибосомная робастность заключается в ее процессивности и в точности трансляции генетического кода [63], [64], [65]. Таким образом, устойчивость к трансляции влияет на приспособленность организма [66]. Генетический код эволюционировал, чтобы быть высокооптимизированным и отражать коэволюцию изобилия тРНК и использования кодонов [12], [67] и связан с точностью трансляции [68], которая в конечном итоге ограничивается отбором аминоацил-тРНК и транслокацией мРНК-тРНК [ 69].
  2. Кинетические исследования показали, что связывание оснований кодон-антикодон инициирует элонгацию трансляции и ускоряет индуцированное соответствие выбора субстрата.Другие управляемые матрицей ферменты, такие как РНК- и ДНК-полимеразы, используют сходные механизмы [70], [71]. Более того, перемещение тРНК в 30S-субъединице ограничивает общую скорость транслокации [72]. Таким образом, некоторая степень точности отбора тРНК необходима для синтеза белка, направленного на матрицу. Это оправдывает нашу модель эволюции современной рибосомы, основанной на структурных компонентах тРНК и SSU. Точность отбора, скорость отбора и направление транслокации тРНК-мРНК значительно усиливаются r-белками и факторами трансляции [73], [74] и подтверждают нашу интерпретацию очень ранней кооперативности РНК-белок.
  3. Наконец, во многих аспектах транслокации мРНК-тРНК во время трансляции можно найти доказательства наличия древнего тРНК-центрированного рибосомного аппарата репликации. Для точности транслокации мРНК-тРНК требуется аминоацил-тРНК в P-сайте [75], SSU-сайт E имеет решающее значение для поддержания рамки считывания [76], а вторичная структура и третичные взаимодействия в рРНК развились для специфической межсубъединичной коммуникации. это следует за деацилированием А-тРНК во время транслокации [77].

Эти аспекты согласуются с моделью «triplicase», предложенной для примитивного аппарата репликации, который потенциально может быть использован для трансляции [11], что хорошо согласуется с нашей эволюционной моделью.

Выводы

Хотя была предложена примитивная рибосома, состоящая исключительно из РНК [78], [79], маловероятно, что такая сложная РНК-машина могла существовать. Вместо этого вполне вероятно, что множественные меньшие комплексы RNP с различными функциями интегрировались во время эволюции в гораздо более сложный ансамбль RNP. Аргументы, которые поддерживают пептидный синтез первого начала трансляции, основаны на предположении, что триплетный генетический код не мог бы развиться, если бы он не имел ассоциированной функции [81].Однако происхождение эволюционной новизны из-за «функциональных сдвигов», вызванных молекулярным рекрутированием, является обычным явлением и может объяснить современную рибосомную активность. В этом исследовании мы предоставляем филогенетические доказательства, объясняющие происхождение и появление рибосом, а также важные доказательства в поддержку первичных RNP-механизмов, которые на поздних стадиях эволюции белков привели к кодированному синтезу белков. Роли древних компонентов РНП не были зафиксированы (канализованы) с самого начала и, вероятно, все еще развиваются.Наши данные согласуются с: (1) современным синтезом пептидов, возникшим как вторичный процесс, который способствовал примитивным процессивным прочтениям РНК; (2) появление трансляции из более простых, отдельных процессов, как только они собрались вокруг первичной тРНК с кодирующей способностью; и (3) замещение и окончательное поглощение первоначального темплатного комплекса путем интеграции отдельных составных частей в современное каталитическое оборудование. Мы предполагаем, что появление сложного аппарата трансляции RNP, представленного на последовательной временной шкале на рис. 7, улучшило производство и качество белков.Эти белки взяли на себя большинство функций в клетке в результате фундаментального пересмотра клеточного механизма. Такая ревизия оказала глубокое влияние на мир белков, о чем свидетельствует пунктуация на временных шкалах, описывающих эволюционную механику организации доменов в белках [80] и двухфазные паттерны в эволюции доменов [36]. Однако мы показываем, что РНК с самого начала играла решающую роль в появляющемся рибосомном RNP-комплексе, поскольку r-белки тесно эволюционировали вместе со структурой рРНК и организовывались вокруг тРНК в появляющейся системе трансляции.Мы утверждаем, что РНК может быть лучше приспособлена, чем белки, для определенных динамических функций, которые облегчаются повторным построением-разрушением взаимодействий спаривания оснований. Эти функции включают распознавание субстратов тРНК, ассоциации субъединиц и крупномасштабные движения тРНК и субъединиц [82]. С другой стороны, рРНК может быть просто случайностью истории.

Рисунок 7. Модель рибосомной эволюции.

Хронологическое представление эволюции рибосом показывает, что очень рано в рибосомной эволюции ( и <0.3) спирали рРНК взаимодействовали с r-белками с образованием ядра процессивности, которое опосредовало взаимодействие нуклеотидов, которое позже ( и  = 0,3) служило центром скоординированного и сбалансированного накопления RNP, что привело к современной рибосомной функции. Фиолетовая структура указывает на существующую мРНК, которая используется в качестве структурного эталона для определения местоположения примитивных функциональных центров. Мы предполагаем, что первичная рибосома имела репликативные функции, которые, вероятно, включали РНК, поэтому молекулу мРНК из кристаллографической модели следует рассматривать как место для древней кодирующей молекулы.рРНК представлена ​​в виде ленты, мРНК и белки представлены в виде заполняющих пространство представлений.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.g007

Методы

Данные рРНК

Последовательности и структуры LSU и SSU рРНК были получены из Европейской базы данных рибосомных РНК (ErRD) [83]. Вторичные структуры ErRD, полученные с помощью сравнительного анализа последовательностей, были загружены в формате DCSE с http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/rRNA/ (сентябрь 2005 г.), со вторичной структурой, закодированной в линиях нумерации спирали для наборов выравниваний, характерных для молекул надцарств; Археи, Бактерии или Эукарии. Линии нумерации спирали определяют соответствующие парные области каждой спирали во вторичной структуре. Всего было получено около 600 последовательностей LSU рРНК и около 20 000 последовательностей SSU рРНК после исключения более 200 частичных последовательностей. Сначала мы отобрали данные для анализа из начального исследования эволюции рРНК, которое включало 35 последовательностей, взятых из всех трех надцарств живых организмов [13].Поскольку ErRD сильно смещен в сторону бактериальных последовательностей, был выбран и использован для построения деревьев сбалансированный набор из 93 последовательностей рРНК, представляющих 31 репрезентативную молекулу вида в каждом надцарстве (таблица S5). Результаты, представленные в этой рукописи, сосредоточены на этом наборе, который включает в себя все универсальные структурные элементы (субструктуры) рРНК и основные тематические варианты вторичной структуры, существующие в молекулах. Наконец, были проанализированы все используемые последовательности, включая набор из 593 последовательностей LSU рРНК и 19 184 последовательностей SSU рРНК.Поскольку наше исследование не представляет собой систематического анализа для различения видов, подходящей стратегией является репрезентативная выборка.

Филогенетический анализ структуры рРНК

Поскольку явных филогенетических моделей эволюции структуры РНК не существует, мы реконструировали историю молекулярных субструктур в молекулах РНК с максимальной экономией (MP) (реализованной в PAUP* [84]) с использованием методов, описанных нами ранее [13], [14]. ]. Филогенетические отношения выводятся на основе общих и производных характеристик в структуре со стандартными кладистическими принципами.Вторичные структуры РНК впервые были охарактеризованы с помощью атрибутов, описывающих общую «форму» (геометрию) молекул, то есть топологию складчатых конформаций [56], [59]. В этом исследовании мы рассматриваем вторичные структуры РНК как плоские абстракции трехмерных складок и не сосредотачиваемся на других альтернативах, таких как атрибуты, которые описывают термодинамическую стабильность с использованием минимальных приращений свободной энергии Гиббса, или статистические данные, которые измеряют стабильность и уникальность молекул, которые также успешно использовались в наших анализах (например,г., [13], [14], [30]). Структуры анализируемых нами молекул были сначала разложены на субструктурные компоненты. Затем структурные особенности гомологичных субструктур (например, длина стеблей) рассматривались как линейно упорядоченные и поляризованные филогенетические признаки с несколькими состояниями. Эти символы используются для построения матриц данных для реконструкции MP-дерева. Реконструированные деревья описывают конечную молекулярную систему, в которой «листья» представляют собой отдельные структурные компоненты молекулы (текст S1).Sun и Caetano-Anollés [30] на рисунке 2 описывают пример кодирования и анализа символов. Филогенетический анализ требует трех методологических шагов (рис. 1):

(i) Кодирование символов.

Топографическое соответствие является основным критерием для определения гомологии признаков. При анализе молекулярных структур структурные элементы (субструктуры) определяются и картируются в пространстве в контексте всей молекулы (т. е. устанавливается относительное положение субструктур в молекулах рРНК), а затем проверяются, чтобы определить, представляют ли они истинные приобретенные гомологии. от общего предка.В нашем исследовании структурные особенности были закодированы как признаки мультисостояния путем установления длины и количества спиральных стеблей (S), петель-шпилек (H), выпуклых и внутренних петель (B) и непарных последовательностей (U). Состояния символов основаны на длине (количестве оснований или пар оснований) этих подструктур S, H, B и U. Обратите внимание, что неспаренные нуклеотиды иногда образуют необычные пары оснований или нековалентные взаимодействия, которые ограничивают 3D-мотивы высокого порядка [85]. Мотивы, такие как тетрапетли, псевдоузлы и взаимодействия A-минор, стабилизируют третичные и четвертичные структуры, но не учитываются для филогенетического анализа в структурных моделях этого исследования.Следовательно, кодирование символов крупнозернистой структуры высшего порядка в простой каркас из невзаимодействующих спиральных сегментов. В рРНК анализ кристаллических структур отдельных молекул рРНК или ансамбля рибосом подтверждает эту схему. Почти вся рРНК является спиральной или приблизительно спиральной, и структуру РНК можно эффективно рассматривать как трехмерное расположение спиральных элементов [20]. В то время как кодирование символов основано на правильном предсказании вторичной структуры, сравнительный анализ последовательностей на основе ковариаций оказался успешным в предсказании структур с точностью до 96% [86].Таким образом, структурные неточности на уровне вторичной структуры считались несерьезными и допускались как систематическая ошибка при условии, что структуры являются результатом одного и того же сравнительного исследования последовательностей. Кодирование рРНК было основано на моделях вторичной структуры больших и малых субъединиц, полученных с помощью сравнительного анализа последовательностей последовательностей, депонированных в ErRD [83]. Модель SSU рРНК содержит 50 универсальных спиральных стеблей и несколько стеблей, специфичных для Eukarya. Модель LSU рРНК содержит 100 универсальных стеблей и несколько других стеблей, специфичных для определенных таксонов.Эти модели надежны и подтверждены кристаллографией [30]. Для анализа использовались только спирали, присутствующие во всех трех надцарствах, и они были определены как молекулярные сегменты, разделенные либо многоразветвленными петлями (мультипетлями), либо псевдоузловыми петлями. В структурных выравниваниях перечислены символы, описывающие структуру рРНК в направлении от 5′ к 3′, как она читается в последовательности, и для каждого сегмента последовательности в порядке S, B, H и U. Были определены подструктуры стебля (S). двумя дополнительными сегментами последовательности и соответствующими символами (названными буквенно-цифровым дескриптором и его штрихом).Спирали были названы с использованием номенклатуры ErRD [83], [87] для кодирования символов и реконструкции дерева. Спирали рРНК SSU были пронумерованы S1–S50, а спирали рРНК LSU были названы с помощью A-I (соответствующие доменам рРНК ErRD LSU) и номера (например, A3, спираль 3 домена A). Эта номенклатура была согласована со стандартной номенклатурной системой Brimacombe [88], используемой в кристаллической структуре рибосомы Thermus thermophillus [31] ( см. Table S1). При филогенетическом анализе состояния признаков ограничивались максимальным числом, принятым программой филогенетического анализа (обычно 64 состояния; [84]), и представлялись числами 0–9 , регистрозависимыми алфавитами A-Z и a-z , и специальные символы @ и и .Структурным элементам длиной более 64 нуклеотидов присваивалось максимальное состояние (&), а при их отсутствии — минимальное состояние (0). Внутренний программный модуль marten [89] использовался для кодирования символов из выравниваний DCSE и для создания исполняемых файлов для PAUP*.

(ii) Аргументация персонажа.

