Клетка мишень: Клетка-Мишень (Target Cell) — это… Что такое Клетка-Мишень (Target Cell)?

Понятие о клетках мишенях и рецепторах к гормонам

Клетки-мишени — это клетки, которые специфически взаимодействуют с гормонами с помощью специальных белков-рецепторов. Эти белки-рецепторы располагаются на наружной мембране клетки, или в цитоплазме, или на ядерной мембране и на других органеллах клетки.

Каждая клетка-мишень обладает наличием специфического рецептора к действию гормона, и часть рецепторов находится в мембране. Такой рецептор обладает стереоспецифичностью. У других клеток рецепторы расположены в цитоплазме – это цитозольные рецепторы, которые реагируют вместе с гормоном, проникающим внутрь клетки. Следовательно, рецепторы делятся на мембранные и цитозольные. Для того, чтобы клетка отреагировала на действие гормона необходимо образование вторичных посредников к действию гормонов. Это характерно для гормонов с мембранным типом рецепции.

Разрушение циклического АМФ происходит под действием фермента фосфодиэстеразы. Циклический ГМФ оказывает противоположное действие. При активации фосфолипазы C образуются вещества, которые способствуют накоплению внутри клетки ионизированного кальция. Кальций активирует протеинциназы, способствует мышечному сокращению. Диацилглицерол способствует превращению фосфолипидов мембраны в арахидоновую кислоту, которая является источником образования простагландинов и лейкотриенов.

Большинство рецепторов изучены недостаточно, потому что их выделение и очистка очень сложные, а содержание каждого вида рецепторов в клетках очень низкое. Но известно, что гормоны взаимодействуют со своими рецепторами физико-химическим путем. Между молекулой гормона и рецептором формируются электростатические и гидрофобные взаимодействия. При связывании рецептора с гормоном происходят конформационные изменения белка-рецептора и комплекс сигнальной молекулы с белком-рецептором активируется. В активном состоянии он может вызывать специфические внутриклеточные реакции в ответ на принятый сигнал.

В зависимости от строения гормона существуют два типа взаимодействия. Если молекула гормона липофильна, (например, стероидные гормоны), то она может проникать через липидный слой наружной мембраны клеток-мишеней. Если молекула имеет большие размеры или является полярной, то ее проникновение внутрь клетки невозможно. Поэтому для липофильных гормонов рецепторы находятся внутри клеток-мишеней, а для гидрофильных — рецепторы находятся в наружной мембране.

Для получения клеточного ответа на гормональный сигнал в случае гидрофильных молекул действует внутриклеточный механизм передачи сигнала. Это происходит с участием веществ, которых называют вторыми посредниками. Молекулы гормонов очень разнообразны по форме, а «вторые посредники» — нет.

Существует два главных способа передачи сигнала в клетки-мишени от сигнальных молекул с мембранным механизмом действия:

Механизмы передачи информации от гормонов внутри клеток-мишеней с помощью перечисленных посредников имеют общие черты:

  • одним из этапов передачи сигнала является фосфорилирование белков;

  • прекращение активации происходит в результате специальных механизмов, инициируемых самими участниками процессов, — существуют механизмы отрицательной обратной связи.

Гормоны являются основными гуморальными регуляторами физиологических функций организма, и в настоящее время хорошо известны их свойства, процессы биосинтеза и механизмы действия.

Эпифиз

Эпифиз, небольшое образование, расположенное у позвоночных под кожей головы или в глубине мозга; находится на средней линии тела, как и сердце, функционирует либо в качестве воспринимающего свет органа либо как железа внутренней секреции, активность которой зависит от освещенности. Образуется в эмбриогенезе в виде небольшого выпячивания дорсальной стенки промежуточного мозгового пузыря. Он вырабатывает и выделяет в кровь гормоны, которые регулируют все циклические изменения в организме: суточные, циркадные ритмы. Он получает световые раздражения от сетчатки через симпатические нервные пути, месячные циклы. У некоторых видов позвоночных обе функции совмещены. У человека это образование по форме напоминает сосновую шишку, откуда и получило свое название (греч. epiphysis – шишка, нарост).

Эпифиз снаружи покрыт соединительно-тканной капсулой, от которой отходят тонкие соединительно-тканные перегородки, которые делят железу на неотчетливые дольки. В перегородках находятся гемокапилляры. Строму долек составляют глиальные клетки, их концентрация возрастает к периферии, там они образуют краевую вуаль, а в центре располагаются пинеалоциты. Это нейросекреторные клетки, у них крупное ядро, хорошо развиты органеллы, а отростки этих клеток уходят в соединительно-тканные перегородки и заканчиваются на гемокапиллярах. В этих клетках вырабатывается нейроамин серотонин. Он вырабатывается в дневное время, а в ночное время он превращается в гормон серотонин. Эти гормоны действуют на гипоталамус.

Серотонин усиливает функцию, а мелатонини-ослабляет. Эти гормоны тормозят развитие половой системы. В эпифизе вырабатывается антигонадотропный гормон; гормон, который регулирует минеральный обмен; большое количество регуляторных пептидов (либеринов и статинов), которые реализуют свои эффекты либо через гипоталамус, либо непосредственно на гипофиз. Эпифиз достигает максимального развития в возрасте 5-7 лет, затем атрофируется и идет его минерализация (откладываются соли Са).

Эпифиз развивается в эмбриогенезе из свода (эпиталамуса) задней части (диэнцефалона) переднего мозга. У низших позвоночных, например у миног, могут развиваться две аналогичных структуры. Одна, располагающаяся с правой стороны мозга, носит название пинеальной, а вторая, слева, парапинеальной железы. Пинеальная железа присутствует у всех позвоночных, за исключением крокодилов и некоторых млекопитающих, например муравьедов и броненосцев. Парапинеальная железа в виде зрелой структуры имеется лишь у отдельных групп позвоночных, таких, как миноги, ящерицы и лягушки

.

«Клетка-мишень» при курении – тема научной статьи по фундаментальной медицине читайте бесплатно текст научно-исследовательской работы в электронной библиотеке КиберЛенинка

УДК 613.84-053.81-073:616.155.2

7. Jarrar D., Chaudry I. H., Wang P. // Int J Mol Med. 1999. Dec. Vol. 4. № 6. P. 575-583.

8. Knaus W., Douglas P., Wagner D. // Chest. 1991. Vol. 100. P. 1619-1636.

9. Le Gall J. P, Lemeshow S., Saulnier F. // JAMA. 1993. Vol. 270. P. 2957-2963.

10. Marshall J. C., Cook D., Cristou N. // Crit.Care. 1995. Vol. 23. P. 1638-1652.

11. Marshall J. C. // Sepsis. 1997. № 1. P. 11-12.

12. Russell J. A., Singer J., Bernard G. R., Wheeler A., Fullkerson W., Hudson L., Schein R., Summer W., Wright P., Walley K. R. // Crit.Care. 2000. Vol. 28. № 10. P 3405-3411.

13. Vincent J. L. Sepsis. 1997. Vol. 1. № 1. P. 53-54.

V V GOLUBTSOV, I. B. ZABOLOTSKIH, S. A. TKACHUK

DEVELOPMENT OF MUL TIPLE ORGAN FAILURE DEPEND ON FUNCTIONAL STA TEA T SEPSIS

The article summaries the results of clinical observation and treatment 59 sepsis patients. Definition were contained

traditional methods of research and omega-potential (OP) registered. Fixed — registration OPfrom -14 up to + 20 mV, after severe sepsis or septic shock, theposttraumaticperiod by serious current is accompanied or organ failure (64,3% after septic shock, 53,3% after severe sepsis). Registration OPfrom -15 up to -25 mV, MODS absence assumes. Registration OPfrom -26 up to -60 mVpredi cti on sepsis or severe sepsis with MODS.

The heaviest condition at septic patients is marked at decompensated functional condition (FC) development of a septic shock that corresponds to 82 (79,3/83) points on scale SAPS II. At patients, whose condition was estimated as a sepsis and a heavy sepsis, on a background subcompensated FC, weight corresponded to 55 (51/56,3) points on SAPSII. The least weight — 51 (46,8/53,4) point, characterized development SIRS or a sepsis on a background compensated FC.

Л. И. КАТЕЛЬНИЦКАЯ, М. К. АХВЕРДИЕВА, А. Э. МАЦИОНИС1, П. Э. ПОВИЛАЙТИТЕ1

ТРОМБОЦИТ — «КЛЕТКА-МИШЕНЬ» ПРИ КУРЕНИИ

ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», 2ГУЗ «Ростовское областное патолого-анатомическое бюро»

Курение является общепризнанным и достаточно хорошо изученным фактором риска развития многих хронических неинфекционных заболеваний [5-8, 10, 13]. Большинство известных патогенетических механизмов влияния курения на сердечно-сосудистую систему (ССС) описаны у лиц старших возрастных групп, имеющих не один фактор риска и длительный стаж табакокурения. Изменения ультраструктурных параметров тромбоцитов (ТЦ) также изучены у курильщиков со стажем курения не меньше 5 лет, имеющих клинические проявления той или иной патологии ССС. В связи с этим представляет интерес выявление ранних донозо-логических изменений ССС в процессе ее дезадаптации к действию фактора риска.

Материалы и методы

В данное исследование включены здоровые молодые курильщики 17-19 лет с предварительно исключенной сердечно-сосудистой патологией. Стаж курения исследуемых не превышал 2 лет, среднее количество выкуриваемых сигарет — 9,6 ± 0,4 штуки в день.

Объектами электронно-микроскопического и морфометрического исследования являлись фракции тромбоцитов (ТЦ) из периферической крови 8 курильщиков и некурящих доноров того же возраста, полученные в одинаковых временных и климатических условиях. Выделенные фракции в течение трех минут промывали холодным фосфатным буфером (рН 7,2-7,4) и затем обрабатывали для электронной микроскопии, делая срезы с кусочков размером не более 1 мм3. Использовали общепринятые методы обработки материала [9]. Фиксацию осуществляли в 2,5%-ном растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 1,5 часа при температуре 40 С и пост-фиксировали при той же температуре в 1%-ном раство-

ре четырехокиси осмия на том же буфере в течение одного часа. Проводку осуществляли в автомате для электронно-микроскопической проводки «Linx» (Leika, Германия) по стандартной прикладной программе. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и азуром11-основным фуксином. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «Ultracut» (Leica, Германия), контрастировали в аппарате «Ultrastаiner» (Leica) и просматривали в электронном микроскопе Philips EM-208. Для морфометрического анализа использовали ультратонкие срезы фракции ТЦ. Вывод изображения на компьютер осуществляли с помощью телекамеры «Gatan» (USA), снабженной контрольным монитором. Использовали аппаратно-программный комплекс для морфометрии AnalySis (Soft-Imaging Software, Germany), включающий PC/Pentium-100 и прикладные программы ввода и анализа изображения. Для анализа вводили поля зрения при увеличении x 5200, наиболее оптимальном для точного и одновременного измерения морфометрических параметров всей клетки и внутриклеточных структур ТЦ. Калибровку осуществляли введением изображения стандартной калибровочной решетки (Sigma) при том же увеличении. Также использовали лицензированный пакет программ для морфометрии «Sigma/Scan Image» (Jendal Scientific, Germany). Для объективизации данных пользовались методом случайного систематического подбора препаратов, описанным в литературе [11]. Проводили случайный отбор 3 блоков от каждого человека, наличие ТЦ контролировали под световым микроскопом на полутонких срезах. C выбранных блоков получали серию полутонких срезов. Шаг серии составлял 8 микрон, после чего получали серию ультратонких срезов для анализа в электронном микроскопе и последующей морфометрии. Строго соблюдалось требование

одинаковой толщины (300 ангстрем) и контраста. Для стандартизации контраста обработку срезов на сетках проводили одновременно в аппарате иКгаБ1атег (Ьеюа) и использовали фирменные (1_еюа) стандартные наборы растворов уранилацетата и цитрата свинца. С каждого образца вводилось 50 случайных полей зрения, таким образом, морфометрировалось по 150 ТЦ от каждого человека. Количественная оценка ультраструктуры ТЦ проводилась по следующим базовым параметрам: площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр ТЦ. Оценка состояния гра-нуломеров ТЦ проводилась по следующим базовым параметрам: количество, площадь светлых а-гранул, количество, площадь темных гранул. При вычислении периметра учитывали также плазматические мембраны внутренней примембранной системы вакуолей ТЦ, связанной с наружной плазматической мембраной. Вычислялись производные параметры: процентное соотношение средней площади, занимаемой гранулами (светлыми или темными), к средней площади ТЦ; число гранул (светлых или темных) на один тромбоцит; отношение среднего периметра ТЦ к средней площади.

Результаты исследования

Нами получено, что ультраструктура ТЦ из фракций некурящих доноров соответствует нормальному строению неактивных кровяных пластинок здоровых людей, описанному в работах других авторов, применявших сходные методы обработки тромбоцитарных фракций [1, 4]. Так, основная часть ТЦ имеет округлую или сферическую форму, наружная мембрана, как правило, покрыта хорошо выраженным слоем гликокаликса (рис. 1). Гиаломер, или цитоплазма ТЦ, имеет мелкогранулярную структуру. По периферии клетки цитоплазма выглядит, как узкий ободок, не содержащий орга-нелл, за исключением единичных, беспорядочно разбросанных частиц гликогена. Органоидная часть, или грануломер, представлена одной-двумя мелкими митохондриями, многочисленными цистернами и трубочками системы канальцев, вакуолярным аппаратом и гранулами, свободно располагающимися в цитоплазме. Визуально наблюдается также некоторая вариабельность в количестве, электронной плотности и рас-

Рис. 1. Ультраструктура тромбоцита в контрольной фракции некурящих доноров. Ув. 48 000.

Условные обозначения: Т — тромбоцит, г — гранула, стрелка — гликокаликс

пределении гранул, однако они всегда располагаются в цитоплазме свободно, не формируют конгломератов в центральной части клеток.

При исследовании тромбоцитарных фракций курильщиков выявлены существенные ультраструктурные сдвиги. Обращает внимание деформация ТЦ: практически все они имеют уродливую отросчатую форму, формирование как крупных, толстых отростков в виде пузырей, так и тонких, бичевидных отростков (рис. 2). ТЦ курильщиков располагаются более плотно, чем в контроле, имеет место формирование плотных контактов между их отростками. Большая часть тромбоцитов курильщиков оказалась вакуолизирована за счет расширения периферической и внутренней системы канальцев, выявлено значительное количество деграну-лированных клеток, появляются крупные мегатромбоциты, содержащие увеличенное количество гранул. Регистрируются ТЦ с повышенной электронной плотностью цитоплазмы. Псевдоподии причудливой формы, плотное расположение тромбоцитов, формирование межклеточных контактов между отростками, конденсация грануломера расцениваются нами как признаки активации и повышенной адгезивной способности тромбоцитов [2-4]. О повышенной проагрегацион-ной способности тромбоцитов курильщиков говорит появление в цитоплазме четко визуализируемых тяжей микрофиламентов, особенно многочисленных в периферических участках и вокруг грануломера. Выраженные отличия регистрируются по содержанию и распределению гранул гликогена в цитоплазме (рис. 3). Если в контрольной серии гликоген располагался равномерно по всей цитоплазме в виде отдельных частиц, то у курильщиков отмечено формирование периферических «озер», состоящих из конгломератов гликогена. Увеличение содержания и перераспределение гликогена могут быть расценены как компенсаторная реакция в ответ на гипоксическое повреждение ТЦ. Тромбоцитам большинства млекопитающих характерен высокий уровень энергетического обмена, поэтому ТЦ являются уязвимыми к любому гипоксическому повреждению. Повышение агрегации, формирование тесных конгломератов из клеток, как и само вдыхание табачного дыма, способствуют развитию гипоксии отдельных ТЦ.

Рис. 2. Ультраструктура тромбоцитарной фракции из крови курильщиков. Отросчатые и вакуолизированные формы клеток, осмиофильные ТЦ.

Ув. 15 500

Рис. 3. Конденсация грануломера в тромбоците из крови курильщика, увеличение содержания и перераспределение глыбок гликогена. Ув. 25 000. Условные обозначения: г — гранулы, стрелками указаны скопления гликогена

При этом значение средней площади ТЦ достоверно не изменяется, хотя и имеется тенденция к ее уменьшению. Значительно и достоверно (р<0, 01) — на 13% -увеличивается такой производный параметр, как длина мембраны тромбоцита, приходящаяся на 1 мкм2 его площади. Этот параметр косвенно характеризует состояние мембранорецепторного аппарата ТЦ, судя по выявленным сдвигам, его размеры и функциональная активность в группе курильщиков увеличены. Вполне вероятно, что у курильщиков констатирован феномен «расслабления» наружной мембраны ТЦ, который и приводит к формированию отростков и псевдоподий. Морфометрическое исследование параметров грануломера проводилось отдельно для а-гранул и для

Морфометрические параметры тромбоцитов курильщиков и некурящих доноров (М + м)

Параметр Контроль Курильщики

Периметр тромбоцитов (мкм) 9,58 ± 0,340 10,61 ± 0,274 *

Площадь тромбоцитов (мкм2) 2,42 ± 0,089 2,35 ± 0,073

Длина мембраны, приходящейся на 1 мкм2 4,24 ± 0,173 4,83 ± 0,129 **

% площади тромбоцитов, занимаемой темными гранулами 0,86 ± 0,137 1,69 ± 0,134 **

% площади тромбоцитов, занимаемой альфа-гранулами 5,17 ±0,624 7,19 ± 0,728 *

Площадь темных гранул (мкм2) 0,0311 ± 0,0011 0,0403 ± 0,0011***

Периметр темных гранул (мкм) 0,06761±0,01241 0,7625±0,01090***

Число темных гранул на 1 клетку 0,69 ± 0,084 1,04 ± 0,124*

Площадь альфа-гранул (мкм2) 0,0287 ± 0,00047 0,0331 ±0,00043***

Периметр альфа-гранул (мкм) 0,6484 ± 0,00538 0,6905±0,00471***

Число альфа-гранул на 1 клетку 4,43 ± 0,403 4,77 ± 0,345

Для получения более полных и объективных данных об ультраструктурных альтерациях тромбоцитов, связанных с курением, а также для выявления минимальных сдвигов в их тонком строении проводилось морфометрическое изучение некоторых параметров ультраструктуры кровяных пластинок. Результаты морфометрического анализа ТЦ в контрольной группе и в группе курящих представлены в таблице.

Анализ результатов исследования, представленный в таблице, свидетельствует о том, что курение приводит к достоверному (р<0,5) увеличению средней протяженности наружной мембраны ТЦ — на 10%, что по-видимому, связано с установленным при визуальном наблюдении фактом деформации ТЦ у курильщиков.

Примечание: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 — уровни значительности различия между сравниваемыми параметрами.

электронноплотных темных гранул (5ОТ-органелл). Полученные результаты свидетельствуют, что в группе курящих происходит значительное и достоверное увеличение количества темных гранул и занятой ими площади цитоплазмы (практически в 2 раза), а также достоверно увеличиваются размеры гранул — площадь и периметр (р<0,001). Можно предположить, что рост числа темных гранул связан с повышенной аккумуляцией серотонина ТЦ курильщиков. Число а-гранул не имело различий в контрольной и опытной группах, однако процент занятой ими площади цитоплазмы в тромбоцитах курильщиков достоверно (р<0,05) увеличивается на 40%.

В контроле основная часть ТЦ (70%) содержит не более трех гранул, а в группе курильщиков наблюдается гораздо больший разброс и увеличение процента ТЦ с повышенным содержанием а-гранул (55%). Эти изменения, судя по нашим данным, обусловлены высокодостоверным увеличением размеров а-гранул и их периметра (р<0,001).

Сопоставление полученных данных позволяет сделать заключение о сочетании у курильщиков двух процессов: активации синтеза компонентов а-гранул (увеличение размеров) и усиления выброса их содержимого (неизменность количества). Учитывая, что в а-гра-нулах содержатся факторы свертывающей и каллекре-ин-кининовой системы, данные изменения можно гипотетически рассматривать как предиктор тромбооб-разования на интактных сосудах у молодых здоровых курильщиков. Дополнительную информацию дает изучение процентного распределения ТЦ в общей популяции по изученным параметрам. Показано, что у курильщиков увеличивается содержание как мелких, так и крупных ТЦ, уменьшено число ТЦ средних размеров, в связи с чем среднее значение остается неизменным. Полученные результаты косвенно указывают на ускорение оборота кровяных пластинок у курильщиков, поскольку, по данным литературы, их размеры характеризуют возраст клетки [4]. Во фракциях тромбоцитов курильщиков получено увеличение процентного содержания как юных, крупных форм, так и, что особенно существенно, мелких старых.

Таким образом, визуальный и морфометрический анализ ультраструктуры ТЦ позволил выявить объективные отличия в строении кровяных пластинок курящих и некурящих доноров.