Атрибуты характера представляют пути трансформации и гипотезы взаимоотношений, которые можно опровергнуть и связывают состояния персонажей друг с другом, используя основные эволюционные предположения или аксиомы [90].Филогенетический анализ структуры РНК опирается на очень простую модель изменения, в которой геометрические или статистические характеристики структуры (например, длина структурных элементов; значения энтропии Шеннона матрицы вероятности спаривания оснований) увеличиваются или уменьшаются, и на вспомогательном предположении ( гипотеза поляризации), что существует эволюционная тенденция к конформационному порядку. Молекулы в растворе проявляют различные степени свободы, обычно в виде трансляций и вращений (например,грамм. внутренние вращения вокруг одинарных связей) или динамические движения, определяющие различные молекулярные конформации. В РНК степени свободы заметно ограничены образованием взаимодействий водородных связей, ответственных за пары оснований. Это взаимодействие сильно расстраивает. Моделирование статистической механики успешно смоделировало формирование вторичной структуры в РНК и влияние мутации на структурные изменения [56], [57]. Мы основывали нашу гипотезу поляризации на этой модели. В пределах доступных при данной температуре свободных энергий молекула РНК сворачивается в ансамбль возможных конформаций (форм).Этот «пластический репертуар» ограничивает время, которое РНК проводит в каждой конформации. Молекулярные функции влияют на приспособленность организма и обычно связаны с определенной конформацией в пределах пластического репертуара, которые выбираются в ходе эволюционных изменений. Чем больше времени молекула проводит в благоприятных конформациях, тем большее влияние молекула оказывает на приспособленность организма. Во время селекции мутанты по последовательности оптимизируют сворачивание до меньшего количества термически доступных конформаций, большинство из которых напоминают мишень и наиболее стабильны, проводя в них больше времени.Более того, количество конформаций, доступных мутантам, также уменьшается и сворачивается почти до мишени. Этот «блокирующийся» процесс структурной канализации является автокаталитическим и определяет общую эволюционную тенденцию молекул РНК к уникальности, большей стабильности и модульности. Здесь мы используем эту тенденцию как гипотезу поляризации характера, рассматривая состояния характера, соответствующие повышенному структурному порядку, как наследственные (плезиоморфные). Хотя эту гипотезу можно опровергнуть, термодинамические, молекулярно-механические и филогенетические соображения дают значительные теоретические и экспериментальные доказательства в поддержку тенденции поляризации.Эти аргументы были недавно обобщены [91], а некоторые из них вновь рассмотрены здесь: (a) Термодинамические аргументы . Термодинамическая теория эволюции [92], [93] развивает общие принципы, применимые к биологическим системам всех иерархий, от молекулярных ансамблей до экосистем [94]. Согласно этой теории, биологические системы самоорганизуются и имеют тенденцию увеличивать порядок и сложность системы, рассеивая беспорядок в своем окружении. Эти термодинамические принципы, обобщенные для учета неравновесных условий, экспериментально подтвердили молекулярную тенденцию к порядку и стабильности, приводящую к биологическим изменениям [95].(b) Молекулярно-механические аргументы . Большое количество теоретических данных, отображающих структурный репертуар эволюционирующих последовательностей РНК с энергетической и кинетической точек зрения, подтверждает, что эволюция усиливает конформационный порядок и уменьшает конфликтные молекулярные взаимодействия [56], при этом некоторые важные предсказания подтверждаются экспериментально [58], [96]. Исследования существующих и рандомизированных последовательностей РНК также показали эти тенденции. Рандомизация моно- и динуклеотидов в одноцепочечных нуклеиновых кислотах использовалась для оценки влияния состава и порядка нуклеотидов на стабильность свернутых молекул, раскрывая эволюционные процессы, действующие на уровне ДНК и РНК [97].В недавних экспериментах существующие эволюционировавшие молекулы РНК, кодирующие сложные функциональные структурные складки, сравнивали с олигонуклеотидами, соответствующими рандомизированным аналогам [98]. В отличие от эволюционировавших молекул, произвольные последовательности были склонны к множеству конкурирующих конформаций. В отличие от произвольных белков, которые редко складываются в хорошо упорядоченные структуры [99], эти произвольные последовательности РНК, тем не менее, были достаточно растворимыми и компактными. Они оказались ограниченными физико-химическими ограничениями, такими как состав нуклеотидов, которые были установлены в предыдущих вычислительных исследованиях [96].(c) Филогенетические аргументы . Тенденции к структурному порядку и гипотеза об укоренении деревьев были экспериментально подтверждены филогенетической конгруэнтностью между деревьями, генерируемыми из последовательности РНК, и деревьями, генерируемыми из структуры [12], [13], [100], в дополнение к конгруэнтности между филогениями, генерируемыми из геометрической и статистические признаки [30], [99], [101]. Поляризация символов в противоположном направлении привела к тому, что деревья были менее экономными и имели топологию, несовместимую с традиционной таксономией.Филогенетические анализы, проверяющие гипотезы организменного происхождения, полученные из глобальных деревьев структур тРНК и анализа ограничений [102], и филогении протеомов, полученные из анализа белковых структур во всех геномных комплементах [33], оказались конгруэнтными. Они обеспечивают дополнительную косвенную поддержку нашей гипотезы поляризации. Интересно, что мы обнаружили значительные изменения состояния признаков, например, вдоль базальных ветвей деревьев винтовых подструктур и в некоторых других местах дерева (рис. S8).Это говорит о том, что наследственное размещение базальных спиралей (например, h54) не является результатом того, что спирали длиннее или из-за артефакта «притяжения длинных ветвей». Это также показывает, что стабильность и фрустрация субструктур действительно являются важными и конгруэнтными факторами, формирующими структуру рРНК. Поскольку многие из этих структурных компонентов функционально важны, повышенная частота изменения состояния признаков может отражать различные приспособления, уникальные для организмов в разных средах, участвующих в регуляции процесса трансляции.

(iii) Филогенетическая реконструкция.

Филогенетические деревья, описывающие эволюцию структурных элементов рРНК, были окончательно построены с использованием МП в PAUP* v. 4.0-b10 [85]. В этом исследовании мы представляем деревья, описывающие эволюцию спиральных стеблей рРНК, поскольку стебли отвечают за трехмерные паттерны молекулярной аккреции, которые в основном определяются взаимодействием спаривания оснований. Результаты, полученные с использованием деревьев других структурных компонентов (H, B и U), информируют об эволюции неспаренных сегментов молекул рРНК и будут описаны в другом месте.Команда ancstates была вызвана для определения родовых состояний персонажей и полярности трансформации персонажей. Деревья были получены в результате эвристического поиска с использованием замены ветвей дерева пополам и повторного соединения (TBR) и простой последовательности добавления. Филогенетическую достоверность проверяли методом непараметрической начальной загрузки, реализованным с использованием 5000 псевдоповторений. Упражнения по реконструкции характера выполнялись с помощью macclade [103]. Топологии деревьев были проанализированы с использованием подсчета N_bar и вишни, статистических данных, которые предоставляют информацию о симметрии и процессах видообразования в деревьях.N_bar — это количество внутренних узлов между основанием и вершинами дерева [104], а число вишен — это количество внутренних узлов, которые имеют только конечные листья в качестве дочерних элементов [105]. Эти статистические меры дисбаланса были реализованы в TreeStat v. 1.2 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/treestat/) для деревьев субструктур РНК, случайных деревьев, сгенерированных из структурных данных с использованием PAUP*, и деревьев. которые следуют модели единообразного видообразования (Yule), созданной с использованием Mesquite v 2.75 [106]. Поскольку наш метод создает сильно несбалансированные укорененные деревья и отвергает модели Йоля и модели случайного видообразования (текст S1), относительный возраст (происхождение) отдельных структурных элементов в деревьях можно приблизительно определить путем измерения расстояния в узлах ( и ). ) от гипотетического предка (корня) в относительной шкале времени 0–1. и подсчитывают количество кладогенных событий (узлов) вдоль каждой из линий дерева, начиная с первого события (корня) и заканчивая листьями. Мы рассчитали значения и с помощью Perl-скрипта, который подсчитывал количество внутренних узлов вдоль линии от корня до конечного узла (листа) данного корневого дерева с помощью следующего уравнения: nd a  = (# внутренних узлов между узлами r и a )/(число внутренних узлов между узлами r и m ), где a — целевой конечный узел, r — гипотетический корневой узел, и m — это листовой узел, который имеет максимально возможное количество внутренних узлов из узла r .Следовательно, -е и -е значение наиболее предкового таксона (спирали) равно 0, а значение самого последнего равно 1. Мы отмечаем, что когда видообразование (в нашем случае структурное видообразование) зависит от развивающегося «наследуемого» признака (например, накопление мутационных изменений в структурных особенностях РНК) ожидается, что результирующие филогении будут сильно несбалансированными [107]. При таких обстоятельствах и становятся хорошим показателем времени, если коэффициенты диверсификации не различаются между родословными.Мы также отмечаем, что моделирование, включающее соображения статистической механики, показало, что изменения в структуре РНК, как правило, носят прерывистый характер, а мутации приводят к длительным периодам застоя (когда молекулы дрейфуют в нейтральных сетях), за которыми следует внезапный адаптивный прогресс, вызванный структурными преобразованиями [59].

Выравнивание структуры между

In Vitro Сконструированными рибозимами и рРНК

Для обнаружения отдаленных гомологий между структурными элементами рРНК и рибозимными двойниками мы использовали программу выравнивания структуры RNAforester [108].RNAforester предназначен для парного и множественного выравнивания вторичной структуры РНК и способен обнаруживать сходные структурные мотивы исключительно на основе консервативной структуры, независимо от сохранения положения и последовательности. Процедура выравнивания, по сути, эквивалентна алгоритму Смита-Уотермана (SW) [109], но применима к структурам РНК. Однако, в отличие от алгоритма SW, схема оценки зависит от расстояний редактирования, а не от расстояний выравнивания, и вклад последовательности в оценку незначителен.Обратите внимание, однако, что, хотя оценка основана исключительно на структурном сходстве, информация о последовательностях может использоваться для улучшения выравнивания.

Чтобы упростить упражнение по сравнению структур и свести к минимуму влияние вариаций последовательностей в большом количестве последовательностей рРНК, использованных в исследовании, гипотетические последовательности и структуры предков рРНК SSU и LSU были реконструированы с использованием методов максимального правдоподобия, реализованных в PAUP*. Мы пришли к выводу, что реконструированная модель лучше, чем модель консенсуса.Процесс реконструкции последовательности и структуры обобщен на рисунке S5. Филогенетические деревья молекул рРНК, описывающие эволюцию 102 молекул SSU или LSU рРНК (представляющих организмы трех надцарств жизни), были реконструированы с использованием структурных данных, как описано ранее. Затем соответствующие выравнивания последовательностей DCSE были преобразованы в формат FASTA и NEXUS с помощью SeqVerter (GeneStudio Inc., Сувани, Джорджия, США) для использования с PAUP*. Последовательности предков для гипотетических предков в корне деревьев были определены путем реконструкции состояний символов всех внутренних узлов с помощью функции «описать деревья» и методов максимального правдоподобия в PAUP*.Наиболее подходящая модель нуклеотидной замены (GTR+I+G) была выбрана с помощью AIC с jModeltest v 0.1.1 [110]. Реконструированные последовательности вручную согласовывали с выравниванием DCSE, чтобы получить выравнивание на основе вторичной структуры рРНК. Затем структура была вручную закодирована в венский формат для использования с RNAforester. Аналогичные реконструкции были получены для тРНК (из анализа 571 последовательности).

Структуры рибозимных двойников (рибозимы L1-лигазы, РНК-полимеразы и аминоацил-тРНК-синтетазы) и реконструированные структуры SSU рРНК, LSU рРНК и тРНК были дополнительно разложены на отдельные спирали, как определено вторичными структурами, кристаллическими структурами и критериями. изложено выше.Разложенные структуры рРНК соответствовали спиралям, использованным в филогенетическом анализе, и сохранили петли шпилек, внутренние петли и выпуклости этих эволюционных структурных единиц. Парные локальные выравнивания выполняли с каждой спиралью рРНК и каждой двойной спиралью рибозима. Оценки выравнивания сравнивались, чтобы определить, какие выравнивания имели наилучшие совпадения. Затем наносили на график баллы для отдельных спиралей рРНК в зависимости от возраста спирали ( и ). Чтобы установить статистическую значимость этих выравниваний, фоновая модель структур, полученных из рандомизированных последовательностей двойников и контрольной тРНК, также была сопоставлена ​​со спиралями рРНК.Всего было создано 1000 рандомизированных последовательностей, сохраняющих частоту динуклеотидов и состав последовательности, как описано ранее [111]. Вторичные структуры рандомизированных последовательностей были выведены с использованием RNAfold из пакета Vienna RNA Package v1.8.4 [112]. Полученные структуры выравнивали по реконструированным спиралям рРНК с помощью RNAforester, и определяли статистически значимое выравнивание с использованием статистики Z-оценки. Z-показатели обычно используются в качестве меры статистической значимости выравниваний, когда статистика ожидаемого значения (e-value) недоступна [113].Пороговый Z-показатель 3,0 использовался для определения того, были ли показатели сходства показателей выравнивания статистически значимыми при уровне достоверности 0,01.

Филогеномный анализ структуры белковых доменов и происхождения r-белков

Общая схема, примененная к эволюционному изучению структуры рРНК, была применена к эволюционному изучению структур белковых доменов [15], [33]. Схема проиллюстрирована на рисунке 1. Сначала мы провели перепись геномных последовательностей у 749 организмов, которые были полностью секвенированы (52 вида архей, 478 видов бактерий и 219 эукариальных видов), приписывая белковые структурные домены на уровне структурной сложности FSF белковым последовательностям, используя линейные HMM структурного распознавания в суперсемействе [114] и пороги вероятности E из 10 −4 .Домены были определены SCOP версии 1.73 [115], [116] и описаны с использованием строк краткой классификации SCOP ( ccs ). Дескрипторы ccs являются широко используемыми символическими представлениями доменов в иерархии структурной классификации (например, гидролаза P-петли FSF названа c.37.1, где c представляет класс белка, 37 — укладку и 1 — FSF). Признаки, которые численно характеризуют геномную численность каждого FSF ( г ), использовались в качестве признаков для построения матриц данных для филогенетического анализа. г указывает количество множественных вхождений домена FSF в протеоме. Эмпирически значения g варьируются от 0 до тысяч и напоминают морфометрические данные с большой дисперсией [116], [117]. Поскольку существующие филогенетические программы могут обрабатывать только ограниченное число состояний филогенетических признаков, пространство g значений в матрице было уменьшено с использованием стандартной методики пробельного кодирования, разработанной для кладистического анализа морфометрических данных [118]. Мы использовали следующую формулу для преобразования данных, где a и b обозначают FSF и протеом соответственно. г ab представляет собой значение г FSF a в протеоме b и г ab_max указывает максимальное значение г ab в протеоме всех г ab в протеоме FSF1. Эта функция округления масштабирует g ab до диапазона 0–20, а 21 нормализованное значение g представляют состояния символов и кодируются в формате нексуса как линейно упорядоченные и поляризованные филогенетические символы с несколькими состояниями с использованием буквенно-цифрового набора чисел 0–9. и буквы AK, совместимые с PAUP*.Состояния признаков были поляризованы от «К» до «0» с помощью команды ancstates в PAUP* на основе двух фундаментальных предпосылок: (1) структура белка гораздо более консервативна, чем последовательность, и несет значительный филогенетический сигнал, особенно на высоких уровнях структурной организации это исследование (FSF) и (2) FSF, которые успешны и популярны по своей природе, как правило, более унаследованы от предков, что делает «K» самым древним состоянием персонажа, а «0» — самым последним. Детали и поддержка аргументации характера и отсутствие цикличности в предположениях были описаны и обсуждены ранее [15], [33], [80], [119].