На основе проведенного нами анализа ультраструктуры тромбоцитов можно заключить, что даже у курильщиков со стажем до 2 лет и минимальным количеством выкуриваемых сигарет в день имеются не только пограничные, но и патологические изменения. Эти изменения заключаются не только в повышении агре-гационной способности ТЦ, но и в их дистрофических стигмах (периферические «озера» гликогена, появление ТЦ с повышенной электронной плотностью). Это весьма существенно, поскольку дистрофия является первым звеном в цепи патологических изменений ТЦ: дистрофия — дегенерация — дегрануляция — разрушение клетки, при этом нам не известно, насколько эти этапы удалены друг от друга. Признаков дегрануляции ТЦ нами выявлено не было, хотя для окончательного суждения необходимо определение в цитоплазме ТЦ содержащихся в гранулах факторов свертывания, биологически активных веществ, ферментов. Нами получено свидетельство повышенного депонирования серотонина в ТЦ курильщиков (достоверное увеличение количества темных гранул), а также усиленного синтеза компонентов а-гранул и их выброса, о чем свидетельствует значительное увеличение занимаемой ими площади при неизменности их количества. Данные изменения можно расценить как своеобразную

«гипертрофию» ТЦ, связанную, с одной стороны, с их повышенной функциональной активностью, с другой -с активацией захвата серотонина, каллекреина из крови курильщиков.

Эти пока обратимые сдвиги тонкого строения тромбоцита являются донозологическим базисом формирования сердечно-сосудистых заболеваний, «ценой», которую платит организм курильщика за адаптацию к воздействию такого фактора риска хронических неинфекционных заболеваний, каким является курение.

Поступила 18.10.2006

ЛИТЕРАТУРА

1. Балуда В. П., Балуда М. В., Деянов И. И. и др. Физиология системы гемостаза. М., 1995. 245 с.

2. Балуда В. П., Нестайко Г. В. Ультраструктура тромбоцитов как показатель их функционального состояния // Пробл. гематол. и перелив. крови. 1972. Т. 18. № 9. С. 3-10.

3. Васильева Е. Ю. Морфологические типы тромбоцитов здоровых людей: Сб. науч. тр. М., 1982. С. 37-39.

4. Вашкинель В. К., Петров М. Н. Ультраструктура и функция тромбоцитов человека. Л.: Наука, 1982. 88 с.

5. Кательницкая Л. И., Быков А. Т., Демакова Э. П. Многофакторная профилактика хронических неинфекционных заболеваний // Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний: Тез. научн. конф. М., 1995. С. 79.

6. Константинов В. В. Особенности эпидемиологии ишемической болезни сердца и факторов риска среди мужского населения в городах различных регионов: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1995. 24 с.

7. Оганов P Г, Масленникова Г Я., Шальнова С. А., Деев А. Д. Значение сердечно-сосудистых и других неинфекционных заболеваний для здоровья населения России // Профилактика заболеваний и укрепление здоровья. 2002. № 2. С. 3-7.

8. Тимофеева С. Г. Борьба с курением среди студентов как составная часть комплекса мероприятий ранней профилактики сердечно-сосудистых заболеваний: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1991. 29 с.

9. Bozzola J. J., Russel L. D. Electron Microscopy: principles and techniques for biologists. Boston: Jones and Bastlett Publishers, 1992. 542 р.

10. Idham I., Kalim H., Kusmana D. Coronary risk factor among ethnic Baduy: XIII World Congress of Cardiology. Rio de Janeiro, 1998. P 35-38.

11. Mayhew T. M. Efficient and unbiased sampling of nerve fibers for estimating fiber number and size // Methods in Neurosciences. Vol. 3. Quantitative and Qualitative Microscopy (ed. M. Conn), Academic Press, Inc., 1990. P. 172-187.

12. Nakayama T., Yokoyama T., Youshiike N. Riskfactors for stroke in the middle-aged and the elderly people with special reference to population attributabl risk percent: 4-th International Conference on Preventive Cardiology. Montreal, 1997. Vol. 13. P. 43 (abstr.)

13. Takkunen N. et. all. The impact of cardiovascular risk factor long-term mortalily in eldery: XIII World Congress of Cardiology. Rio de Janeiro, 1998. C. 26-30.

L. I. KATELNITSKAJA, M. K. AHVERDIEVA, A. E. MATSIONIS, P E. POVILAJTITE

TROMBOTSIT — «CELL-TARGET.» AT SMOKING

Ultrastructural changes of trombocytes at young smokers with preliminary excluded cardiovascular pathology have been studied. Signs of increase activation and adhesive abilities of trombocytes have been resealed along with indirect signs oh changing of membrane-receptoric apparatus, increasing of deposition of bioactive substances in trombocytes granules and sings of dystrophy and hypoxic damage of trobocytes. The changes of morphometric parameters are marked despite the minimal leuth of smoking and amound of smoke cigarettes.

Российские ученые обнаружили, что сила опухолевой клетки стала ее слабостью

Сотрудники факультета фундаментальной медицины МГУ описали механизмы функционирования и структуру гена белка Mcl-1, который не только препятствует клеточной гибели, но и может быть мишенью в противораковой терапии. Работа проходила в рамках проекта, поддержанного грантом Президентской программы исследовательских проектов Российского научного фонда, а ее результаты опубликованы в высокорейтинговом журнале Trends in Cell Biology.

Процессы программируемой клеточной гибели играют важную роль в противоопухолевой защите организма. У животных они запускаются, когда клетка повреждена, а у растений задействованы в образовании некоторых тканей. В клинической практике механизмы клеточной гибели используют, чтобы избирательно уничтожать опухолевые клетки.

«В нашей лаборатории мы пытаемся дать ответ не только на вопрос “От чего умирают опухолевые клетки?”, но также и на вопрос “Почему опухолевые клетки умирают от одного вещества, но не умирают от другого?”», — рассказывает один из авторов исследования, Вячеслав Сеничкин, кандидат биологических наук, сотрудник лаборатории исследования механизмов апоптоза факультета фундаментальной медицины МГУ.

Сейчас наиболее изученным типом программируемой клеточной гибели считается апоптоз: клетка распадается на отдельные тельца, которые быстро поедаются окружающими ее соседями. Этот процесс контролируют белки семейства Bcl-2, которые могут либо способствовать протеканию апоптоза, либо препятствовать ему. К последним относится белок Mcl-1. Из-за того, что Mcl-1 может защищать клетки от гибели, опухоли часто используют его, чтобы адаптироваться к разным стрессовым воздействиям, вызывающим апоптоз. Поэтому Mcl-1 — привлекательная мишень для противораковой терапии.

«Молодые сотрудники лаборатории Вячеслав Сеничкин, Алена Стрелецкая и Гелина Копеина провели детальный анализ всех данных, которые касаются возможных подходов к нейтрализации Mcl-1 в опухолях, а также потенциальных побочных эффектов. Для этого мы описали молекулярные особенности работы белка и его функции в клетках», — рассказал руководитель проекта Борис Животовский, доктор биологических наук, заведующий лабораторией.

Кроме того, авторы сформулировали теорию о веществах, которые могут вызывать специфическое разрушение Mcl-1 в протеасомах (клеточном аппарате, утилизирующем белки), и подтвердили ее.

Ученые проанализировали больше ста источников, касающихся Mcl-1, включая данные, полученные ранее в лаборатории МГУ. С помощью биоинформатических и структурных методов исследования они предсказали, как вещества с различной структурой воздействуют на Mcl-1. В частности, удалось объяснить структурные особенности, которые отличают два класса «замедлителей» Mcl-1. Первые из них, связываясь с Mcl-1, нейтрализуют действие этого белка, оставляя его в клетке. Вторая группа веществ, напротив, ведет к разрушению Mcl-1. Дальнейшие исследования должны дать ответ на вопрос о том, какая из групп ингибиторов Mcl-1 имеет больший терапевтический потенциал.

«Сейчас мы активно изучаем то, как блокаторы Mcl-1 влияют на разные опухолевые клеточные линии. Так мы систематизируем все знания и усовершенствуем подходы, нацеленные на нейтрализацию Mcl-1 в опухолях», — добавил Борис Животовский.

Задача исследований — выяснить причины устойчивости опухолевых клеток к антагонистам Mcl-1. Ученые отмечают, что аналог одного из используемых в работе соединений уже находится на первой фазе клинических испытаний, поэтому другая их задача — понять, на какие типы рака будет действовать этот препарат.

Русско-казахский словарь

` 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 - = Backspace Tab q w e r t y u i o p [ ] \ Delete CapsLock a s d f g h j k l ; ‘ Enter Shift z x c v b n m , . /

МФА:

син.

Основная словарная статья:

Нашли ошибку? Выделите ее мышью!

Короткая ссылка:

Слово/словосочетание не найдено.

В словаре имеются схожие по написанию слова:

Вы можете добавить слово/фразу в словарь.

Не нашли перевода? Напишите Ваш вопрос в форму ВКонтакте, Вам, скорее всего, помогут:

Правила:

  1. Ваш вопрос пишите в самом верхнем поле Ваш комментарий…, выше синей кнопки Отправить. Не задавайте свой вопрос внутри вопросов, созданных другими.
  2. Ваш ответ пишите в поле, кликнув по ссылке Комментировать или в поле Написать комментарий…, ниже вопроса.
  3. Размещайте только небольшие тексты (в пределах одного предложения).
  4. Не размещайте переводы, выполненные системами машинного перевода (Google-переводчик и др.)
  5. Не засоряйте форум такими сообщениями, как «привет», «что это» и своими мыслями не требующими перевода.
  6. Не пишите отзывы о качестве словаря.
  7. Рекламные сообщения будут удалены. Авторы получают бан.

CAR-клетки: идеальные солдаты против рака

Сайт Наука в Сибири 24 мая 2017 г.
Газета Наука в Сибири №22 (3083) от 8 июня 2017 г.
Сайт Академгородок 24 мая 2017 г.
Сайт Новости Сибирской Науки 24 мая 2017 г.

Лечение рака зачастую включает в себя методы с опасными последствиями: химио- и лучевую терапию, пересадку костного мозга… Однако с заболеванием можно бороться посредством клеток собственного организма — в том числе, чтобы минимизировать побочные эффекты. Это общемировое направление исследований разрабатывают ученые из Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН.

кбн АА Горчаков, кбн СВ Кулемзин

Концепция химерных антигенных рецепторов (CAR) была предложена израильскими учеными в 1993 году, но активный интерес к CAR-клеткам появился около семи лет назад, когда их применили для лечения пациентов с тяжелейшим заболеванием крови – рецидивирующим острым лимфобластным лейкозом. В итоге, больше половины таких больных полностью поправились. Последние данные показывают, что клетки с антигенными химерными рецепторами хорошо работают и для других вариантов рака крови.

Сила CAR-клеток

В оригинальной схеме получения и переноса CAR T-клеток у онкобольного берут T-лимфоциты, чтобы активировать и размножить в лаборатории. После этого в них доставляют ДНК-кассету, кодирующую сам химерный (состоящий из нескольких доменов) антигенный рецептор. Он включает в себя три части: внутриклеточную, мембранную и внеклеточную. Последняя отвечает за “поимку” опухолевых клеток — это своего рода торчащая “рука”, которой CAR T-клетка нащупывает свою мишень. Внеклеточная часть, как правило, представлена фрагментом моноклонального антитела, способного избирательно связываться с одним из белков на поверхности опухолевой клетки.

Антитела (или иммуноглобулины) — белки, направленные против конкретных антигенов, а также основные молекулы иммунной системы. Антигеном является молекула, которую организм рассматривает как чужеродную и потенциально опасную, а потому начинает вырабатывать против нее собственные антитела.

На последнем этапе CAR Т-клетки размножают и возвращают в организм пациента. Когда такая клетка узнает своего “врага” при помощи внеклеточной части CAR, она его сразу же убьет. Преимущество заключается в том, что это может происходить многократно: уничтожив одну мишень, CAR T-клетка не выходит из строя и продолжает передвигаться по организму в поисках следующей.

— Получается, они встречают на своем пути два типа клеток: нормальные, которые не опознают, и раковые, которые убивают, — рассказывает кандидат биологических наук Андрей Горчаков. — При этом после каждой встречи с мишенями CAR T-клетки еще и делятся: то есть увеличивающееся “войско” будет мигрировать по телу пациента, пока не убьет все чужеродные клетки. Получается эффект “магической пули”: лекарство, введенное единожды, работает до победного. Главное — пациент получает свои же клетки, но измененные таким образом, чтобы они научились узнавать конкретный рак.

Сейчас ученые ИМКБ СО РАН пытаются модифицировать CAR-клетки, чтобы они не только несли химерные антигенные рецепторы, но и воздействовали на болезнь другими способами: раз они уже находятся в организме, почему бы не поработать изо всех сил? Их можно заставить секретировать вещества, стимулирующие другие иммунные клетки, например, макрофаги в опухоли — чтобы атаковать ее прямым и непрямым способом.

Макрофаги — клетки, способные к захвату и перевариванию бактерий, остатков погибших клеток и других чужеродных или токсичных для организма частиц.

— Изначально наше внимание было сконцентрировано на солидных или “твердых” раках, — добавляет кандидат биологических наук Сергей Кулемзин. — CAR-клетки лучше работают с диссеминированными, “жидкими” раками: в таком случае “больные” клетки плавают по одной (равно как и CAR T), и их проще убить. Однако при наличии твердой опухоли CAR Т-клетке нужно пробраться внутрь нее, что не так просто: опухоль создает вокруг себя особое микроокружение, которое “отпугивает” клетки иммунной системы, и даже если они проникают вглубь, их активность быстро угнетается. В итоге, например, макрофаги из “правильных” становятся “неправильными” и не только не борются с опухолью, но даже помогают ей выживать. Мы подумали, что в одной клетке можно совместить химерный антигенный рецептор и секрецию молекул, заставляющих макрофаги подключаться к поеданию опухолевых клеток.

Сейчас ряд научных коллективов ищет способы, как сделать CAR-клетки более “злобными” и избирательными по отношению к противнику. Ученые ИМКБ СО РАН также пытаются оптимизировать структуру химерного антигенного рецептора. Дело в том, что расстояние между CAR Т-клеткой и опухолевой клеткой играет важную роль в эффективности уничтожения и накладывает ограничение на то, какой химерный рецептор подойдет для конкретной мишени. Таким образом, для того, чтобы CAR работал мощно, необходимо точно подобрать его длину, гибкость и доменный состав. Кроме того, важно, сколько молекул CAR находится на поверхности CAR-клетки, какова плотность молекул-мишеней на поверхности опухолевой клетки и аффинность (сила связывания) CAR со своей целью.

— Как часто происходит в биологии, в дизайне CAR важно соблюдать баланс, — рассказывает Андрей Горчаков. — Так, если химерный антигенный рецептор “слабоват”, то CAR Т-клетки будут упускать из виду опухолевые со сниженной плотностью мишени, что крайне нежелательно. С другой стороны, если CAR Т-лимфоцит намертво связывается с опухолевой клеткой, то ему становится достаточно проблематично перейти к “охоте” за следующим “врагом”.

Сложность в том, что не все экспериментальные подходы, которые хорошо работают в пробирке или организме мыши, будут так же действовать на пациента. Кроме того, у любой терапии есть свои риски. Описаны случаи, когда CAR T-клетки, нацеленные убивать, например, раковые B-клетки, вполне предсказуемо уничтожали и нормальные B-лимфоциты, потому что на обоих была одна и та же B-мишень. Это ожидаемый побочный эффект, вполне решаемый заместительной терапией иммуноглобулинами, пока CAR T-клетки не очистят организм от перерожденных В-клеток. Для CAR T-клеточной терапии были описаны и более тяжелые реакции: при уничтожении огромной массы клеток опухоли происходило перевозбуждение иммунной системы пациента и развивался так называемый цитокиновый шторм: состояние, при котором резко падает давление, путается сознание, идет нагрузка на внутренние органы, затрудняется дыхание.

— При проведении клинических испытаний CAR T-клеток из нескольких сотен онкогематологических больных во время терапии погибло шесть человек, — добавляет Андрей Горчаков. — Причем не было свидетельств того, что виновата именно CAR T-методика, так как она применялась в сочетании с другими достаточно тяжелыми терапиями на пациентах с неизлечимыми формами острого лимфобластного лейкоза. Соотношение риска и потенциального преимущества для больного при таком подходе гораздо более благоприятно, чем, например, при химиотерапии или пересадке костного мозга, хотя это достаточно распространенная схема лечения.

CAR-клетки или антитела?

Для борьбы с раком также активно используются моноклональные антитела. Однако по сравнению с ними у CAR T-клеток есть несколько важных преимуществ: иммуноглобулины вводят курсами по несколько месяцев, что довольно дорого и долго. CAR T-клетки достаточно использовать лишь единожды и таким образом добиться стабилизации болезни или полного излечения.

— Антитела частично могут убивать опухоль сами, но наиболее результативно они действуют за счет работы иммунной системы, — рассказывает Сергей Кулемзин. — Основной механизм работы такой: они связываются с клеткой-мишенью и служат своеобразным флажком для клеток иммунной системы — смотрите, это раковая клетка! А если у онкобольного иммунитет уже в плохом состоянии, что чаще всего и наблюдается после всех курсов химиотерапии? В таком случае введение антител оказывается малоэффективным.

Многие используемые в онкологии моноклональные антитела — мышиного происхождения: например, широко известный препарат ритуксимаб. Поэтому в редких случаях у больных может развиваться иммунный ответ на введение чужеродных для человека антител, что делает невозможным продолжение такой терапии. Наконец, антитела — достаточно крупные молекулы, эффективные по отношению к опухолевым клеткам, до которых просто добраться: небольших очагов или метастазов. Если опухоль крупная, пассивное проникновение внутрь на один миллиметр зачастую занимает неделю. В то же время CAR T-клетки можно запрограммировать так, чтобы они активно двигались туда, где меньше кислорода — вглубь опухоли.

— CAR T-клетки — сочетание сильных сторон антител и клеточной терапии, — добавляет Андрей Горчаков. — Помимо того, что CAR T-клетка, вооруженная химерным антигенным рецептором, может направленно нападать на опухоль и глубоко в нее проникать, чего антитела, как правило, не делают, в запущенных случаях опухолевые клетки часто прячутся от иммунной системы там, куда она не “дотягивается”: например, в мозге или спинномозговой жидкости. Антитела слишком крупные, чтобы попасть туда в большой концентрации и отмаркировать опухолевые клетки на уничтожение. Это позволяет раковым клеткам спокойно пережить курс вводимых антител, что впоследствии может привести к рецидиву заболевания. Такая проблема частично решается именно с помощью CAR T-клеток: T-лимфоциты могут проникать, куда хотят, и добивать прячущиеся чужеродные клетки.

CAR-клетки: натуральные киллеры

Модифицируя внеклеточную часть химерного антигенного рецептора, можно менять специфичность CAR-клеток. В ИМКБ СО РАН CAR-технологии также разрабатывают на базе не T-, а NK-лимфоцитов (Natural killer cells): у этих “прирожденных убийц” своя собственная система поверхностных рецепторов, распознающих злокачественные, чужеродные и зараженные вирусами клетки.

— Прелесть использования NK-клеточных линий как носителей CAR прежде всего в их универсальности: достаточно один раз сделать CAR-NK клетки, нарастить их в огромном количестве, расфасовать по пакетам и вводить многим пациентам, — поясняет Сергей Кулемзин.— Зарубежные группы проверили методику на мышах и получили весьма обнадеживающие результаты. Такую технологию проще внедрить в клинику: не надо забирать клетки у конкретного человека и вводить ему же, что получается дешевле, а соответственно, ближе к российским реалиям. Это универсальный подход для разных пациентов с одним типом рака — в зависимости от того, какую “мишень” вы зададите CAR-клеткам.

Пока что ученые ИМКБ СО РАН проводят основные эксперименты in vitro и только приступили к работе с мышами, чтобы понять, как можно повысить эффективность CAR-терапии. На сегодняшний день CAR NK-клетки против рака простаты уже уничтожают в пробирке опухолевые. Исследователи планируют поэтапно редактировать геном клеток с химерными антигенными рецепторами, чтобы они были максимально выносливы в раковом окружении, уничтожали чужеродные клетки, а иммунные активно стимулировали к борьбе — в общем, становились идеальными солдатами.

— На практике для каждого этапа необходима долгая отладка: должны соблюдаться все требования создания лекарств для человека, а еще нужно продумать процесс получения CAR-клеток в поточном формате, — заключает Сергей Кулемзин. — Кроме того, не совсем ясно, какова позиция такой методики в законодательном пространстве РФ: могут ли медики в соответствии с федеральным законом о клеточных технологиях применять ее на пациентах или нет? Клинических испытаний в России пока не было, так что возникает вопрос, близки ли CAR-клетки к внедрению в России. Однако подход на голову опережает другие способы: прежде всего, лечение собственными клетками сводит побочные эффекты к минимуму. Мы видим по научным статьям зарубежных ученых, насколько высок потенциал подобного способа терапии, так что нужно прилагать все усилия, чтобы в нашей стране он применялся на практике.