По матрицам с использованием MP в качестве критерия оптимальности в PAUP* построено

универсальных филогенетических дерева структуры белковых доменов и укоренено по методу Лундберга [85]. Поскольку деревья большие, а поиск древовидного пространства сложен в вычислительном отношении, мы использовали комбинированный храповой алгоритм экономии (PR) и многократный итеративный подход к поиску, чтобы упростить реконструкцию дерева и избежать риска захвата оптимальных деревьев неоптимальными областями древовидного пространства [1]. 44], [80]. Недавний обзор резюмирует общий подход и развитие данных переписи и реконструкции деревьев за последние годы [120].Поскольку деревья укоренены и сильно не сбалансированы, мы развернули относительный возраст белковых доменов непосредственно для филогенеза как расстояние в узлах ( nd P ) от гипотетической наследственной структуры в основании дерева в относительных 0– 1, по существу, как мы описали для деревьев структур рРНК. Домены r-белка были нанесены на карту в виде деревьев структур доменов FSF, и их соответствующие значения nd P были рассчитаны для раскрытия относительного возраста r-белка. nd P может быть хорошей мерой возраста, учитывая укоренившееся дерево, поскольку полуточечное появление белковых доменов (т.е. таксонов) проявляется в их способности дивергировать (кладогенез или молекулярное видообразование), а не в количестве признаков изменение состояния, существующее в ветвях дерева (длины ветвей) [117]. Мы отмечаем, что, хотя деревья и временные шкалы, полученные из обилия или появления доменов в геномах, существенно не отличались, филогенетический анализ зависит, например, от точности и баланса геномных баз данных (особенно в отношении того, насколько они репрезентативны для биосферы), эффективности и точности. присвоение структур белковым последовательностям и методы реконструкции филогенетического дерева.Однако мы не ожидаем, что эффект предвзятости (например, ошибочное обнаружение FSF с HMM, чрезмерная представленность организмов в надцарствах) серьезно повлияет на выводы этого исследования (обсуждается в [15]).

В наборе данных универсальных r-белков (таблица S3) большинство белков состоят только из одного домена. В этом случае возраст белка — это возраст домена. Однако r-белки L2, S3, S5, L11 и L10 состоят из двух доменов. В этом случае второй домен, добавленный к белку, мог быть древним доменом, который был кооптирован, или это мог быть новый домен, который был рекрутирован для усиления старой функции.Чтобы различить эти два возможных сценария, мы исследовали дерево доменов и комбинаций доменов, созданное Wang и Caetano-Anollés [80], и определили фактический возраст двухдоменных белков и соответствующих однодоменных доменов. Например, два домена L2 имеют разные nd P в дереве доменных структур (L2-N с доменной структурой b.40.4, nd P  = 0; L2-C с b. 34.5 структура, nd P  = 0.29). Используя опубликованное дерево комбинаций доменов на уровне FSF, находим, что комбинация b.40.4|b.34.5 в L2 моложе ( nd P  = 0,306), чем домен b.40.4 L2-N ( nd P  = 0,037), но старше домена b.34.5 L2-C ( nd P  = 0,347) и его перестановки b.34.5|b.40.4 ( nd   P ). Следовательно, более старый домен был кооптирован, а возраст слияния и деления L2 отнесен к возрасту более молодого домена в дереве доменных структур, т.е.е. P L2-C. Аналогичное обоснование использовалось для других сценариев перегруппировки. Когда эта информация была недоступна, мы определяли возраст более молодого домена по дереву доменных структур (рис. 4), поскольку слияние доменов в этом случае не могло произойти до появления более нового белка.

Поскольку взаимодействия белков линейно соответствуют возрасту спиралей рРНК примерно до времени второго перехода, после которого происходит быстрый всплеск открытия новых FSF (рис. 4), мы связали возраст спиралей рРНК ( nd ) с возрастом r-белков ( nd P ), появившихся в конце эволюции, путем построения графика nd vs. nd P и интерполирующие взаимодействия (рис. 4).

Построение эволюционных тепловых карт

Чтобы лучше визуализировать относительный возраст различных элементов рибосомного ансамбля и понять, как функции связаны с этими структурными элементами, вторичные структуры рРНК Thermus thermophillus , соответствующие кристаллической структуре рибосомы 70S (записи PDB 1GIX и GIY) и кристаллические структуры рРНК или рибосомный ансамбль T.70S рибосомы thermophillus (записи PDB 2WDK и 2WDL) окрашивали в цвета, соответствующие возрасту спиралей рРНК ( и ) и/или r-белков ( и , P ) и визуализировали с помощью стандартного программного обеспечения для молекулярной визуализации. Цветовая шкала RGB, соответствующая и значениям 0–1 с интервалом 0,01, была создана в matplotlib [121] с использованием скриптов, доступных на http://matplotlib.sourceforge.net/gallery.html, и использовалась для окрашивания вторичной структуры. модели.В то время как кристаллические структуры были одинаково окрашены, FSF r-белков представляют лишь небольшое подмножество структур в дереве доменов FSF, и значения r-белка nd P (диапазон nd P  = 0,018 –0,534) были нормализованы с помощью скрипта perl к временной шкале 0–1 для цветовой шкалы. Наконец, трехмерные эволюционные тепловые карты были визуализированы с использованием пакета UCSF Chimera из Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics Калифорнийского университета в Сан-Франциско [122], [123], [124].

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Эволюция структуры рРНК в отдельных субъединицах рРНК. Универсальные деревья спирали SSU RRNA (39,136 ступеней; Ci = 0,835, Ri = 0,971; Hi = 0,165; G 1 = -192,8) и спирали LSU RRNA (138 582 шагов; Ci = 0,265, Ri = 0,751; Hi = 0,735 ; g 1  = −24,5) были реконструированы по структурным данным в 19 184 и 593 последовательностях ErDB соответственно. Единичные наиболее экономные деревья были сохранены после эвристического поиска с заменой ветвей TBR и простой последовательностью добавления в обоих случаях.Топология деревьев согласуется с соответствующими поддеревьями, реконструированными на основе данных, использованных для построения дерева спиралей рРНК SSU и LSU на рисунке 2. Топологическая конгруэнтность, измеренная с использованием нескольких метрик сравнения деревьев и инструментов рандомизации, реализованных в компоненте, случайным отклонением топологического совпадения ( p <0,01). Например, деревья спиралей SSU рРНК, сгенерированные из 19 184 последовательностей ErDB и 93 наборов последовательностей, были в основном конгруэнтны (расстояние раздела, PD = 60; симметричная разница, SD = 0.118 и SD = 0,179 для триплетного и квартетного анализа соответственно). Симметричная разность Робинсона и Фулдса также подтверждает значительную топологическую конгруэнтность между деревьями (60 и 185 для деревьев SSU и LSU соответственно). Узлы со значениями поддержки Boostrap (BS)> 50% помечены.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s001

(PDF)

Рисунок S2.

Сравнение филогенетической модели (ФМ) и модели А-минорного взаимодействия (АМ) эволюции рибосом. Хронологическое представление эволюции LSU рРНК показывает, что наша PM, основанная на филогении как LSU, так и SSU рРНК, в целом согласуется с AM, основанной исключительно на анализе A-минорных взаимодействий в LSU рРНК ([31] в Text С2). Относительный возраст LSU-сегментов рРНК ( и ) был разделен на пять временных точек, соответствующих числу стадий АМ. Аккреция определяется количеством сегментов LSU, добавляемых на каждом этапе эволюции. За исключением компонентов, участвующих в рибосомной процессивности, PM в целом соответствует AM.PTC выделен более светлым оттенком соответствующих и . Спираль, отмеченная звездочкой в ​​PM, которая появляется поздно в AM, не имеет значения и , поскольку она специфична для бактерий и не была включена в филогенез. рРНК SSU заштрихована серым цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s002

(PDF)

Рисунок S3.

Соответствие между возрастом r-белков и возрастом первой взаимодействующей спирали рРНК. FSF r-белков представляет собой небольшое подмножество FSF, которые известны со значениями nd P в диапазоне 0,018–0,534. Для определения возраста r-белков ( nd P ) по отношению к возрасту взаимодействующей спирали рРНК ( nd ) использовали метод интерполяции. На рисунке показано, что взаимодействия белков следуют линейному соответствию со спиралями рРНК. Начиная с самого старого белка и первой взаимодействующей спирали, соответствие сохраняется до точки второго перехода, после чего происходит быстрый всплеск открытия новых FSF.Таким образом, схема соответствия nd P и nd прерывается. Чтобы определить соответствие между самыми молодыми r-белками и самыми молодыми спиралями рРНК, мы интерполировали их значения nd P на наклоне. Значения nd P и nd даны для всех универсальных r-белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s003

(PDF)

Рисунок S4.

Эволюционная тепловая карта, показывающая относительный возраст r-белков SSU и LSU во всем рибосомном ансамбле. Правая панель повернута на 180 градусов относительно левой панели. Спирали рРНК окрашены в соответствии с их соответствующими номерами и , как на рис. 1, и r-белки окрашены в соответствии с их соответствующими и P , как на рисунке 5. r-белки и P были масштабированы до шкалы 0–1, как показано на рисунке S2. Это показывает, что более старые r-белки связаны со старыми спиралями рРНК. Самые старые r-белки S12, S17, L3 и L2 связаны с самыми старыми спиралями рРНК, участвующими в процессивности и PTC.Большинство новых белков находятся на периферии функциональной сборки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s004

(PDF)

Рисунок S6.

Структурное сходство гипотетических спиралей рРНК и in vitro эволюционировавших рибозимных двойников. Представлены результаты полного эксперимента по выравниванию. Графики с оценками выравнивания (верхние панели) и Z-оценками (нижние панели) показаны для всех субструктур в трех проанализированных рибозимах и контрольной природной молекуле РНК.Z-показатели были получены путем сопоставления 1000 рандомизированных последовательностей. Оценки выравнивания структур с Z-оценкой более 3 (горизонтальная пунктирная линия) являются значимыми при уровне достоверности 0,01%, а значимые совпадения на верхних панелях окрашены в красный цвет.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s006

(PDF)

Рисунок S7.

Возможные сценарии и вероятность возникновения рибосомных функций. Эволюционный путь, ведущий к появлению перевода, вероятно, будет сложным и потребует открытия множества эволюционных новшеств.Важными среди этих новшеств являются способность копировать молекулы и генетически кодировать продукты (pro) и способность биосинтезировать сложные полимеры (bio). Такие инновации рассматриваются здесь как естественный результат первобытной химии, и при таком сценарии появление сложных функций маловероятно. Точно так же маловероятно, что многокомпонентный молекулярный комплекс, содержащий несколько функциональных процессов, необходимых для современной трансляции, мог появиться в одном или нескольких событиях эволюционной новизны.Наоборот, более вероятно, что эволюция рибосомных функций развивалась постепенно путем медленного приращения молекулярных структур, существовавших ранее в других молекулярных контекстах. Трансляция включает в себя несколько механистических и функциональных этапов и множество других участников, помимо рибосомы, которые могли бы постепенно рекрутироваться из более простых ранее существовавших молекулярных компонентов (про’, био’) для выполнения родственной, но механически более сложной функциональной задачи. Результаты, представленные в этом исследовании, согласуются с этим постепенным эволюционным сценарием.В то время как рекрутирование должно было сочетаться с процессами постепенной молекулярной эволюции, решающие революционные переходы благоприятствовали процессу функционального возникновения, заменяя нерибосомно синтезированные полипептиды значительно улучшенными аналогами. Замена древних нерибосомных протеинсинтетаз, не использующих матрицу для синтеза белков или их предшественников, и рекрутирование древних компонентов репликации на современные процессивные и матричные функции наиболее вероятны и совместимы с диаграммами на рисунке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032776.s007

(PDF)

Биоортогональная неканоническая аминокислотная маркировка (BONCAT) позволяет проводить анализ синтеза белка в нативной растительной ткани с временным разрешением | Физиология растений

Аннотация

Протеомная пластичность лежит в основе реакции растений на стресс, и понимание такой реакции требует точного измерения степени, в которой уровни белков регулируются для противодействия внешним раздражителям.Здесь мы адаптируем биоортогональную неканоническую аминокислотную маркировку (BONCAT) для изучения синтеза белка в вегетативных проростках Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ). BONCAT основан на трансляционном включении неканонического аминокислотного зонда в клеточные белки. В этом исследовании зондом является суррогат Met азидогомоаланин (Aha), который несет реактивный азидный фрагмент в своей аминокислотной боковой цепи. Азидная ручка в Aha может быть выборочно конъюгирована с красителями и функционализированными гранулами, чтобы обеспечить визуализацию и обогащение вновь синтезированных белков.Мы показываем, что BONCAT достаточно чувствителен для обнаружения белков арабидопсиса, синтезированных в течение 30-минутного интервала, определяемого импульсом Aha, и что этот метод может быть использован для обнаружения белков, синтезированных в условиях светового стресса, осмотического шока, солевого стресса, теплового стресса и восстановление после теплового стресса. Кроме того, мы установили, что BONCAT можно сочетать с тандемной жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией для идентификации и количественного определения белков, синтезированных во время теплового стресса и восстановления после теплового стресса. Наши результаты согласуются с моделью, в которой при возникновении теплового стресса трансляция быстро перепрограммируется для усиления синтеза средств, смягчающих стресс, и снова изменяется во время восстановления.Все эксперименты проводились с коммерчески доступными реагентами, что подчеркивает доступность метода BONCAT для исследователей, интересующихся реакцией на стресс, а также трансляционной и посттрансляционной регуляцией у растений.

Ожидается, что повышенные температуры, ограниченные водные ресурсы и высокие концентрации солей в пахотных почвах окажут серьезное и все более сильное влияние на продуктивность сельскохозяйственных культур в ближайшие годы (Mickelbart et al., 2015). Для решения этой глобальной проблемы было использовано несколько многообещающих стратегий селекции и генной инженерии с использованием маркеров (Kasuga et al., 1999; Лопес и Рейнольдс, 2010 г.; Микельбарт и др., 2015). Например, HVA1 , ген позднего эмбриогенеза ячменя ( Hordeum vulgare ), который замедляет увядание листьев, был экспрессирован в пшенице ( Triticum aestivum ; Sivamani et al., 2000), рисе ( Oryza sativa ). ; Xu et al., 1996) и кукурузы ( Zea mays ; Nguyen and Sticklen, 2013) для получения солеустойчивых линий с более высокой эффективностью использования воды. Несмотря на эти ранние и многообещающие успехи, выбор мишеней остается серьезной проблемой, связанной с генной инженерией и селекцией с использованием маркеров (Bita and Garets, 2013).Дальнейшее понимание физиологических механизмов, управляющих устойчивостью к стрессу и адаптацией, улучшит наши возможности по рациональному выращиванию сельскохозяйственных культур.

Протеомная пластичность является отличительной чертой реакции растений на стресс и впервые была продемонстрирована более 35 лет назад путем включения аминокислот с радиоактивной меткой в ​​белки, синтезируемые во время анаэробного стресса у кукурузы (Sachs et al., 1980) и теплового стресса у сои ( Глицин max ; Key et al., 1981). С достижениями в идентификации пептидов на основе масс-спектрометрии были разработаны новые стратегии для измерения степени, в которой уровни белка регулируются в ответ на внешние раздражители (Huot et al., 2014; Фриштедт и др., 2015). Но у этих технологий есть ограничения, которые по большей части дают информацию об изобилии белка в стационарном состоянии. Более того, традиционные стратегии протеомики дробовика обеспечивают меньший охват в образцах, в которых преобладает несколько очень распространенных белков. Например, Rubisco составляет от 30% до 60% протеома листа и препятствует обнаружению менее распространенных белков в образцах листьев (Kim et al., 2013). Чтобы конкретно решить эту проблему, Kim et al. (2013) разработали метод осаждения сульфата протамина для селективного истощения Rubisco и, таким образом, обогащения менее распространенными белками.Импульсное мечение стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре было введено для мониторинга синтеза белка de novo, но плохое включение метки помешало его широкому внедрению в растительных системах. Другие методы дифференциальной протеомики, включая мечение стабильными изотопами аминокислотами в клеточной культуре (Lewandowska et al., 2013), гидропонное изотопное мечение целых растений (Bindschedler et al., 2008), мечение 13 CO 2 (Chen et al. al., 2011) и изобарические метки для относительного и абсолютного количественного определения (Ge et al., 2013), появились в последние годы в качестве инструментов для исследования синтеза белка in vivo в растениях. Примечательно, что мультиплексные количественные оценки с такими методами, как изобарические метки для относительного и абсолютного количественного определения, по своей сути проблематичны из-за известных проблем с интерференцией при использовании источников с ионной ловушкой (McAlister et al., 2014). Современные инструменты с возможностями MultiNotch MS3 могут преодолеть эти ограничения, но налагают значительные ограничения на чувствительность (McAlister et al., 2014). Приборы, необходимые для таких сложных экспериментов, дороги и ограничивают широкое применение.

Идентификация белков, которые транслируются в короткие промежутки времени, остается сложной задачей, поскольку такие белки составляют небольшую часть всего протеома. В то время как транскриптомные подходы обеспечивают хорошее временное разрешение (в минутной шкале; Kreps et al., 2002; Preston et al., 2009), обилие транскриптов и уровни белка часто не согласуются (Vélez-Bermúdez and Schmidt, 2014; Fukao, 2015). . Трансляция аффинной очистки рибосом (Zanetti et al., 2005; Mustroph et al., 2009; Jiao and Meyerowitz, 2010), с последующим количественным определением мРНК или картированием рибосомного следа (Juntawong et al., 2014), обеспечивает прокси для синтеза белка в определенные моменты времени в процессах окружающей среды или развития. Тем не менее, измерения ассоциации мРНК с рибосомами и методы футпринтинга могут по-прежнему не давать точной информации об изменениях в протеоме из-за артефактов, возникающих на этапах сбора и лизиса (Ingolia, 2014) и оборота после синтеза белка.Чтобы дополнить существующий инструментарий химической биологии для протеомики растений, мы представляем биоортогональную неканоническую аминокислотную маркировку (BONCAT), которая позволяет точно обнаруживать и идентифицировать белки, синтезированные в течение определенных временных интервалов.

В методе BONCAT неканоническая аминокислота импульсно вводится в интересующие клетки, где она включается во вновь синтезированные белки. Здесь мы использовали суррогат Met азидогомоаланин (Aha), который несет азидную группу, поддающуюся биоортогональной клик-химии (рис.1). Биоортогональная клик-химия относится к набору реакций, которые являются быстрыми и высокоселективными в сложных биологических условиях и которые можно проводить в мягких условиях (Sletten and Bertozzi, 2009; McKay and Finn, 2014). Импульсное мечение с помощью Aha позволяет исследователю использовать селективность азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого медью (CuAAC), и азидно-алкинового циклоприсоединения, стимулируемого штаммом (SPAAC), для визуализации и обогащения вновь синтезированных белков (рис. 1).

Рис. 1.

Схема BONCAT в нативных тканях растений. Aha пульсирует в надземных тканях, где он может быть включен в зарождающиеся белки. Азид обеспечивает конъюгацию с флуорофорами или гранулами для визуализации или обогащения соответственно. CuAAC использовали для конъюгации алкина TAMRA с зарождающимися белками. SPAAC (биосовместимая «щелчковая реакция») применяли для конъюгации зарождающихся белков с шариками для обогащения.

Рис. 1.

Схема BONCAT в нативных тканях растений. Aha пульсирует в надземных тканях, где он может быть включен в зарождающиеся белки.Азид позволяет конъюгировать с флуорофорами или гранулами для визуализации или обогащения соответственно. CuAAC использовали для конъюгации алкина TAMRA с зарождающимися белками. SPAAC (биосовместимая «щелчковая реакция») применяли для конъюгации зарождающихся белков с шариками для обогащения.

BONCAT применялся для изучения реакций всего протеома в культурах млекопитающих и микробов (Dieterich et al., 2006; Zhang et al., 2014; Bagert et al., 2014) и для анализа субпопуляций клеток сложных многоклеточных эукариот ( Эрдманн и др., 2015; Генхеден и др., 2015; Yuet et al., 2015), но еще не применялись в растительных системах. Здесь мы применили BONCAT к Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) для визуализации белков, синтезированных в течение 3 часов после наложения четырех значительных абиотических возмущений: световой стресс (сдвиг в темноту), высокая температура, солевой и осмотический стресс. Кроме того, мы соединили обогащение с помощью BONCAT с тандемной жидкостной хроматографией и масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) для идентификации белков, синтезированных de novo во время кратковременного теплового стресса и периода восстановления.Результаты нашего скрининга согласуются с моделью, в которой клеточные энергетические ресурсы быстро направляются для оптимизации защитной реакции в начале стресса. Мы предполагаем, что BONCAT должен быть широко полезен при исследовании физиологии растений и пластичности развития.

РЕЗУЛЬТАТЫ

BONCAT можно использовать для маркировки недавно синтезированных белков в проростках арабидопсиса

Мы импульсно вводили Aha (1 мм) в 5-дневные проростки (см. «Методы») и оставляли мечение на срок до 3 часов (рис.2). Чтобы определить, поглощается ли Aha и включается ли он во вновь синтезированные белки, мы сначала мацерировали воздушные ткани проростков, подвергшихся воздействию Aha, выращенных в нестрессовых условиях с жидким азотом, а затем ресуспендировали полученный порошок в простом трис-буфере, содержащем SDS. Общий белок выделяли с помощью преципитации хлороформ-метанол, ресуспендировали в трис-буфере и обрабатывали TAMRA-алкином (рис. 2) в условиях CuAAC для конъюгации флуорофора с Aha-мечеными белками (рис.1). Затем мы разделили белки с помощью одномерного SDS-PAGE и измерили флуоресценцию в геле (рис. 2B). Только Aha-меченые белки метятся флуорофором (рис. 2, Б и В). Мы наблюдали световую маркировку в воздушных тканях всего за 30 минут (рис. 2Б). Эти результаты подтверждают, что Aha транспортируется в интактные ткани и активируется эндогенной метионил-тРНК-синтетазой.

Рис. 2.

A. Датчики, использованные в этом исследовании. Aha представляет собой суррогат Met, содержащий азидную группу, которая делает меченые белки поддающимися циклоприсоединению с флуоресцентными алкинильными зондами (5,6-TAMRA алкин) и напряженными циклооктиновыми реагентами (DBCO-агароза).B, Включение Aha в формирующиеся белки надземных тканей проростков арабидопсиса во времени. TAMRA-алкин был конъюгирован с недавно синтезированными Aha-мечеными белками, чтобы сделать их флуоресцентными. Гель визуализировали с помощью возбуждающего лазера при 532 нм и полосового пропускающего фильтра при 580 нм. C, контроль загрузки. После измерения флуоресценции гель окрашивали коллоидным синим, чтобы подтвердить равную загрузку.

Рис. 2.

A. Датчики, использованные в этом исследовании. Aha представляет собой суррогат Met, содержащий азидную группу, которая делает меченые белки поддающимися циклоприсоединению с флуоресцентными алкинильными зондами (5,6-TAMRA алкин) и напряженными циклооктиновыми реагентами (DBCO-агароза).B, Включение Aha в формирующиеся белки надземных тканей проростков арабидопсиса во времени. TAMRA-алкин был конъюгирован с недавно синтезированными Aha-мечеными белками, чтобы сделать их флуоресцентными. Гель визуализировали с помощью возбуждающего лазера при 532 нм и полосового пропускающего фильтра при 580 нм. C, контроль загрузки. После измерения флуоресценции гель окрашивали коллоидным синим, чтобы подтвердить равную загрузку.

Для проверки применимости метода BONCAT к изучению стрессовых реакций мы использовали протокол Aha-мечения, описанный выше, но также подвергали проростки кратковременным острым абиотическим стрессам в течение 3 ч, включая сдвиг в темноту, осмотическую шок (200 мМ маннита, показатель засухи), высокий уровень соли (300 мМ NaCl) и тепловой шок (37°C; рис.3). Только солевой стресс вызывал изменение фенотипа, когда листья слегка разрушались при воздействии (рис. 3В). Важно отметить, что сеянцы не обнаруживали заметной разницы в фенотипе в результате воздействия Aha в ходе эксперимента (рис. 3). Мы наблюдали значительное мечение Aha во всех условиях по сравнению с отрицательным контролем, где проростки выращивали в нормальных условиях, но не добавляли Aha (рис. 3C). На каждую дорожку загружали равные количества общего белка (рис.3D), чтобы можно было сравнивать уровни маркировки в разных условиях (рис. 3C).

Рисунок 3.

Обозначение пяти отдельных стрессовых состояний у арабидопсиса. A, Проростки арабидопсиса до импульсного и стрессового воздействия Aha. B, Проростки через 3 часа после импульса Aha (1 мм) и постоянного воздействия стрессовых условий от 1 до 5 (определены слева на рисунке). C, анализ флуоресценции в геле для демонстрации мечения в стрессовых условиях. Вновь синтезированные белки включают Aha; TAMRA-алкин конъюгирован с белками, содержащими Aha.Маркировка соблюдается при каждом условии. Слабый фоновый сигнал наблюдается в отрицательном контроле, где растения не подвергались воздействию Aha. D, контроль загрузки коллоидным синим, чтобы продемонстрировать одинаковую загрузку на дорожках. Гели являются репрезентативными примерами по меньшей мере трех биологических повторов.

Рисунок 3.

Обозначение пяти отдельных стрессовых состояний у арабидопсиса. A, Проростки арабидопсиса до импульсного и стрессового воздействия Aha. B, Проростки через 3 часа после импульса Aha (1 мм) и постоянного воздействия стрессовых условий от 1 до 5 (определены слева на рисунке).C, анализ флуоресценции в геле для демонстрации мечения в стрессовых условиях. Вновь синтезированные белки включают Aha; TAMRA-алкин конъюгирован с белками, содержащими Aha. Маркировка соблюдается при каждом условии. Слабый фоновый сигнал наблюдается в отрицательном контроле, где растения не подвергались воздействию Aha. D, контроль загрузки коллоидным синим, чтобы продемонстрировать одинаковую загрузку на дорожках. Гели являются репрезентативными примерами по меньшей мере трех биологических повторов.

Включение Aha в 2 раза выше при температуре окружающей среды 37°C по сравнению с 22°C

Хотя мы наблюдали мечение белка в каждом из тестируемых условий (рис.3C), мы отмечаем, что интенсивность мечения была примерно в 2 раза выше (2,1 ± 0,4) при тепловом шоке по сравнению с другими тестируемыми условиями, что позволяет предположить, что либо скорость трансляции выше, либо поглощение Aha больше при более высоких температурах. Несколько исследований с культурами суспензии клеток и проростками показали снижение скорости синтеза белка при повышенных температурах (Barnett et al., 1979; Matsuura et al., 2010). Мы отмечаем здесь, что, хотя температура окружающей среды в нашем эксперименте составляла 37°C, надземные ткани достигли пиковой температуры только приблизительно 31°C (измерено инфракрасным термометром в конце стрессового периода непосредственно перед сбором урожая), вероятно, из-за испарения. охлаждающие эффекты.Примечательно, что Исихара и др. (2015) сообщают о более высокой скорости синтеза белка при 28°C, чем при 21°C, у проростков арабидопсиса с использованием маркировки 13 CO 2 . Эти результаты согласуются с нашими, где ткани испытывают скачок температуры от 22°C до максимум 31°C.