Алёна Литвиненко, фото автора

PDF-файл статьи

ВИЧ/СПИД > Версия для печати

Сейчас в мире нет человека, который не знал бы, что такое ВИЧ-инфекция. Распространенность ВИЧ носит сейчас характер настоящей пандемии. ВИЧ-инфекция захватила практически все страны. В России каждый час ВИЧ – инфекцией заражается 10 человек. В Красноярском крае каждый день заражаются 12 человек, в г. Красноярске – 8 человек.



Судите сами. При гриппе, например, заразились – и тут же высоченная температура, все кости ломит, тело буквально кричит: «Лечите меня»!

А при ВИЧ? Вирус попал в организм, и… ничего.

Точнее, начался очень опасный процесс, который без лечения с большой вероятностью приведёт к смерти. Но не сразу, а лет через 9-11 – в отсутствие терапии это средний срок жизни с ВИЧ.

Что будет, если не лечиться? Как же развивается болезнь, если не вмешиваются медики?

ПЕРИОД 1: «ОКНО»

Сравнение нашей иммунной системы с крепостью – слишком простое. Скорее так: это не просто крепость с валами, рвами и крепкими стенами, но ещё все эти стены и входы/выходы оборудованы массой датчиков, сенсоров, систем наблюдения и контроля. Эта «служба безопасности» распознаёт и блокирует, как задумала природа, любое нежелательное вторжение, уничтожает врагов.

У целого ряда клеток иммунной системы – T-хелперов, моноцитов, макрофагов и так далее – на поверхности имеется общее «устройство связи», рецепторы CD4. К этому «устройству» и научился подключаться вирус иммунодефицита, чтобы проникнуть в клетку.

Зачем ему это надо? Вирус – паразит, у которого нет своей ДНК, необходимой для размножения. Есть только РНК – генная информация о нём самом. Попав в клетку-мишень, он встраивает в неё свою биологическую программу – так сказать, «подменяет чертежи» – и начинает использовать ДНК клетки для собственного размножения.

Сразу же после проникновения в организм «диверсант» никак себя не проявляет.

Этот инкубационный период ещё называют «окном», он может длиться от 2 недель до полугода с момента заражения. В это время вирус зачастую не обнаруживается тестами, однако риск заражения инфицированным человеком других людей уже появляется.

Поэтому, если у вас была вероятность заразиться ВИЧ, лучше не успокаиваться на первом же отрицательном тесте, а повторить анализ через 3 месяца. Хотя гораздо лучше не допускать такой вероятности и использовать презерватив!

ПЕРИОД 2: ВНЕЗАПНАЯ «ПРОСТУДА»

После завершения инкубационного периода ВИЧ в организме, как правило, проявляет себя гриппоподобными симптомами. Это может быть повышение температуры с увеличением лимфатических узлов и селезёнки, иногда возникают стоматит, пятнистая сыпь, диарея и так далее. Такая псевдо-ОРВИ длится, как правило, пару недель – иногда меньше, иногда заметно больше.

Коварство «медленного убийцы» заключается в том, что человек чаще всего сталкивается с известными ему симптомами – ну подумаешь, лихорадка.

Определить, что в этом случае её вызвал такой опасный возбудитель, как ВИЧ, могут только специальные тесты.

ПЕРИОД 3: НИЧЕГО НЕ БОЛИТ

Медики называют эту стадию субклинической, а проще – бессимптомной. Вирус снова никак себя не проявляет, но активно размножается в организме.

Т-лимфоциты, иммунные клетки, воспроизводят вирус, вместо того чтобы защищать организм. Выжав все соки из поражённой иммунной клетки, вирусные частицы покидают её, чтобы заселиться в другую клетку. Помимо убийства собственно вирусом, «переметнувшаяся» на его сторону клетка T-хелпер может быть уничтожена клеткой T-киллером – «службой собственной безопасности», обнаружившей «предательство». Получается, что иммунные клетки гибнут по разным причинам, их становится всё меньше, и в какой-то момент вся система безопасности организма начинает рушиться.

Без лечения эта стадия может длиться от 2 до 20 лет, но в среднем – лет 6-7. Затем начинается катастрофическое развитие событий, которое и называют СПИДом – синдромом приобретённого иммунодефицита. В то же время начатая вовремя антиретровирусная терапия «замораживает» болезнь на бессимптомной стадии.

ПЕРИОД 4. СПИД – ТЕРМИНАЛЬНАЯ СТАДИЯ

У СПИДа – синдрома приобретённого иммунодефицита – нет собственных симптомов. Его суть в том, что организм, в котором число иммунных клеток стало критически малым, вдруг оказывается неспособен противостоять так называемым оппортунистическим инфекциям. В частности, грибкам и бактериям, которые постоянно живут в нашем теле и никак ему не вредят, пока мы здоровы. Какой именно вирус, грибок или другой патоген поразит ослабленный организм? Тут вариантов масса.

В России один из наиболее опасных возбудителей, который дремлет в теле здорового человека, но приводит к тяжёлой болезни при СПИДе – палочка Коха, широко распространённая в популяции и вызывающая туберкулёз. Другая смертельно опасная и частая болезнь в продвинутой стадии развития ВИЧ-инфекции – пневмоцистная (вызванная грибками) пневмония.

Помимо лёгких, у больного СПИДом могут быть поражены головной мозг, органы пищеварения, опорно-двигательный аппарат. Частые последствия разрушительного действия ВИЧ – онкозаболевания.

Как долго человек может сопротивляться СПИДу, зависит от тяжести поражения различных систем организма.

У самой известной жертвы болезни – певца Фредди Меркьюри – от первых проявлений СПИДа до смерти от пневмонии прошло почти шесть лет.

В лечении СПИДа борьба с присоединившимися заболеваниями не менее важна, чем антиретровирусная терапия (АРТ), направленная непосредственно против ВИЧ.

Но главное – запомните: лечить СПИД чаще всего уже поздно!

Выход – не доводить болезнь до терминальной стадии. И современные специальные лекарства это позволяют. Они блокируют размножение вируса, и хотя полностью вывести его из организма не могут, иммунная система продолжает прекрасно справляться со своими задачами. Люди с ВИЧ могут жить долгую полноценную жизнь и иметь здоровых детей. Не доводя до СПИДа.

Видео:


Мифы о ВИЧ
Основные пути передачи ВИЧ-инфекции
А вы знали ВИЧ-статус каждого своего партнера?
Смерть

Реагенты для молекулярной биологии New England Biolabs

CRISPR-Cas* системы — часть адаптивного иммунитета бактерий и архей. Эти организмы используют CRISPR-Cas для защиты от чужеродных нуклеиновых кислот, входящих в состав вирусов или плазмид, попадающих в клетку.

Обычно такая система состоит из двух основных компонентов – crРНК (CRISPR РНК) и белков Cas. В геноме бактерии или археи crРНК закодирована в виде набора элементов: уникальных последовательностей (спейсеров), фланкированных короткими повторами.

 

Спейсеры соответствуют чужеродным последовательностям нуклеотидов, с которыми раньше сталкивалась клетка. РНК, считанная со спейсера, формирует комплекс с белками-нуклеазами Cas, а затем комплементарно связывается с последовательностью-мишенью, что запускает деградацию мишени. Бактерии и археи могут включать в геном новые спейсеры после встречи с новым биологическим агентом.

 

Эндонуклеаза Cas9

 

В биотехнологии наиболее широко используются CRISPR-Cas системы II типа, считающиеся наиболее простыми. В такой системе работает только одна нуклеаза Cas (Cas9), которая помогает созреванию crРНК, участвует в поиске мишени и ее разрезании. Кроме crРНК, в процессе участвует tracrРНК. crРНК для каждого спейсера не считывается по отдельности, вместо этого транскрибируется сразу весь набор (CRISPR-кассета, pre-crРНК). tracrРНК, связанная с такой pre-crРНК образует двухцепочечную структуру, которая узнается и разрезается РНКазой III на отдельные маленькие crРНК, соответствующие одному спейсеру и окружающим его повторам. tracrРНК и отдельные crРНК составляют с Cas9 комплекс, который находит таргетную последовательность и вносит двухцепочечный разрез.

Такую систему можно легко собрать и доставить в выбранную клетку, объединив в векторе последовательности гена эндонуклеазы Cas9 и кассеты CRISPR. Для более удобного практического применения tracrРНК и crРНК соединяют и объединяют в одну sgРНК (single-guide RNA), а вместо РНКазы III в клетках эукариот работают других рибонуклеазы.

Большой популярностью пользуется эндонуклеаза Cas9, изначально выделенная из бактерии Streptococcus pyogenes. Ее применяли для редактирования генома множества живых организмов: от бактерий и дрожжей до обезьян и человека. Эту эндонуклеазу можно выбрать в каталоге на сайте [https://www.skygen.com/katalog/reagenty_i_rashodnye_materialy/new_england_biolabs/reaktivy_dlya_modi….

Кроме классической версии фермента, можно также найти его модификации. Например, Cas9 с сигналом ядерной локализации, облегчающим проникновение в ядро клетки или инактивированный белок dCas9. Фермент dCas9 лишен своей эндонуклеазной функции и способен только связываться с таргетной последовательностью. На N-конец dCas9 дополнительно помещен SNAP-tag, с которым могут взаимодействовать флуорофоры и биотин. С их помощью можно визуализировать локализацию dCas9 и целевой последовательности в клетке. В каталоге можно подобрать и нуклеазу Cas12, используемую, в том числе, для скрининга мутаций. Представленный на сайте фермент Cas12 еще и работает в широком диапазоне температур: от 16 до 48C.

 

CRISPR-Cas системы в биотехнологии

 

Открытие системы CRISPR-Cas привело к прорыву в области методов редактирования генома. На основе этого подхода можно относительно просто создать инструмент, который будет специфически узнавать любую выбранную последовательность и вносить разрез рядом с ней.

Методы, основанные на применении CRISPR-Cas, позволяют:

• выключить ген-мишень (нокаут гена), разрезав его. В таком случае, клетка использует процесс негомологичного соединения концов разрезанной ДНК — стандартный путь репарации двухцепочечных разрывов. Такой механизм довольно неточен, в результате чего в целевой последовательности могут образовываться делеции, инсерции и, соответственно, сдвиги рамки считывания, приводящие к потере функции гена. Такой подход используется в лабораториях для изучения функции гена и создания моделей человеческих заболеваний в других организмах.

• вставить нужную последовательность в определенный участок генома (нокин), используя процесс гомологичной рекомбинации. Такой способ работает, если в ядре есть образец для восстановления участка генома — сестринская хроматида или последовательность, предоставленная исследователем, так называемая донорная ДНК. Например, если необходимо исправить дефектную копию гена в клетке человека, достаточно внести такой двухцепочечный разрез, и система репарации восстановит целостность ДНК, используя вторую, нормальную аллель.