Отдельно, чтобы исключить возможность того, что повышенное включение Aha было результатом большего поглощения, мы проводили импульсы с концентрациями Aha до 4 мМ и маркировали в течение 3 часов при комнатной температуре (дополнительный рис.1). Включение измеряли по флуоресценции в геле. В этих условиях маркировка Aha кажется насыщенной на 1 мм (дополнительный рис. 1). Эти результаты показывают, что повышенное включение при более высоких температурах, вероятно, связано не с большим поглощением Aha, а с усилением синтеза белка.

BONCAT можно использовать для обогащения вновь синтезированными белками проростков арабидопсиса

Мы проверили нашу способность обогащать вновь синтезированные белки с помощью метода вытягивания шариков дибензоазациклооктина (ДБЦО)-агарозы (рис.1 и 2А). В частности, мы вводили Aha в проростки арабидопсиса и позволяли метить зарождающиеся белки в течение 3 часов при комнатной температуре. Чтобы удалить небелковые примеси и получить образцы более высокого качества для масс-спектрометрии, мы выделили общий белок из проростков путем осаждения трихлоруксусной кислотой и ацетоном с последующей экстракцией фенолом (Wang et al., 2006; Wu et al., 2014). Мы ресуспендировали образцы в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 1% SDS и проверяли метку, подвергая общий белок конъюгации TAMRA-алкин (рис.4Б). Отдельную аликвоту общего белка подвергали воздействию условий SPAAC для конъюгации Aha-меченых белков с гранулами DBCO-агарозы. Смолу тщательно промывали для удаления неспецифически связанных белков. Наконец, Aha-меченые белки элюировали из смолы посредством расщепления трипсином и подвергали удалению детергента и обессоливанию перед ЖХ-МС/МС (Orbitap Elite) и анализом с помощью программного обеспечения MaxQuant.

Рисунок 4.

Обогащение вновь синтезированных белков для протеомики.A, Лечение, использованное для этого исследования. Стрелки указывают время введения Aha. B, маркировка в различных условиях. C, диаграмма Венна белков, идентифицированных в контрольных условиях, по сравнению с условиями теплового шока. D, Вулканический график соотношений уровней экспрессии белков, общих для теплового шока и контрольных условий. Белки с более высокой средней экспрессией в образцах RT попадают в левую часть графика, тогда как белки с более высокой средней экспрессией в образцах HS отображаются справа.Для построения графика значения LFQ усреднялись для каждого условия. Затем среднее значение HS делили на среднее значение RT и брали значение Log 2 . Каждая точка представляет белок. Белки, показанные красным, имеют аннотацию GO «Реакция на тепло». эмбиент, эмбиент; C1, контрольная серия 1; C2, контрольная серия 2; HS, тепловой шок; Р, восстановление.

Рис. 4.

Обогащение вновь синтезированных белков для протеомики. A, Лечение, использованное для этого исследования. Стрелки указывают время введения Aha.B, маркировка в различных условиях. C, диаграмма Венна белков, идентифицированных в контрольных условиях, по сравнению с условиями теплового шока. D, Вулканический график соотношений уровней экспрессии белков, общих для теплового шока и контрольных условий. Белки с более высокой средней экспрессией в образцах RT попадают в левую часть графика, тогда как белки с более высокой средней экспрессией в образцах HS отображаются справа. Для построения графика значения LFQ усреднялись для каждого условия. Затем среднее значение HS делили на среднее значение RT и брали значение Log 2 .Каждая точка представляет белок. Белки, показанные красным, имеют аннотацию GO «Реакция на тепло». эмбиент, эмбиент; C1, контрольная серия 1; C2, контрольная серия 2; HS, тепловой шок; Р, восстановление.

Для количественной оценки обогащения мы провели параллельную вытяжку из проростков, помеченных Aha при 22°C в течение 3 часов, и проростков, не подвергшихся воздействию Aha. Мы подвергли каждую фракцию очистке и ЖХ-МС/МС и количественно определили общую сумму всех площадей хроматограммы, извлеченной пептидом арабидопсиса MS1, как для обогащенных, так и для немеченых имитационных образцов.Мы обнаружили обогащение как минимум в 44 раза в трех биологических повторах.

Идентификация белков-кандидатов, участвующих в термоустойчивости и восстановлении после теплового стресса

После демонстрации возможности маркировки воздушных тканей в условиях стресса и разработки протокола обогащения мы попытались идентифицировать синтезированные de novo белки, которые участвуют в тепловом стрессе и в восстановлении после теплового стресса, используя комбинацию обогащения с помощью BONCAT и LC. -МС/МС.Мы решили изучить тепловой стресс, потому что он хорошо охарактеризован у Arabidopsis на уровне трансляции (Matsuura et al., 2010, 2013; Mittler et al., 2012), а также потому, что было показано, что термотолерантность индуцируется нагреванием проростков до 38°C в течение 90 минут (Larkindale and Vierling, 2008), шкала времени, которая легко доступна для анализа BONCAT (рис. 2B). Кроме того, тепловой стресс можно легко облегчить, чтобы контролировать синтез белка во время восстановления после стресса (McLoughlin et al., 2016), аспект физиологии стресса, который относительно недостаточно изучен на уровне синтеза белка.

Проростки обрабатывали Aha и подвергали воздействию теплового шока (37°C) или комнатной температуры (22°C) в течение 3 часов. Чтобы изучить восстановление, сеянцы сначала подвергали воздействию теплового шока окружающей среды (37 ° C) в течение 3 часов, давали им восстановиться в течение 4 часов при комнатной температуре (22 ° C), а затем обрабатывали Aha при комнатной температуре в течение 3 часов. Эксперименты проводились в трех биологических повторах для каждого условия (фиг. 4А).

Aha-меченые белки в экспериментальных и контрольных образцах конъюгировали с гранулами DBCO-агарозы и подвергали обогащению в соответствии с протоколом.В общей сложности мы идентифицировали и количественно оценили 3341 белок в четырех условиях [контроль Aha 1 мм при комнатной температуре (КТ), контроль Aha 2 мм при комнатной температуре, тепловой стресс (37 ° C) и восстановление после теплового стресса (от 37 ° C до 22°C; дополнительная таблица S1)]. Мы идентифицировали 2973 белка в контрольной серии 2 при комнатной температуре (2 мм Aha) и только в образцах теплового шока (рис. 4C).

Чтобы оценить обогащение известных чувствительных к теплу белков, мы сначала отфильтровали наш набор данных для белков, которые либо значительно активизировались в ответ на тепло (значение P < 0.01) или которые были обнаружены во всех трех повторах теплового шока и ни в одном из повторов контрольной серии 2 (2 мм Aha) [Дополнительная таблица S1; Значение безметочного количественного анализа (LFQ) = 0, столбцы DV - DX)]. Эти критерии идентифицировали в общей сложности 189 белков как чувствительные к нагреванию белки, обогащенные BONCAT (дополнительная таблица S1; столбец EL). Было обнаружено, что белки с аннотацией гена онтогенеза (GO) «Реакция на тепло» значительно преобладают ( P значение 8 x 10 -22 ; точный критерий Фишера) в популяции чувствительных к теплу белков, обогащенных BONCAT.Эти результаты ясно демонстрируют, что метод BONCAT обнаруживает обогащение синтезированных de novo «теплочувствительных белков» в ответ на 3-часовой тепловой стресс. Мы отмечаем, что этот анализ обнаружил белки, кодируемые ядерными, митохондриальными и пластидными генами, показывая, что Aha включается в белки, синтезируемые в разных клеточных компартментах.

Мы построили вулканический график белков, общих для образцов теплового шока и двух образцов контрольной серии, чтобы визуализировать белки со статистически значимыми изменениями кратности (рис.4Д). Наш список белков с повышающей регуляцией содержит множество известных маркеров теплового стресса, в том числе ClpB1, Hsp90-1, вероятный медиатор транскрипционной субъединицы 37c РНК-полимеразы II, и белок теплового шока (HSP) 70-5 (Queitsch et al., 2000; Lin). et al., 2001; Sung et al., 2001; Takahashi et al., 2003; Yamada and Nishimura, 2008). Наш анализ также идентифицировал белки со статистически значимыми изменениями кратности, которые ранее не были аннотированы.

Мы провели анализ основных компонентов на основе нормированных значений LFQ для каждого белка (рис.5). Мы обнаружили три отдельных кластера: контрольные образцы, образцы теплового шока и образцы восстановления. Эти результаты иллюстрируют повторяемость биологических повторов в анализе BONCAT, а объединение двух контрольных серий (1 мм и 2 мм Aha) предполагает, что Aha не вызывает значительных нарушений синтеза белка при этих концентрациях. Кроме того, раздельное группирование контрольных и восстановительных образцов показывает, что метаболизм не просто возвращается к состоянию, предшествующему наложению, после теплового стресса.

Рисунок 5.

Анализ основных компонентов результатов масс-спектрометрии на основе значений LFQ. Этот анализ показывает четкое разделение контрольных образцов, образцов теплового шока и образцов восстановления. На врезке показано увеличенное изображение кластера элементов управления.

Рис. 5.

Анализ главных компонент результатов масс-спектрометрии на основе значений LFQ. Этот анализ показывает четкое разделение контрольных образцов, образцов теплового шока и образцов восстановления. На врезке показано увеличенное изображение кластера элементов управления.

Затем мы построили тепловые карты для сравнения уровней белка в разных условиях (рис. 6; дополнительная таблица S1; дополнительная рис. S2). Этот анализ демонстрирует различие в белках, идентифицированных BONCAT, при трех условиях, включая заметную активацию белков теплового ответа при тепловом шоке. Примечательно, что многие BONCAT-меченые белки с высокой экспрессией во время теплового шока синтезируются на более низких уровнях в период восстановления, чем в контрольных условиях, что ясно демонстрирует, что проростки быстро приспосабливаются к изменяющимся условиям частично за счет изменения синтеза белков.

Рисунок 6.

Частичная тепловая карта белков с аннотацией GO «реакция на тепло», обнаруженная в этом исследовании. Значимость каждого кратного изменения рассчитывалась с использованием пакета R limma. Тепловые карты были созданы с использованием GENE-E, где кластеризация образцов выполнялась с использованием среднего сцепления и евклидова расстояния, а кластеризация генов выполнялась с использованием среднего сцепления и коэффициента корреляции 1-Пирсона. Для визуализации тепловой карты количество белков должно было быть определено как минимум в двух контрольных образцах и двух «обработанных» образцах (тепловой шок или восстановление).Относительную экспрессию белка нормализовали индивидуально для каждого белка так, чтобы средняя контрольная экспрессия равнялась нулю.

Рисунок 6.

Частичная тепловая карта белков с аннотацией GO «реакция на тепло», обнаруженная в этом исследовании. Значимость каждого кратного изменения рассчитывалась с использованием пакета R limma. Тепловые карты были созданы с использованием GENE-E, где кластеризация образцов выполнялась с использованием среднего сцепления и евклидова расстояния, а кластеризация генов выполнялась с использованием среднего сцепления и коэффициента корреляции 1-Пирсона.Для визуализации тепловой карты количество белков должно было быть определено как минимум в двух контрольных образцах и двух «обработанных» образцах (тепловой шок или восстановление). Относительную экспрессию белка нормализовали индивидуально для каждого белка так, чтобы средняя контрольная экспрессия равнялась нулю.

Чтобы подтвердить наши результаты BONCAT, мы провели иммуноблот-детекцию двух белков с повышенной экспрессией: ClpB1 (HSP101) и HSP 70-5. Для этого 5-суточные проростки выращивали так же, как и на сетке BONCAT, затем подвергали воздействию 3 ч при 22°С (контроль), 37°С в течение 3 ч (тепловой шок) или 37°С в течение 3 ч. ч, затем 22°C в течение 7 ч (восстановление; эти условия имитируют 4-часовой период «отдыха» плюс 3-часовой период мечения в эксперименте BONCAT).Затем мы экстрагировали общий белок в процедуре, идентичной экстракции белка для анализа с помощью ЖХ-МС/МС. Как и ожидалось, мы наблюдали сильную индукцию как ClpB1, так и HSP 70-5 при тепловом стрессе (рис. 7). Важно отметить, что иммуноблотинг выявил различия в распространенности в образцах лечения независимо от времени синтеза. В отличие от этого, BONCAT измеряет белок, синтезированный в течение определенного периода времени.

Рисунок 7.

Иммуноблоттинг-анализ избранных белков, показанный в скрининге BONCAT, активируется в ответ на тепловой стресс.Было обнаружено, что A, ClpB1 (HSP101) и B, HSP70-5 сильно активируются в ответ на тепловой стресс. Эти белки не синтезируются в больших количествах в период восстановления. Также они не быстро деградируют в период восстановления. Стационарные уровни ClpB1 во время восстановления составляют 0,95 ± 0,08, когда флуоресцентный сигнал образцов теплового шока нормализован до 1,00. Относительные значения флуоресценции приведены для контроля (комнатная температура), теплового шока и восстановления для HSP70-5. C, контроль загрузки.Все сигналы флуоресценции нормализовали по окрашиванию коллоидным синим по всей дорожке. Cont, контроль (комнатная температура), Rel. Fl — относительная флуоресценция; Рек, восстановление.

Рис. 7.

Иммуноблоттинговый анализ некоторых белков, показанный в скрининге BONCAT, активируется в ответ на тепловой стресс. Было обнаружено, что A, ClpB1 (HSP101) и B, HSP70-5 сильно активируются в ответ на тепловой стресс. Эти белки не синтезируются в больших количествах в период восстановления. Также они не быстро деградируют в период восстановления.Стационарные уровни ClpB1 во время восстановления составляют 0,95 ± 0,08, когда флуоресцентный сигнал образцов теплового шока нормализован до 1,00. Относительные значения флуоресценции приведены для контроля (комнатная температура), теплового шока и восстановления для HSP70-5. C, контроль загрузки. Все сигналы флуоресценции нормализовали по окрашиванию коллоидным синим по всей дорожке. Cont, контроль (комнатная температура), Rel. Fl — относительная флуоресценция; Рек, восстановление.

Большинство белков, активация которых во время теплового шока сильно повышалась, в период восстановления подавляется в соответствии с детектированием BONCAT (рис.6; Дополнительный рис. S2). Мы предположили, что эти белки с высокой активацией не будут быстро деградировать в период восстановления, потому что было показано, что термическое праймирование, механизм термотолерантности, происходит в аналогичных условиях теплового стресса в аналогичных временных масштабах (Larkindale and Vierling, 2008; Mittler et al. , 2012). Результаты нашего иммуноблотинга подтверждают эту гипотезу. В частности, ClpB1 и HSP70-5 не разрушались во время восстановления после теплового шока (рис. 7), хотя их синтез de novo значительно снижался (дополнительная таблица S1).Следовательно, ClpB1 и HSP70-5 стабильны в ходе нашего эксперимента.

BONCAT как генератор гипотез

К счастью, скрининг BONCAT выявил 80 подтвержденных биомаркеров (молекулярная функция ГО «реакция на тепло») реакции на тепловой стресс у арабидопсиса, включая ClpB1 (HSP101) и HSP70-5. Примечательно, что другие белки без аннотации «реакция на тепло» также активировались во время теплового стресса, что предполагает возможную роль в термотолерантности.Измерение белков, синтезируемых во время восстановления после теплового стресса, дало новую информацию. Например, во время выздоровления мы наблюдали индукцию (в 2,75 раза) зеаксантинэпоксидазы, которая катализирует первую стадию биосинтеза абсцизовой кислоты (Xiong and Zhu, 2003), гормона, который, как известно, способствует закрытию устьиц (Morillon and Chispeels, 2001). ; Парк и др., 2015). Закрытие устьиц, в свою очередь, минимизирует потерю воды из-за испарительного охлаждения (Xiong and Zhu, 2003). Таким образом, мы предполагаем, что в этих условиях зеаксантинэпоксидаза подавляется во время теплового стресса, чтобы способствовать испарительному охлаждению, а затем активируется во время восстановления, чтобы способствовать закрытию устьиц и предотвращать высыхание.В то время как подробное определение функциональных ролей термочувствительных белков в контексте наложения и восстановления выходит за рамки этого исследования, наблюдаемые изменения в синтезе белков предполагают механистические гипотезы, которые заслуживают дальнейшей оценки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Белки — это клеточные рабочие лошадки, выполняющие четко спланированные программы развития и адаптации. Будучи сидячими организмами, растения должны сохранять высокую степень протеомной пластичности, чтобы иметь возможность быстро реагировать на шквал сигналов окружающей среды (Huot et al., 2014; Фриштедт и др., 2015; Микельбарт и др., 2015). У растений, как и у большинства эукариот, количество мРНК часто плохо отражает уровень белка (Ingolia, 2014; Vélez-Bermúdez and Schmidt, 2014; Fukao, 2015), на что указывает несоответствие между общим содержанием мРНК и количеством мРНК, ассоциированным с полирибосомами. под контролем и в условиях абиотического стресса (обзор Roy and von Arnim, 2013). Чтобы решить эту проблему, мы использовали BONCAT в интактных проростках арабидопсиса для идентификации и количественного определения белков, синтезируемых в условиях абиотического стресса.Как реализовано здесь, BONCAT позволяет идентифицировать белки, синтезированные в течение нескольких часов, и не требует манипуляций с механизмом трансляции или предположения, что мРНК, связанная с рибосомой, будет продуцировать стабильный белок (рис. 2). Кроме того, нет необходимости истощать эндогенные уровни Met для включения Aha во вновь синтезированные белки.

В ходе первоначального испытания метода мы обнаружили доказательства того, что вновь синтезированные белки могут быть помечены в проростках, подвергшихся различным абиотическим стрессам, включая осмотический шок, высокое содержание соли и тепловой шок (рис.3). Затем мы сравнили популяции белков Arabidopsis, созданные в нормальных условиях роста, с популяциями, полученными в условиях умеренного теплового стресса и во время восстановления после теплового стресса (рис. 4). Изменения в синтезе белка в ответ на тепловой стресс легко наблюдались уже в течение 3 часов. Мы использовали биоинформатический (рис. 4–6) и иммуноблоттинговый анализ (рис. 7; дополнительные рисунки S3 и S4) для проверки белков, меченных BONCAT, в трех условиях. Неудивительно, что аннотация GO «Реакция на тепло» была чрезмерно представлена ​​среди белков, активность которых повышалась в ответ на тепловой шок.Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими селективную индукцию смягчающих стресс факторов при умеренном тепловом стрессе. Наша идентификация синтезированных de novo маркеров реакции на тепловой шок обеспечивает валидацию метода BONCAT как инструмента для изучения динамики протеома у растений. В то же время мы обнаружили множество белков, в том числе предположительно факторы транскрипции с низким содержанием, такие как BIM1, которые ранее не были связаны со смягчением теплового стресса, что иллюстрирует потенциальную ценность протеомных исследований с временным разрешением в качестве источника новых механистических гипотез.

Кроме того, мы оценили синтез белка во время восстановления после теплового стресса и обнаружили, что белки с наиболее высокой активацией в ответ на тепловой стресс синтезируются во время восстановления на уровне, близком или ниже уровня до теплового шока (рис. 6). Этот результат демонстрирует механизм, с помощью которого растения избегают синтеза избытка белков, связанных со стрессом, в быстро меняющихся условиях. Основываясь на сниженном синтезе de novo и сохранении численности, ни ClpB1, ни HSP 70-5 не подвергались быстрой деградации в течение периода восстановления, что согласуется с предыдущей работой, показывающей, что растения могут развивать «тепловую память» (Larkindale and Vierling, 2008), которая защищает проростки, подвергшиеся воздействию мягкий тепловой стресс от последующих нападений.Это наблюдение предполагает, что метод BONCAT можно также применять для рассмотрения динамики оборота белка, поскольку обнаруженный белок будет отражать как синтез, так и оборот в течение периода времени мечения. Важно отметить, что оборот и синтез могут регулироваться по-разному. Таким образом, метод BONCAT вряд ли выявит крайне нестабильные белки.

Стоит отметить, что в нашей модели использовались вегетативные саженцы. Хотя понимание реакции на стресс на всех стадиях развития важно для создания более устойчивых сельскохозяйственных культур, предыдущие исследования показали, что потери урожая чаще всего вызываются атаками на репродуктивные ткани (Young et al., 2004; Зинн и др., 2010). Метод BONCAT должен оказаться полезным на многих стадиях развития и тканях и в самых разных условиях и может помочь раскрыть генетическую основу признаков, участвующих в устойчивости как к абиотическим, так и к биотическим стрессам. Примечательно, что все реагенты и зонды, используемые в этом исследовании, коммерчески доступны, что еще раз подчеркивает легкость, с которой эта методология может быть легко принята лабораториями, имеющими доступ к протеомным средствам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Условия роста растений

Семена

Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) (образец Col-0) подвергали стерилизации паровой фазой (100 мл 6% [об./об.] отбеливателя и 3 мл 37% HCl [об./об.]) в течение приблизительно 3 часЗатем проростки высевали на 40 мл твердой среды (чашки Петри 100 x 15 мм), содержащей 0,5× соли Мурасиге и Скуга (MS) (Sigma-Aldrich), 1× витамины MS (Sigma-Aldrich), 0,3% (масс. /v) Suc и 0,9% (мас./об.) Phytagel (Sigma-Aldrich). Чашки переворачивали при 4°С в темноте на 2 дня, чтобы нарушить покой семян. Затем чашки помещали при 22°C на 24-часовой световой день и располагали так, чтобы корни прорастали в среду. После прорастания растениям давали расти в течение 5 дней при постоянном освещении.

Метод заливания рассады для доставки неканонической аминокислоты

Протокол был адаптирован из исследования Ishiga et al.(2011). Среда для мечения Aha, содержащая 0,5× солей MS (Sigma-Aldrich), 5% Suc, 0,0025% Silwet l-77 (Lehle Seeds), 1 мМ Aha в 10 мМ цитратном буфере (pH 5,6), была свежеприготовлена ​​перед проведением эксперимента. Проростки полностью погружали в среду для мечения Aha на 2 мин. После декантации среды крышки чашек Петри заменяли, а чашки заворачивали в фольгу. Затем проростки подвергали кратковременным острым абиотическим стрессам в течение 3 ч. Переход в темноту осуществлялся путем покрытия пластин фольгой.Для аппроксимации осмотического шока в среду для мечения Aha добавляли 200 мМ маннита и пульсировали на проростки во время доставки Aha. Высокий солевой стресс был достигнут путем добавления в среду для мечения Aha 300 мМ NaCl. Для получения образцов теплового шока планшеты помещали в печь при температуре окружающей среды 37°C сразу после 2-минутного погружения в среду для мечения Aha. Все протеомные эксперименты начинали утром 5-го дня (прорастание определяется как 0-й день).

Флуоресценция в геле для контроля мечения белков

После мечения Aha воздушные ткани немедленно собирали, быстро замораживали жидким азотом и хранили при -80°C до последующих этапов обработки.Замороженные ткани мацерировали в жидком азоте. Замороженный порошок немедленно переносили в пробирку Эппендорфа, содержащую 1 мл буфера для лизиса (100 мМ Трис, pH 8, содержащий 4% масс./об. SDS). Лизаты подвергали обработке ультразвуком при 80°С в течение 40 мин, затем подвергали дальнейшему нагреву при 95°С в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при относительной центробежной силе 16 100 (RCF) RCF в течение 5 мин. Условия мечения лизата CuAAC для флуоресценции в геле основывались на ранее опубликованном протоколе (Hong et al., 2009). Концентрации белка в очищенном лизате измеряли с помощью анализа на бицинхониновую кислоту. Сорок микрограммов белкового лизата добавляли к PBS до конечного общего объема 221 мкл. В отдельной пробирке предварительно смешивали алкинильный краситель, сульфат меди (II) и трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин и оставляли для реакции на 3 мин в темноте. Затем к смеси лизат-PBS добавляли аминогуанидин HCl и аскорбат натрия. Конечные концентрации были следующими: алкиниловый краситель (2,5 мМ), CuSO 4 (1 мМ), трис(3-гидроксипропилтриазолилметил)амин (5 мМ), аминогуанидин HCl (5 мМ) и аскорбат натрия (5 мМ).Все компоненты осторожно перемешивали (одна инверсия) и оставляли для реакции на 15 мин в темноте при комнатной температуре без встряхивания. Затем белки экстрагировали осаждением метанолом/хлороформом/водой. Гранулы интенсивно промывали (не менее трех раз). Затем осадок растворяли в буфере для загрузки образца 2× SDS и обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут при 80°C. Образцы нагревали до 95°C в течение 5 минут и подвергали электрофорезу в готовых полиакриламидных гелях с концентрацией от 4% до 12% Bis-Tris. Гель промывали фиксирующим раствором (50 % воды, 40 % этанола, 10 % уксусной кислоты) в темноте в течение 10 мин и дважды промывали водой (2×10 мин) перед проведением флуоресцентной визуализации с помощью возбуждающего лазера. при 532 нм и полосовой фильтр излучения при 580 нм (Typhoon GE Healthcare).После флуоресцентной визуализации гель окрашивали коллоидным синим (InstantBlue, Expedeon) в течение 1 часа и визуализировали, чтобы обеспечить одинаковую загрузку белка на всех дорожках. Чтобы получить относительные значения флуоресценции, интенсивность сигнала измеряли для всей дорожки как в канале TAMRA (флуоресценция), так и в канале коллоидного синего. Затем рассчитывали отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности коллоидного синего и нормализовали к контрольной дорожке. Вычисление относительных значений флуоресценции в виде соотношений таким образом позволяет сравнивать дорожки, даже если нагрузка на дорожки немного различается.

Лизис клеток и экстракция белка для обогащения

Образцы были приготовлены в трех биологических повторах, при этом одна чашка (приблизительно 0,5–0,7 г сырой массы ткани) представляла собой один биологический повтор. Образцы готовили по протоколам, адаптированным из Wang et al. (2006) и Wu et al. (2014). Замороженные воздушные ткани мацерировали в жидком азоте с помощью ступки и пестика. Полученный порошок (0,1–0,3 г) переносили в пробирку объемом 1,7 мл (обычно ткани с одной пластины делили на шесть отдельных 1.пробирки 7 мл). Осадки промывали 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в ацетоне, заполняя пробирки, хорошо их перемешивая встряхиванием, затем центрифугируя при 16000 RCF в течение 3 мин при 4°C. Супернатант удаляли. Осадок промывали 80% метанолом, содержащим 0,1 М ацетата аммония, затем 80% ацетоном. Гранулы давали высохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин для удаления остаточного ацетона. Затем 0,8 мл жидкого фенола (pH 8,0, Sigma-Aldrich, № по каталогу P4557) и 0,8 мл плотного буфера SDS [30% Suc, 2% SDS, 0.В пробирку добавляли 15% азид натрия (для предотвращения роста бактерий), 0,1 М трис-HCl, pH 8,0, и 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 5% (добавляли в свежем виде). Содержимое тщательно перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Далее пробирки центрифугировали при 16000 RCF в течение 3 мин при 4°C. Верхнюю фенольную фазу переносили в новую пробирку объемом 1,7 мл, принимая меры предосторожности, чтобы не нарушить средний интерфейс SDS. Новую пробирку Эппендорфа объемом 1,7 мл заполнили метанолом, содержащим 0.1 М ацетата аммония и выдерживают при -20°С в течение ночи для осаждения белка. Затем пробирки центрифугировали при 16000 RCF в течение 5 мин при 4°C. Осадок промывали один раз 100% метанолом, затем 80% ацетоном. Затем белковые осадки ресуспендировали в PBS [pH 7,4, 1% SDS, 100 мМ хлорацетамид и 1× ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА (Sigma Aldrich, № по каталогу 11873580001)], затем объединяли. Концентрации белка измеряли с помощью анализа на бицинхониновую кислоту. Приблизительно 0,3 мг общего белка проходили через процедуру обогащения.