• направить систему на определенные последовательности в геноме патогенов или вредоносные мутации в ДНК человека. Таким образом можно проводить диагностику заболевания или же уничтожать возбудителя. Методы скрининга на основе системы CRISPR-Cas обычно связаны с использованием репортерной молекулы ДНК. Такая ДНК соединяет между собой флуорофор и тушитель флуоресценции, из-за чего свечения не происходит. После узнавания и связывания комплекса sgРНК и нуклеазы Cas с мишенью в геноме патогена, происходит разрезание не самой мишени, а репортерной ДНК. Для этого используются другие ферменты, не Cas9, а Cas12 или Cas13. В результате такой побочной реакции флуорофор и тушитель освобождаются, испускается флуоресцентный сигнал, который можно детектировать. Этот способ позволяет детектировать не только вирусы или бактерии, но и мутации в геноме человека, например, связанные с развитием рака.

• вносить не двухцепочечные, а одноцепочечные разрезы с участием двух sgРНК и повышать специфичность редактирования. Это можно сделать, если немного изменить белок Cas. Такой вариант нуклеазы называется никазой. Никаза может делать разрезы в сайтах на разных цепях ДНК, близких друг к другу. В результате ее работы получаются фрагменты с липкими концами, которые более специфично взаимодействуют с гомологичной последовательностью и уменьшают вероятность вмешательства в нецелевые участки генома.

• изменять экспрессию определенных генов в клетке. Белки Cas можно инактивировать так, чтобы они были способны связываться с мишенью, но не разрезать ее. Если слить такой инактивированный фермент с транскрипционным фактором, Cas при помощи sgРНК будет узнавать последовательность гена и связываться с ним, а транскрипционный фактор активировать или подавлять экспрессию.

• визуализировать определенные части хромосом. Если вместо транскрипционного фактора соединить с инактивированным белком Cas флуоресцентную метку, можно определить локализацию интересующей последовательности генома.

 

Функциональные признаки антител, эффекторных клеток и клеток-мишеней, влияющих на опосредованную NK-клетками антителозависимую клеточную цитотоксичность

Ключевые моменты

  • Статус фукозилирования IgG и плотность Ag в клетке-мишени определяют ADCC NK-клеток.

  • Неспецифический сывороточный IgG, связанный с FcγRIIIa и гликокаликсом клеток-мишеней, ограничивает ADCC NK-клеток.

  • FcγRIIIa NK-клеток преимущественно занят высокоаффинными афукозилированными сывороточными IgG.

Visual Abstract

Abstract

Ат-зависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ) является одним из наиболее важных эффекторных механизмов действия антител, нацеленных на опухоль, в современных иммунотерапевтических средствах.При ADCC и других Ab-зависимых активациях миелоидных эффекторных клеток необходим тесный межклеточный контакт (между эффектором и клеткой-мишенью) и образование иммунологических синапсов. Тем не менее, нам все еще не хватает базовых знаний об основных факторах, влияющих на потенциал ADCC терапевтических Abs. В этом исследовании мы исследовали объединенную роль пяти факторов, влияющих на ADCC, опосредованную NK-клетками человека, а именно: 1) плотность Ag, 2) состав мембран клетки-мишени, 3) полиморфизм IgG FcγR, 4) FcγR-блокирующие цитофильные антитела и 5) FcγR-блокирующие цитофильные антитела. Фукозилирование АБ.Мы демонстрируем, что на величину ответов ADCC, опосредованных NK-клетками, в основном влияет плотность Ag и фукозилирование Ab. Афукозилирование последовательно индуцировало эффективную ADCC даже при очень низкой плотности Ag, когда фукозилированные антитела-мишени не вызывали ADCC. Со стороны эффекторной клетки полиморфизм FcγRIIIa-Val/Phe158 влиял на активность ADCC, при этом NK-клетки, экспрессирующие вариант Val158, демонстрировали более активную ADCC. Кроме того, мы определили содержание сиаловой кислоты в мембране клетки-мишени как важный ингибирующий фактор для ADCC.Кроме того, мы обнаружили, что присутствие и статус гликозилирования неспецифических эндогенных антител, связанных с NK-клетками FcγRIIIa (цитофильные антитела), определяют блокирующий эффект на ADCC. Эти пять параметров влияют на активность антител in vitro и должны быть дополнительно протестированы в качестве предикторов эффективности in vivo.

Введение

Антитела образуют первую линию защиты адаптивной иммунной системы от инфекционных агентов. IgG Ab особенно важны из-за их длительного периода полувыведения и разнообразных эффекторных функций, индуцирующих как активацию комплемента, так и Ig FcγR-опосредованные эффекторные функции.Это включает фагоцитоз и Ab-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), последняя из которых особенно важна для защиты от инфицированных вирусом клеток, а также для терапевтического применения Ab при лечении рака. Однако ADCC также является важным признаком некоторых АТ-опосредованных патологий, таких как гемолитические болезни плода и новорожденного, при которых материнские антитела IgG образуются против отцовских АГ на эритроцитах плода, вызывая тяжелые, а иногда и опасные для жизни анемия (1, 2).

Для повышения эффективности терапии mAb используется инженерия Ab, и было обнаружено много оригинальных способов улучшения их функций (3).Это включает в себя инженерию как белкового остова, так и прикрепленных к нему гликанов. IgG млекопитающих содержат высококонсервативный N -связанный сайт гликозилирования в части Fc, который необходим для его эффекторных функций, как для FcγR, так и для связывания компонента комплемента C1q (4–7). Этот гликан, присоединенный к остатку аспарагина (Asn) в положении 297, имеет биантеннарную структуру с ядром, состоящим из остатков маннозы и N -ацетилглюкозамина, которое может быть различным образом расширено за счет других фрагментов сахара, включая галактозу, сиаловую кислоту, N -ацетилглюкозамин и фукоза.Незначительные изменения в составе гликана Asn297 влияют на аффинность связывания IgG с FcγR, тем самым точно регулируя величину инициируемых эффекторных функций, включая ADCC и Ab-зависимый клеточный фагоцитоз (1, 4, 5, 8–10).

В последние годы стало очевидным, что ответные реакции антител человека на аллоантигены (1, 11, 12) и некоторые вирусные белки (13, 14) демонстрируют признаки пониженного фукозилирования, что повышает их потенциал ADCC. Это особенно поразительно, так как гликаны Fc IgG человека обычно сильно фукозилированы (~94%) (4, 15), а афукозилирование гликана Asn297 увеличивает сродство к FcγRIIIa (CD16a), что улучшает запускаемые Fc эффекторные функции (1, 15). 4, 8, 16–18).Из-за этих характеристик неудивительно, что средства гликоинженерии, направленные на снижение фукозилирования Fc (гипофукозилирования), уже применяются для повышения эффективности терапевтических антител в иммунотерапии рака (16, 19, 20).

Фукозилированные противоопухолевые антитела обычно вызывают более слабую ADCC клеток-мишеней, опосредованную NK-клетками (20). В отличие от гипофукозилированных IgG, фукозилированные антитела иногда не способны запускать ADCC, опосредованную NK-клетками (4, 8, 21). Неожиданно было обнаружено, что даже относительно высокие концентрации фукозилированных антител недостаточны для индукции лиллинга (4, 21, 22).Влияние афукозилирования IgG на величину ADCC NK-клетками может зависеть от Ag и, в частности, от плотности Ag-мишени, природы самого Ag, а также от структурной ориентации эпитопа на Ag. Состав мембраны клетки-мишени, на которой отображается Ag, является еще одним фактором, который может влиять на ADCC. Эритроциты, например, имеют толстый гликановый слой, содержащий сиаловую кислоту, называемый гликокаликсом, который придает этим клеткам отрицательный заряд, известный как ζ-потенциал.Со стороны эффекторной клетки фактором, мешающим эффективности ADCC, является полиморфизм FcγRIIIa. Было описано, что высокоаффинный вариант FcγRIIIa с остатком валина в положении 158 (Val158) и низкоаффинный вариант FcγRIIIa-фенилаланин 158 (Phe158) имеют 2-5-кратное различие в аффинности к фукозилированному IgG1 (4, 8, 23). ).

Вдохновленные загадочными выводами о том, что фукозилированные антитела иногда не обладают очевидной эффекторной функцией, в то время как идентичные гипофукозилированные IgG часто вызывают сильную ADCC, мы проанализировали различные параметры, влияющие на эффективность ADCC, опосредованной NK-клетками, как на стороне эффектора, так и на стороне клетки-мишени.Это включало полиморфизм FcγRIIIa, природу антигена, состав гликокаликса и цитофильные антитела (неспецифические эндогенные антитела, прикрепленные к поверхности эффекторных клеток посредством связывания FcγR). В этом исследовании мы демонстрируем, что величина ответа ADCC, опосредованного NK-клетками, на эритроциты зависит от сложного взаимодействия между гликозилированием Ag, Ab, свойствами клеток-мишеней и эффекторных клеток.

Материалы и методы

Производство mAb и гликоинженерия

Векторы экспрессии (pcDNA3.1) кодирующий человеческий моноклональный IgG1 со специфичностью к Kell (более конкретно: K Ag, обозначаемый как K) (24), резус D (RhD) (4, 25) или 2,4,6-тринитрофенол (TNP) (26) Ag трансфицировали в клетки HEK 293 Freestyle с использованием 293fectin (Invitrogen) или PEI MAX (Polysciences) (24–26). Для получения гипофукозилированных антител IgG1 к культуре добавляли 0,2 мМ 2-дезокси-2-фтор-1-фукозы (Carbosynth) за 1 ч до трансфекции. Через 5 дней супернатант собирали, фильтровали и очищали в системе ÄKTAprime plus (GE Healthcare Life Sciences) с помощью аффинной хроматографии с использованием колонки с белком A HiTrap HP (GE Healthcare Life Sciences), как описано ранее (4).

Клетки

NK-клетки были получены из гепаринизированной крови здоровых доноров, генотипированы по полиморфизму FCGR3A -Val/Phe158 (или FCGR3A -Val/Phe176) (rs396991) и отобраны на наличие двух копий 9 FCGRA 9002 и отсутствие открытой рамки считывания для FCGR2C (27, 28). Генотипирование проводили путем мультиплексной амплификации зонда, зависящей от лигирования, как описано ранее (29). NK-клетки были свежевыделены за день до анализа ADCC из полученной градиентом фракции PBMC Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Life Sciences) с использованием MACS MicroBeads, покрытых антителами к CD56 человека (Miltenyi Biotec), в соответствии с протоколом производителя.После выделения NK-клетки инкубировали в течение ночи при 37°C и 5% CO 2 в IMDM (Life Technologies) с добавлением 10% (об./об.) FCS при плотности 1–1,5 × 10 6 клеток/мл. .

эритроцитов были получены от хорошо охарактеризованных доноров, экспрессирующих K Ag на гликопротеине Kell или RhD на разных уровнях: R2R2 (DcE/DcE; 15 800–33 300 RhD на клетку), R1r (DCe/dce; 9900–14 600 RhD на клетку) и слабый тип D 3 (DCe/dce; <100–10 000 RhD на клетку) (30). Изолированные эритроциты были любезно предоставлены Отделом диагностики эритроцитов, Sanquin.Эритроциты обрабатывали 0,5% бромелайном (K1121; Sanquin) путем добавления бромелайна 2:1 к уплотненным клеткам и инкубации в течение 10 мин при 37°С. Для обработки нейраминидазой 1 ЕД/мл нейраминидазы (Roche) разводили в PBS и добавляли 1:1 к уплотненным клеткам, и клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°C. Для облегчения TNP-лирования эритроцитов упакованные клетки инкубировали с различными концентрациями (25–0,2 мкМ) 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (Sigma-Aldrich) 1:1, разведенной в буфере Na 2 HPO 4 (pH 10) (4) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин.После обработки эритроциты трижды промывали PBS.

Элюция NK-клеток

MACS-выделенные NK-клетки промывали в среде RPMI 1640 без добавок (Life Technologies) и центрифугировали в течение 5 мин при 700 × g . Затем клетки инкубировали в RPMI 1640 (pH 7,4) или подкисленной HCl RPMI 1640 (pH 3,0) при 1 × 10 7 клеток/мл в течение 5 мин, после чего клетки снова центрифугировали (5 мин, 700 × г ). Супернатант собирали и разбавляли 1:1 нормальным RPMI 1640 для нейтрализации низкого pH.Клетки ресуспендировали в PBS с добавлением 0,1% (об./об.) BSA для дальнейшего анализа с помощью проточной цитометрии. Этап ночной элюции описан в предыдущем подразделе. Для восстановления плазмы NK-клеток, элюированных в течение ночи, клетки инкубировали с их собственной неразбавленной или 100-кратно разбавленной донор-специфической плазмой в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем эти клетки дважды промывали в среде RPMI 1640.

ИФА IgG

Для определения концентрации IgG в донорской плазме и элюированных из NK-клеток был проведен ИФА IgG, как описано ранее, с некоторыми адаптациями (31).Планшеты с плоским дном в 96 лунок (Nunc MaxiSorp) покрывали в течение ночи при 4°C 100 мкл (1 мкг/мл) мышиного античеловеческого IgG (R10Z8E9; Abcam). Планшеты блокировали и затем инкубировали в течение 1 ч со 100 мкл образца, разведенного 1:1 в PBS, с добавлением 0,05% (об./об.) Tween 20. Затем планшеты инкубировали со 100 мкл (1 мкг/мл) HRP-конъюгированного мышиного IgG человека (клон Mh26, PeliClass; Sanquin) в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали PBS 0,05% (об./об.) Tween 20 между каждой стадией инкубации, детекцию проводили тетраметилбензидином и останавливали 2 М H 2 SO 4 .Поглощение измеряли на планшет-ридере BioTek (BioTek), а концентрации IgG1 в образцах рассчитывали путем интерполяции с использованием стандартной кривой IgG.

Анализ гликозилирования IgG

Антитела IgG очищали из 1 мкл сыворотки и 100 мкл элюатов NK-клеток с использованием аффинной матрицы CaptureSelect FcXL (Thermo Fisher Scientific) в 96-луночном фильтровальном планшете (Millipore MultiScreen), как описано ранее (32). Очищенные молекулы IgG элюировали 100 мМ муравьиной кислотой (Honeywell) в пластины с V-образным дном и сушили вакуумным центрифугированием в течение 2 с.5 ч при 60°С. Затем молекулы IgG растворяли в 50 мМ бикарбоната аммония (Sigma-Aldrich) и добавляли 200 нг трипсина, модифицированного для секвенирования (Promega). После 17 ч инкубации образцы хранили при -20°С до использования.

Очищенные гликопептиды из сыворотки разбавляли в 50 раз, а элюаты NK-клеток в неразбавленном виде подвергали анализу методом обращенно-фазовой наножидкостной хроматографии-масс-спектрометрии с использованием системы UltiMate 3000 RSLCnano (Dionex/Thermo Fisher Scientific), соединенной с MaXis HD. Квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр (Bruker Daltonics), оснащенный Nano-Booster (Bruker Daltonics) с использованием распыляющего газа, легированного ацетонитрилом (класс жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии; BioSolve).(Глико-)пептиды улавливали 100 % растворителем А (0,1 % муравьиной кислоты в воде) и разделяли в градиенте воды (растворитель А) и 95 % ацетонитрила (растворитель В) с 0,1 % муравьиной кислоты: 1 % В 0– 5 мин, линейный градиент до 27% B 5–20 мин, промывка при 70% B 21–23 мин и повторное уравновешивание при 1% B 24–58 мин. В текущем исследовании мы сосредоточились на IgG1, не анализируя IgG3 из-за его возможной интерференции с IgG2 и IgG4 на уровне гликопептидов (33). Данные масс-спектрометрии анализировали с использованием программного обеспечения Skyline, и количественный анализ следов пептида MS1 считали надежным, когда время удерживания и точность массы соответствовали стандартному расщеплению IgG, а экспериментальная изотопная оболочка для каждого пептида соответствовала теоретическому распределению.Кроме того, все следы проверялись вручную и удалялись, если они были близки к шуму или содержали пептидные/химические помехи. Общий уровень признаков гликанов рассчитывали, как описано ранее Dekkers et al. (4).

Анализ ADCC

Анализы ADCC, опосредованные NK-клетками, проводили, как описано ранее, с некоторыми небольшими корректировками (4). Вкратце, инкубированные в течение ночи NK-клетки центрифугировали при 1700 об/мин в течение 7 минут и ресуспендировали в свежей среде IMDM с добавлением 10% (об./об.) FCS.Клетки-мишени эритроцитов (1 × 10 8 ) метили 100 мкКи 51 Cr (PerkinElmer) в течение 45 мин при 37°C. После мечения эритроциты дважды промывали PBS с последующим ресуспендированием в IMDM с добавлением 10% (об./об.) FCS в концентрации 4×10 5 /мл. 51 Cr-меченые клетки-мишени смешивали с NK-клетками в соотношении E:T 1:2 (0,5 × 10 5 :1 × 10 5 ) в присутствии специфического Ab (анти-RhD/ K/TNP в указанных концентрациях) и осаждали в 96-луночные планшеты с V-образным дном (Thermo Fisher Scientific).В эксперименте по блокированию NK-клетки сначала инкубировали в течение 15 минут с серийно разбавленными антителами против TNP при 37°C, а затем смешивали с антителами против RhD и клетками-мишенями. После инкубации планшетов в течение 2 ч при 37°С супернатант собирали и измеряли радиоактивность на гамма-счетчике Cobra II (Packard BioScience). Фоновое и максимальное уничтожение определяли путем инкубации клеток-мишеней только в среде IMDM и в среде IMDM, содержащей 2,5% (об./об.) сапонина (Fluka; Sigma-Aldrich) соответственно.Проценты лизиса клеток в конечном итоге рассчитывали по следующей формуле: все образцы измеряли в трех повторностях для каждого эксперимента.

Проточная цитометрия

Для определения уровня опсонизации эритроцитов антитела против RhD/K/TNP титровали в PBS (в концентрациях, указанных на рисунках и в подписях к рисункам) и позволяли связывать их специфический Ag на мембране эритроцитов в течение 30 мин при 4°С. После двух промывок клетки (5×10 5 ) инкубировали с PE-конъюгированными фрагментами F(ab’) 2 козьего античеловеческого IgG1 IgG1 2 (SouthernBiotech) в течение 30 мин при 4°C.Все разведения, суспензии и промывки проводили в PBS с добавлением 0,5% (об./об.) BSA (Sigma-Aldrich).

Агглютинин Sambucus nigra (Vector Laboratories) конъюгировали с Dylight 405 с использованием набора Dylight Conjugation Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя и использовали для определения содержания сиаловой кислоты в эритроцитах, обработанных бромелаином и нейраминидазой (5 × 10 5 ). Уровни гликофорина А (GPA) в эритроцитах, обработанных бромелаином или нейраминидазой (5 × 10 5 ), определяли путем окрашивания первичным мышиным анти-человеческим IgG1 GPA (Sanquin Reagentia) с последующим окрашиванием вторичным аллофикоцианин-конъюгированным козьим анти- окраска IgG1 мыши (Thermo Fisher Scientific).Необработанные эритроциты брали с собой в качестве положительного контроля.

После инкубации с окончательным окрашиванием клетки дважды промывали. На FACSCanto II (BD Biosciences) было измерено не менее 10 000 событий. Для гейтирования образцов эритроцитов прямое и боковое рассеяние устанавливали по логарифмической шкале, а пороговое значение устанавливали на 200. NK-клетки, изолированные MACS, гейтировали на основе их характерной картины прямого и бокового рассеяния, чтобы исключить другие типы клеток из анализа.

Анализ данных и статистика

Данные проточной цитометрии были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo) и программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences).Статистический анализ и подбор нелинейной кривой (агонист против ответа: переменный наклон, четыре параметра) выполняли в программном обеспечении GraphPad Prism версии 7.04 (программное обеспечение GraphPad). Уровень значимости был установлен на уровне p ≤ 0,05 и определен с использованием множественных двусторонних парных или непарных тестов t , как указано в подписях к рисункам.

Результаты

Степень опсонизации клеток-мишеней зависит от плотности Ag

Сначала мы оценили влияние плотности Ag на степень опсонизации клеток-мишеней с использованием двух АТ, нацеленных на АГ групп крови эритроцитов (RhD и Kell), и одного АТ, нацеленного на случайную связанный TNP Ag.Связывание TNP Ag с эритроцитами (TNP-связывание) облегчило анализ широкого диапазона плотностей Ag. Кроме того, были отобраны хорошо охарактеризованные доноры эритроцитов, экспрессирующие либо K Ag на гликопротеине Kell (обозначаемый как K; 3500–6100 Ag на эритроцит), либо RhD на высоком (R2R2; 15 800–33 300), промежуточном (R1r; 9900– 14 600) или низкий (слабый D; <100–10 000) уровни (30). Эти специфические эритроциты были опсонизированы насыщающей концентрацией mAb человека, нацеленной на соответствующий Ag (дополнительная рис. 1). Как и ожидалось, опсонизация IgG эритроцитов коррелировала с плотностью Ag (рис.1А). Наблюдалась 30-кратная разница в опсонизации между эритроцитами с высоким (12,5 мкМ) и низким (3,1 мкМ) TNP, измеренная по средней геометрической интенсивности флуоресценции (gMFI) 18 600 и 616 соответственно, что примерно соответствовало 32- кратно меньшая степень ТНП-лирования. Между R2R2 и слабыми D-эритроцитами наблюдалась 25-кратная разница в уровне опсонизации (gMFI 28 287 и 1115 соответственно). Опсонизация эритроцитов K + находилась в том же диапазоне, что и опсонизация слабых эритроцитов D, что соответствует плотности Ag, описанной для этих групп крови (30).