Процедура обогащения и подготовка проб ЖХ-МС/МС

Образцы доводили до постоянного объема (примерно 500 мкл) с помощью 1% SDS в PBS. Затем образцы разбавляли в 2 раза 8 м мочевиной, содержащей 1 х ингибитор протеазы, не содержащий ЭДТА (Sigma Aldrich, № по каталогу 11873580001) и 0,85 м NaCl.

Отдельно гранулы DBCO-агарозы (50 мкл суспензии 2×; Click Chemistry Tools, № по каталогу 1034-2) промывали 3× 0,8% SDS в PBS. Затем к смоле добавляли образцы белка и встряхивали при 1200 об/мин при комнатной температуре в течение ночи (не менее 16 ч).Смолу промывали 1 мл воды. Затем к смоле добавляли 0,5 мл ДТТ (1 мМ в 0,8% SDS в PBS) и инкубировали при встряхивании (1200 об/мин) в течение 15 мин при 70°C. Супернатант удаляли, а свободные тиолы блокировали йодацетамидом (0,5 мл раствора с концентрацией 7,4 мг/мл, растворенного в PBS с 0,8% SDS) в течение 30 мин в темноте при 1200 об/мин.

Смолу перенесли на спин-колонку (хроматографические колонки Poly-prep, Bio-Rad, № по каталогу 731-1550) и подвергли следующим промывкам: 8 × 5 мл 0.8% SDS в PBS, 8×5 мл 8М мочевины, 8×5 мл 20% ацетонитрила (ACN). Для второй промывки каждым раствором колонку закрывали крышкой и оставляли на 10 мин перед сливом. После промывок шарики переносили в пробирку Эппендорфа с 10% ацетонитрила в 50 мМ бикарбоната аммония. Пробирки центрифугировали 5 мин при 2000 g и удаляли жидкость. Затем к гранулам добавляли 100 мкл 10% ACN в 50 мМ бикарбоната аммония и добавляли 100 нг трипсина. Гранулы встряхивали при 1200 об/мин и 37°С в течение ночи.Собирали супернатант и дважды промывали гранулы 150 мкл 20% ACN. Супернатанты от промывок 20% ACN объединяли с супернатантами после ночного триптического гидролиза. Объединенные супернатанты фильтровали (колонки для центрифугирования Пирса, 0,8 мл, ThermoFisher Scientific, № по каталогу 89868) для удаления всех просочившихся шариков, затем сушили на спидваке.

Расщепленные пептиды повторно растворяли в 100 мкл 50 мМ бикарбоната аммония и обрабатывали смолами для удаления моющих средств HiPPR (ThermoFisher Scientific, каталожный номер88306). Наконец, расщепленные пептиды подвергали стадии очистки обессоливания с помощью ZipTip (C18).

Анализ ЖХ-МС/МС

Образцы, расщепленные трипсином, подвергали анализу ЖХ-МС/МС на системе ЖХ с нанопотоком EASY-nLC II (Thermo Fisher Scientific), соединенной с масс-спектрометром Orbitrap Elite Hybrid Ion Trap-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific), оснащенным источник ионов nanospray Flex, как описано ранее (Kalli et al., 2013).

Вкратце, для системы EASY-nLC II растворитель A состоял из 97.8% H 2 O, 2% ACN и 0,2% муравьиной кислоты, а растворитель B состоял из 19,8% H 2 O, 80% ACN и 0,2% муравьиной кислоты. Колонка Picofrit с самонабивкой 50 мкм (New Objective, Inc.) с наконечником с покрытием была заполнена смолой ReproSil-Pur C18AQ 3,0 мкм (размер пор 120 Å, Dr. Maisch) до 16 см. Образцы загружали непосредственно на смолу колонки, и колонку нагревали до 65°C. Пептиды разделяли 120-минутным градиентом при скорости потока 3220 нл/мин. Градиент был следующим: от 2% до 30% растворителя B (150 мин), от 30% до 100% B (1 мин) и 100% B (9 мин).Затем элюированные пептиды ионизировали с использованием наконечника из диоксида кремния со стандартным покрытием (New Objective) в качестве эмиттера электрораспыления и вводили в масс-спектрометр. Orbitrap Elite работал в режиме зависимости от данных, автоматически чередуя полное сканирование ( m/z 400–1600) в Orbitrap и последующие сканирования МС/МС 20 наиболее распространенных пиков в линейной ионной ловушке ( метод Топ20). Сбор данных контролировался программным обеспечением Xcalibur 2.2 и Tune 2.7 (Thermo Fisher Scientific). Необработанные файлы масс-спектрометрии были загружены в репозиторий стандартов Japan Proteome (jPOSTrepo), общедоступный репозиторий данных (идентификатор ProteomeXchange: PXD005577).

Биоинформатический анализ

необработанных файла были обработаны и проанализированы с помощью MaxQuant (версия 1.5.3.30; Кокс и Манн, 2008 г.; Кокс и др., 2011 г.). Поиск спектров проводился в базе данных UniProt Arabidopsis (33 353 последовательности) и в базе данных загрязняющих веществ (245 последовательностей). База данных приманок была создана MaxQuant с использованием стратегии обратной последовательности для оценки частоты ложных открытий. В качестве пищеварительного фермента был указан трипсин, допускающий до двух пропущенных расщеплений.Окисление Met (+15,9949), ацетилирование N-конца белка (+42,0106) и замена Met на Aha (-4,9863) допускались в качестве переменных модификаций. Карбамидометилирование Cys (+57,0215) указано как фиксированная модификация. Допуск по ионам-предшественникам после повторной калибровки составил менее 4,5 ppm, а допуск по осколочным ионам составил 0,5 D. В MaxQuant были включены функции «Соответствие между циклами» и LFQ. При идентификации белков и пептидов расчетная частота ложных обнаружений составляла <1%.

Значимость изменений кратности была рассчитана с использованием пакета R limma (Benjamini and Hochberg 1995; Smyth GK 2004; Ritchie et al., 2015). Тепловые карты были созданы с использованием GENE-E, где кластеризация образцов выполнялась с использованием среднего сцепления и евклидова расстояния, а кластеризация генов выполнялась с использованием среднего сцепления и коэффициента корреляции 1-Пирсона. Для визуализации тепловой карты необходимо было количественно определить белки по крайней мере в двух контрольных образцах и двух «обработанных» образцах (тепловой шок или восстановление). Относительную экспрессию белка нормализовали индивидуально для каждого белка так, чтобы средняя контрольная экспрессия равнялась нулю.

Иммуноблоттинг

Неконъюгированные первичные антитела против ClpB1 и HSP70-5 были приобретены у Abcam. Козлиные антимышиные IgG (H+L) (A-21235) и козьи антикроличьи IgG (H+L) (A-21429) вторичные антитела с конъюгированным Alexa Fluor были приобретены у Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Лизат (10 мкг) подвергали электрофорезу в 4-12% готовых полиакриламидных гелях Bis-Tris для всех вестерн-блоттингов. Мембраны из нитроцеллюлозы толщиной 0,2 мкм блокировали обезжиренным сухим молоком с концентрацией 3% масс./об. в TBST в течение 1 ч перед инкубацией с антителами в TBST.Первичные антитела [анти-ClpB1 (Ab80121, 1:5000) и анти-HSP70-5 (ab5439, 1:5000)] инкубировали с соответствующими мембранами при 4°C в течение ночи с 3% вес./об. обезжиренного сухого молока перед окрашиванием. со вторичным антителом (1:5000) в течение 1 ч и визуализацией (ФЭУ 400 В; размер пикселя 50 мкм). Сигналы флуоресценции нормализовали к общему сигналу окрашивания коллоидным синим для каждого образца. Чтобы гарантировать, что образцы были измерены в линейном диапазоне для количественного анализа, 1,5 мкг, 10 мкг и 15 мкг общего белка загружали для каждого повтора теплового шока, и измеряли флуоресценцию после инкубации с антителом против HSP70-5 и вторичным антителом. как описано выше (дополнительный рис.С4А). Интенсивность флуоресценции была построена в зависимости от общей концентрации белка, что показывает, что сигналы находились в линейном диапазоне для точного количественного определения ( r   2 = 0,994; дополнительный рисунок S4B).

Регистрационные номера

Необработанные файлы масс-спектрометрии были загружены в репозиторий стандартов Japan Proteome под номером доступа PXD005577.

Дополнительные данные

Доступны следующие дополнительные материалы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим лабораторию профессора Эллиота Мейеровица, особенно Арнаваза Гарду и доктора Пола Тарра, за семена, место в ростовых камерах и полезные обсуждения. Мы также благодарим Роксану Эгглстон-Рейнджел за полезные обсуждения подготовки образцов для масс-спектрометрии.

Глоссарий

  • ACN

  • Ага

  • BONCAT

    bioorthogonal неканонической аминокислота мечения

  • CuAAC

    медно-катализируемой азид-алкина циклоприсоединения

  • DBCO

  • GO

  • LC -MA / MS

    Tandem Light Chromatography Mass Spectromometry

  • LFQ

  • MS

  • PBS

    PBS

  • PBS

  • PBS

    9003
  • RT

  • RT

    SPAAC

    на деформации Azide-Alkene циклоприсоединение

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Bagert

JD

,

xie

yj

,

yj

,

,

MJ

,

qi

y

,

,

S

,

Schuman

EM

,

TIRRELL

DA

(

2014

)

Количественный протеомный анализ с временным разрешением путем сочетания биоортогонального мечения неканоническими аминокислотами и импульсного мечения стабильными изотопами аминокислотами в клеточной культуре

.

Mol Cell Proteomics

 

13

:

1352

1358

Barnett

T

,

T

,

M

,

M

,

McDaniel

CN

,

Mascarenhas

JP

(

1979

)

Тепловые ударные белки в растительных клетках

.

Дев Жене

 

1

:

331

340

Benjamini

 

Y

,

Hochberg

 

Y

(

1995

)

Контроль частоты ложных открытий: практичный и мощный подход к множественному тестированию

.

J Roy Stat Soc B Met

 

57

:

289

300

Bindschedler

LV

,

Palmblad

M

,

Cramer

R

(

2008

2008

2008

гидроизотопная маркировка растений )

тематическое исследование окислительного стресса

.

Фитохимия

 

69

:

1962

1972

Бита

 

CE

,

Gerats

 

T

(

2013

)

Устойчивость растений к высоким температурам в меняющейся среде: научные основы и производство культур, устойчивых к тепловому стрессу

.

Front Plant Sci

 

4

:

273

chen

w-p

,

yang

x-yang

,

вред

GL

,

серый

WM

,

Hegeman

AD

,

Cohen

JD

(

2011

)

корпус для выращивания для метаболической маркировки Arabidopsis thaliana с помощью 13C-диоксида углерода – система маркировки in vivo для протеомных и метаболомных исследований

.

Proteome Sci

 

9

:

9

Cox

 

J

,

Mann

 

M

(

2008

)

MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуализированную точность массы в диапазоне ppb и количественный анализ белка в масштабе всего протеома 9.

Нат Биотехнолог

 

26

:

1367

1372

COX

J

,

Neuhauauser

,

N

,

N

,

Michalski

A

,

Scheltema

RA

,

OLSEN

JV

,

MANN

M

(

M

(

2011

)

Andromeda: поисковая система пептидов, интегрированная в среду MaxQuant

.

J Proteome Res

 

10

:

1794

1805

Dieterich

DC

,

DC

,

Link

AJ

,

GRAUMANN

J

,

TIRRELL

DA

,

SCHUMAN

EM

(

2006

)

Выборочная идентификация вновь синтезированных белков в клетках млекопитающих с использованием биоортогональной неканонической аминокислотной маркировки (BONCAT)

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

103

:

9482

9487

ERDMANN

I

,

Marter

K

,

Kobler

O

,

Niehues

S

,

ABELE

J

,

J

,

Müller

A

,

Bussmann

J

,

StorkeBaum

E

,

E

,

ZIV

T

,

T

U

,

U

,

Dieterich

DC

(

2015

)

Сборная клеточная маркировка протеомов в Drosophila Melanogaster

.

Нац.коммун

 

6

:

7521

Fristedt

R

,

R

,

Herdean

A

,

BLABY-HAAS

CE

,

MAMEDOV

F

,

Merchant

F

,

,

SS

,

Последние

RL

,

Lundin

B

(

2015

)

PHOTOSYSTEM II PROTEIN33, белок, сохраняющийся в пластидной линии, связан с тилакоидной мембраной хлоропластов и обеспечивает стабильность суперкомплексов фотосистемы II у Arabidopsis

.

Завод Физиол

 

167

:

481

492

Fukao

 

Y

(

2015

)

Несоответствие между уровнями белка и транскрипта , обнаруженное при мониторинге выбранных реакций

.

Поведение сигнала установки

 

10

:

e1017697

GE

P

,

HAO

P

,

CAO

M

,

GUO

G

,

G

,

LV

D

,

S

,

LI

x

,

Yan

x

,

xiao

j

,

мА

,

мА

,

мА

w

,

yan

y

(

y

(

2013

)

Количественный протеомный анализ на основе ITRAQ выявляет новые метаболические пути роста рассады пшеницы при перекиси водорода. стресс

.

Протеомика

 

13

:

3046

3058

Genheden

M

,

Kenney

JW

,

Johnston

He

,

ManoSopoulou

A

,

A

,

GARBIS

SD

,

Гордый

CG

(

2015

)

BDNF Стимуляция синтеза белка в нейронах коры требуется MAP-киназа-взаимодействующая киназа MNK1

.

J Neurosci

 

35

:

972

984

HUOT

B

,

Yao

J

,

MONTGOMERY

BL

,

BL

,

HE

SY

(

2014

)

Расходы на рост-защиту в растениях: балансировочный акт для оптимизации фитнеса

.

Мол завод

 

7

:

1267

1287

Гонс

V

,

V

,

,

SI

,

мА

C

,

C

,

Finn

MG

(

MG

(

MG

(

2009

)

Анализ и оптимизация Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition для биоконъюгации

.

Angew Chem Int Ed Engl

 

48

:

9879

9883

Инголия

 

NT

(

2014

)

Профилирование рибосом: новые взгляды на трансляцию, от одиночных кодонов до масштаба генома

.

Nat Rev Genet

 

15

:

205

213

ISHIGA

Y

,

Y

,

ISHIGA

T

,

T

,

,

SR

,

Mysore

KS

(

2011

)

Методика инокуляции наводнения наводнения

: быстрый и надежный анализ для изучения установки бактериальные взаимодействия

.

Растительные методы

 

7

:

32

Ishihara

 

H

,

Obata

 

T

,

Sulpice

 

R

,

Fernie

 

AR

5 (

2015

)

Количественная оценка синтеза и деградации белка у Arabidopsis путем динамического мечения 13 CO 2 и анализа обогащения отдельными аминокислотами в их свободных пулах и белком

.

Завод Физиол

 

168

:

74

93

Jiao

 

Y

,

Meyerowitz

 

EM

(

2010

)

Специфический для клеток анализ трансляции РНК в развивающихся цветках открывает новые уровни контроля

.

Мол Сист Биол

 

6

:

419

Juntawong

P

,

GIRKE

T

,

T

,

BAZIN

J

,

J

,

Bailey-Serres

J

(

2014

)

Трансляционная динамика, выявленная геномом. Профилирование следов рибосом в Arabidopsis

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

111

:

E203

E212

Kalli

A

,

A

,

Smith

GT

,

GT

,

Sweredoski

MJ

,

MJ

,

Гесс

S

(

S

(

2013

)

Оценка и оптимизация масс-спектрометрических настроек при зависимости от данных Режим приобретения: фокус на Масс-анализаторы LTQ-Orbitrap

.

J Proteome Res

 

12

:

3071

3086

KASUGA

M

,

M

,

LIU

Q

,

MIURA

S

,

S

,

Yamaguchi-Shinozaki

K

,

Shinozaki

K

(

K

(

k

)

Улучшение засухи, соли и толерантность к замораживанию путем переноса гена одного фактора транскрипции, индуцируемого стрессом

.

Нат Биотехнолог

 

17

:

287

291

Key

JL

,

Lin

CY

,

Chen

YM

(

1981

)

белков теплового шока 90 высших растений.

Proc Natl Acad Sci

 

78

:

3526

3530

KIM

YJ

,

Lee

HM

,

Wang

,

,

WU

J

,

KIM

SG

,

Kang

KY

,

Park

KH

,

Kim

YC

,

AGRAWAI

GK

,

RAKWAI

R

,

KIM

ST

(

ST

(

Истощение обильного завода белка Rubisco с использованием метода осаждения сульфата протамина

.

Протеомика

 

13

:

2176

2179

KREPS

JA

,

WU

,

WU

Y

,

CHANG

H-S

,

ZHU

T

,

Wang

x

,

Harper

J

(

2002

)

Transcriptome для Arabidopsis в ответ на солевой, осмотический и холодовой стресс

.

Завод Физиол

 

130

:

2129

2141

Larkindale

J

,

Vierling

E

(

2008

)

Ответы основного генома , связанные с акклиматизацией к высокой температуре

.

Завод Физиол

 

146

:

748

761

Lewandowska

D

,

десять имеют

S

,

Hodge

K

,

Thildemans

V

,

Lamond

AI

,

Brown

JW

(

2013

)

растение SILAC: мечение стабильными изотопами аминокислотами проростков арабидопсиса для количественной протеомики

.

PLoS One

 

8

:

e72207

LIN

BL

,

Wang

JS

,

LIU

HC

,

CHEN

RW

,

RW

,

Meyer

Y

,

BARAKAT

A

,

Deiseny

M

(

2001

)

Геномный анализ надсемейства Hsp70 у Arabidopsis thaliana

.

Шапероны клеточного стресса

 

6

:

201

208

Lopes

MS

,

Reynolds

MP

(

2010

)

Распределение ассимилятов по более глубоким корням связано с более прохладным пологом и повышением урожайности пшеницы в условиях засухи5 9000

Funct Plant Biol

 

37

:

147

156

Matsuura

H

,

H

,

,

Y

,

Shinmyo

A

,

Kanaya

S

,

Kato

S

(

2010

)

Геном-анализ ранних переводных ответов в повышенная температура и высокая соленость у Arabidopsis thaliana

.

Физиол клеток растений

 

51

:

448

462

Matsuura

H

,

Rissami

S

,

KUBO

Y

,

UEDA

K

,

UEDA

A

,

Yamaguchi

M

,

Hirata

K

,

Demura

T

,

T

,

Kanaya

S

,

Kato

,

Kato

K

(

2013

)

Вычислительный подход показывает, что 5′-проксимальный регион 5′-UTR имеет ответственную подписью CIS-регуляторную подписью для трансляции, регулируемой тепловым стрессом, у Arabidopsis

.

Физиол клеток растений

 

54

:

474

483

Mcalister

GC

,

Nusinow

DP

,

DP

,

MP

,

Wüir

M

,

Huttlin

EL

,

ERIKSON

BK

,

RAD

R

,

Haas

W

,

Gygi

SP

(

2014

)

MultiNotch MS3 обеспечивает точное чувствительное и мультиплексное обнаружение дифференциальной экспрессии в протеомах линии раковых клеток

.

Анальная химия

 

86

:

7150

7158

McKay

 

CS

,

Finn

 

MG

(

2014

)

Щелчковая химия в сложных смесях: Биоортогональное сопряжение

.

Chem Biol

 

21

:

1075

1101

Mcloughlin

F

,

F

,

Basha

E

,

E

,

ME

,

KIM

M

,

Bordowitz

J

,

Katiya-Agarwai

S

,

Vierlin

E

(

2016

)

Малые белки теплового шока класса I и II защищают трансляцию белков во время теплового стресса

.

Завод Физиол

 

172

:

1221

1236

Mickelbart

MICKELBART

MV

,

HASAGAWA

PM

,

BAILEY-SERRES

J

(

j

(

2015

)

Генетические механизмы абиотического напряженного толерантности, которые переводят на устойчивость урожая

.

Nat Rev Genet

 

16

:

237

251

Mittler

R

,

R

,

FINKA

A

,

Cuendet

FA

,

Goloubinoff

P

(

P

(

2012

)

Как растения чувствуют тепло?

 

Trends Biochem Sci

 

37

:

118

125

Morillon

R

,

Chispeels

MJ

(

2001

)

Роль АБК и транспирационного потока в регуляции осмотической проницаемости клеток листа5 9000.

Proc Natl Acad Sci USA

 

98

:

14138

14143

Mustroph

A

,

ZANETTI

ME

,

Jang

CJ

,

Holtan

,

,

Repetti

,

Repetti

PP

,

Galbraith

DW

,

Girke

T

,

Bailey-Serres

J

(

2009

)

Профилирование транслатомов дискретных клеточных популяций разрешает измененные клеточные приоритеты во время гипоксии у арабидопсиса

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

106

:

18843

18848

Nguyen

TX

,

Sticklen

M

(

2013

)

Ген ячменя hva1 придает трансгенной кукурузе засухоустойчивость и солеустойчивость ( Zea)

Adv Crop Sci Tech

 

1

:

105

Park

S-Y

,

Peterson

FC

,

,

,

,

,

A

,

Yao

J

,

Volkman

BF

,

Cutler

SR

(

2015

)

агрохимический контроль использования растительной воды с использованием сконструированных рецепторов абсцизовой кислоты

.

Природа

 

520

:

545

548

Preston

J

,

Tatematsu

K

,

K

,

Kanno

Y

,

Hobo

T

,

Kimura

M

,

Jikmaru

Y

,

YANO

R

,

Kamiya

 

Y

,

Nambara

 

E

(

2009

)

Временные паттерны экспрессии генов гормонального метаболизма при набухании семян Arabidopsis thaliana: сравнительное исследование 5

покоящихся и не покоящихся образцов.

Физиол клеток растений

 

50

:

1786

1800

QueiTSCH

C

,

C

,

HONG

SW

,

VIERLING

E

,

LINDQUIST

S

(

2000

) Теплодостойкий протеин 101 играет решающую роль в термоторесике в ячейке Arabidopsis

12

:

479

492

Ritchie

Me

,

PHISSON

B

,

WU

D

,

HU

Y

,

Y

,

,

CW

,

SHI

W

,

SMITH

GK

(

2015

)

Limma обеспечивает анализ дифференциальной экспрессии для секвенирования РНК и исследований микрочипов

.

Рез. нуклеиновых кислот

 

43

:

e47

Roy

B

,

von Arnim

AG

(

2013

)

Трансляционная регуляция цитоплазматических мРНК

.

Книга арабидопсиса

 

11

:

e0165

Sachs

MM

,

Freeling

M

,

Okimoto

R

(

1980

1980

) анаэробные белки

.

Сотовый

 

20

:

761

767

Sivamani

E

,

Bahiethin

A

,

A

,

JM

,

AL-Niemi

T

,

DYER

WE

,

HO

TD

,

QU

R

(

2000

)

Повышение продуктивности биомассы и эффективности использования воды в условиях водного дефицита у трансгенной пшеницы , конститутивно экспрессирующей ген HVA1 ячменя

.

Растениевод

 

155

:

1

9

Sletten

 

EM

,

Bertozzi

 

CR

(

2009

)

Биоортогональная химия: поиск селективности в море функциональности

.

Angew Chem Int Ed Engl

 

48

:

6974

6998

SENG

D-Y

,

KAPLAN

F

,

F

,

GUE

CL

(

CL

(

CL

(

2001

)

Растение HSP70 Молекулярные шапероны: белковая структура, генная семья, выражение и функция

.

Physiol Planatarum

 

113

:

443

451

Смит Г.К. (2004) Линейные модели и эмпирические байесовские методы для оценки дифференциальной экспрессии в экспериментах с микрочипами. Стат. заявл. Жене. Мол. биол.  

3

: Статья 3

Takahashi

A

,

Casais

C

,

C

,

IChimura

K

,

K

,

Shirasu

K

(

2003

)

HSP90 взаимодействует с RAR1 и SGT1 и необходимы для резистентности к RPS2. Арабидопсис

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

100

:

11777

11782

Vélez-Bermúdez

 

IC

,

Schmidt

 

W

(

2014

)

Загадка противоречивой экспрессии белка и мРНК. Являются ли растения особенными?

 

Передний завод Sci

 

5

:

619

WANG

W

,

Vignan

,

R

,

R

,

,

R

,

,

CRESTI

M

,

CRESTI

M

(

млн.

(

2006

)

Универсальный и быстрый протокол для извлечения белка и рекакристых тканей растений для протеомного анализа

.

Электрофорез

 

27

:

2782

2786

wu

x

,

xiong

E

,

E

,

W

,

,

W

,

,

CRESTI

M

,

CRESTI

M

(

2014 м

(

2014

)

Универсальный препарат для проб, интеграция трихлоруксусной кислоты / ацетона с экстракцией фенолом для протеомного анализа урожая

.

Nat Protoc

 

9

:

362

374

Xiong

L

,

Zhu

J-K

(

2003

)

Регуляция биосинтеза абсцизовой кислоты

.

Завод Физиол

 

133

:

29

36

xu

d

,

d

,

duan

x

,

wang

b

,

ггн

b

,

,

t

,

wu

R

(

1996

)

Выражение a Ген обильного белка позднего эмбриогенеза, HVA1, из ячменя придает устойчивость к дефициту воды и солевому стрессу у трансгенного риса

.

Завод Физиол

 

110

:

249

257

Yamada

K

,

Nishimura

M

(

2008

)

Цитозольный белок теплового шока 90 регулирует фактор транскрипции теплового шока у Arabidopsis thaliana

.

Поведение сигнала установки

 

3

:

660

662

Young

LW

,

WILEN

RW

,

RW

,

Bonham-Smith

PC

(

PC

(

50005 (

2004

)

Высокотемпературное напряжение предоставления латундки NAPA во время цветения МИКРО-MEGAGAMETOPHYTE, индуцирует аборт фруктов и нарушает производство семян

.

J Exp Bot

 

55

:

485

495

YUET

KP

,

Doma

MK

,

MK

,

NGO

JT

,

Sweredoski

MJ

,

GRAHAM

RL

,

MORADIAN

A

,

HESS

S

,

Schuman

EM

,

STRENNBERG

PW

,

TIRRELL

DA

(

2015

)

Специфический протеомный анализ клеток в CaenorhaBDitis Elegans

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

112

:

2705

2710

Zanetti

Me

,

Chang

IF

,

Gong

F

,

Galbraith

,

Galbraith

DW

,

Bailey-Serres

J

(

2005

)

Иммунопурификация полирибосомных комплексов для глобального анализа экспрессии генов

.

Завод Физиол

 

138

:

624

635

Чжан

G

,

Боулинг

H

,

H

,

,

Kirshenbaum

,

Kirshenbaum

K

,

KLANN

E

,

CHAO

MV

,

Neubert

TA

(

2014

)

Углубленный количественный протеомный анализ синтеза белка de novo, индуцированного нейтрофическим фактором головного мозга

.

J Proteome Res

 

13

:

5707

5714

ZinN

KE

,

Tunc-Ozdemir

,

M

,

Harper

JF

(

2010

)

Температурная стресс и завод Сексуальное воспроизведение: раскрытие самых слабых ссылок

.

J Exp Bot

 

61

:

1959

1968

Примечания автора

© Американское общество биологов растений, 2017 г.Все права защищены.

© Автор(ы), 2017 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Американского общества биологов растений. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

.

0 comments on “Схема биосинтеза белка: Ошибка 404. Страница не найдена • Онлайн-школа «Фоксфорд»

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.