РИСУНОК 1. ADCC, опосредованная

NK-клетками, зависит от плотности Ag. ( A ) Уровни опсонизации RhD- и K Ag-экспрессирующих и TNP-зависимых эритроцитов с их специфическими фукозилированными (черные столбцы) или гипофукозилированными (серые столбцы) моноклональными IgG1 (5 мкг/мл). Данные представляют значения gMFI ± SEM. ( B ) ADCC, опосредованная NK-клетками (процент ± стандартная ошибка среднего) по отношению к эритроцитам, опсонизированным фукозилированным или гипофукозилированным IgG1, как показано на (A). NK-клетки получали от доноров FcγRIIIa Val/Val158 .На этом рисунке данные одного эксперимента, проведенного в двух или трех повторностях, нанесены как представитель трех независимых экспериментов. Отдельные точки данных изображаются в виде белых треугольников с гистограммами, указывающими среднее значение. Достоверные различия определялись двусторонним непарным тестом t и отмечены звездочками. * р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001, **** р < 0,0001.

ADCC, опосредованная NK-клетками, зависит от плотности антигена-мишени и статуса фукозилирования IgG Копии гена Val158 и отсутствие открытой рамки считывания для

FCGR2C (27, 28)].В целом, плотность Ag коррелировала с ADCC-способностью фукозилированных и гипофукозилированных Ab, где более высокая плотность Ag на клетке-мишени приводила к более высоким ответам ADCC (рис. 1B). Эритроциты последовательно лизировались более эффективно в присутствии гипофукозилированных антител по сравнению с их фукозилированным аналогом (рис. 1В). В соответствии с предыдущими экспериментами ADCC с фукозилированными антителами против RhD (4), наблюдалось незначительное уничтожение клеток-мишеней R1r и слабого D. Однако при использовании эритроцитов с высокой плотностью RhD Ag (R2R2) в качестве клеток-мишеней наблюдался небольшой ответ ADCC (~5%), что позволяет предположить, что одним из факторов, ограничивающих ADCC с фукозилированными антителами против RhD, является низкая экспрессия RhD на эритроцитах. .Низкая плотность Ag также, по-видимому, ограничивает опосредованную NK-клетками ADCC эритроцитов, экспрессирующих K Ag, с фукозилированными антителами против K (рис. 1A, 1B).

Интересно, что эритроциты со случайно связанным TNP вызывали более высокую ADCC с фукозилированным и гипофукозилированным IgG1 по сравнению с RhD-экспрессирующими клетками-мишенями R2R2 и R1r при аналогичном уровне опсонизации (рис. 1, дополнительные рис. 2A, 2B). Например, опосредованная NK-клетками ADCC 6,3 мкМ TNP-содержащих эритроцитов была более эффективной по сравнению с ADCC R1r RBC (фукозилированный IgG1 p <0.0001; гипофукозилированный IgG1; p = 0,0053) (рис. 1Б). Однако эта разница в ADCC между сопоставимыми уровнями опсонизации терялась при более низких концентрациях Ag (слабый D по сравнению с 0,8 мкМ TNP-зависимыми эритроцитами, p = 0,185, p = 0,952) (рис. 1B). Из-за дифференциального функционального ответа между анти-TNP и анти-RhD при более высоких уровнях опсонизации (R2R2 и R1r RhD по сравнению с эквивалентной опсонизацией анти-TNP) мы предположили, что это может быть связано с различным положением или подвижностью Ag по отношению к плазме. мембрана.Отрицательный поверхностный заряд (34, 35) эритроцитов, возникающий в результате толстого гликокаликса с гликанами, содержащими сиаловую кислоту, вызывает силы отталкивания по отношению к другим клеткам (ζ-потенциал) и обычно предотвращает агглютинацию эритроцитов (36, 37). Поскольку TNP связан случайным образом, его расстояние от липидной мембраны эритроцитов, скорее всего, более вариабельно по сравнению с природными АГ на Келле (глобулярный внеклеточный домен) и RhD (многослойный мембранный белок), которые, как известно, находятся очень близко к мембране (38, 39).Следовательно, синапсы ADCC, включающие анти-TNP, теоретически могут образовываться с большей готовностью, потому что (часть) эпитопов более доступны, более подвижны и / или могут сталкиваться с меньшими силами отталкивания по сравнению с синапсами анти-RhD / анти-K, которые требуют Ag-Ab. взаимодействия ближе к мембране.

Гликокаликс эритроцитов ограничивает активность ADCC

Чтобы проверить влияние гликокаликса RBC на ADCC, опосредованную NK-клетками, RhD + , K + и TNP-зависимые эритроциты обрабатывали протеазой бромелаином, которая расщепляет гликопротеины. которые составляют гликокаликс эритроцитов, расщепляя их преимущественно после остатка лизина, аланина или тирозина (37).В целом, ADCC эритроцитов заметно усиливалась при использовании эритроцитов, обработанных бромелаином (рис. 2А). Наиболее поразительно, что лечение бромелаином значительно повышало эффективность ADCC эритроцитов R2R2 с фукозилированным анти-RhD с 3,7 до 67,1% ( p = 0,0012) и R1r RBC с 0,5 до 30,7% ( p = 0,0009) (рис. 2А). , дополнительный рис. 2A, 2B). При низкой плотности Ag (слабые D и K) обработка бромелаином усиливала ADCC с гипофукозилированными антителами ( p = 0,0041, p = 0,0147), чего не наблюдалось с фукозилированным аналогом ( p = 0.2294, p = 0,2534) (рис. 2А, дополнительная рис. 2С). В целом, при одинаковых уровнях опсонизации индуцированные бромелайном кратные различия были ниже для ADCC с фукозилированными антителами против TNP, чем с антителами против RhD (рис. 2A, дополнительные рис. 2A, 2B), что позволяет предположить, что гликокаликс более сильно ограничивает ADCC для RhD, чем для эпитопов TNP. Кроме того, это показывает, что удаление слоя гликопротеина усиливает реакцию ADCC без повышения уровня опсонизации эритроцитов.

РИСУНОК 2.

Содержание сиаловой кислоты в гликокаликсе эритроцитов подавляет ADCC за счет NK-клеток.( A ) Корреляция между ADCC (процент ± стандартная ошибка среднего) и средними уровнями опсонизации, измеренными с помощью gMFI, с помощью фукозилированного (левая панель) и гипофукозилированного (правая панель) IgG1 для необработанного (незаштрихованные символы) или обработанного бромелаином (закрашенные символы) TNP-латированного (серые кружки), RhD- (черные квадраты) и K- (светло-серые треугольники), выражающие мишени RBC. Кривые (сплошные для необработанных и пунктирные для обработанных бромелаином) представляют собой нелинейную аппроксимацию. ( B F ) (B) R2R2, (C) R1r, (D) слабый D RhD-, (E) K-экспрессирующий и (F) TNP-обработанные эритроциты обрабатывали нейраминидазой (полосатые столбцы) или нет (сплошные столбцы) и впоследствии использовались в качестве клеток-мишеней в анализе ADCC, опосредованном NK-клетками, в присутствии фукозилированного (черный) или гипофукозилированного (серый) IgG1 против специфического Ag.Ответы ADCC (процент ± SEM). На этом рисунке один эксперимент, проведенный в трех повторностях, изображен как представитель трех независимых экспериментов. Отдельные точки данных изображены в виде белых треугольников с гистограммами, указывающими среднее значение (B–F). NK-клетки получали от доноров FcγRIIIa Val/Val158 . Значимые различия внутри групп между фукозилированными и гипофукозилированными определяли с помощью двустороннего парного теста t и между обработками с помощью двустороннего непарного теста t и обозначали звездочками.Статистические сравнения между группами для фукозилированного и гипофукозилированного IgG1 выделены жирным шрифтом. ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Поскольку бромелайн расщепляет все гликопротеины в мембране эритроцитов, включая очень распространенный гликопротеин GPA (дополнительная рис. 2D) , как удаление физического барьера, так и удаление отрицательного поверхностного заряда (ζ-потенциала) эритроцитов может объяснить усиление ADCC. Чтобы уменьшить ζ-потенциал при сохранении физического барьера, эритроциты обрабатывали ферментом нейраминидазой, которая специфически расщепляет отрицательно заряженные α-2,6-связанные сиаловые кислоты (дополнительная рис.2Е). Обработка эритроцитов нейраминидазой увеличивала способность ADCC аналогично обработке бромелаином (рис. 2B-F), предполагая, что отрицательный ζ-потенциал гликокаликса, а не физический барьер, ограничивает активность ADCC.

Фенотип FcγRIIIa влияет на активность ADCC в отношении эритроцитов и зависит от ζ-потенциала

Чтобы определить влияние полиморфизма FcγRIIIa–Val/Phe158 на активность ADCC, NK-клетки от 18 здоровых добровольцев с генотипом FCGR3A были протестированы в установке ADCC. с эритроцитами R2R2.Когда необработанные эритроциты с высокой экспрессией RhD (R2R2) использовали в качестве клеток-мишеней, фенотип FcγRIIIa (от низкой до высокой аффинности: Phe/Phe158, Val/Phe158 и Val/Val158) значительно влиял на ADCC, опосредуемую NK-клетками, как с фукозилированные и гипофукозилированные анти-RhD IgG1 (рис. 3). Эти изменения были относительно небольшими, что согласуется с предыдущими выводами (4, 8). Однако ADCC эритроцитов R2R2, обработанных бромелаином с фукозилированным антителом против RhD, сильно зависела от фенотипа FcγRIIIa донора NK-клеток (рис.3). В этих условиях (обработанный бромелаином R2R2 и фукозилированный анти-RhD IgG1) способность ADCC с Val/Phe158- или Val/Val158-экспрессирующими эффекторными клетками была почти в 3 раза выше по сравнению с Phe/Phe158-экспрессирующими NK-клетками (Phe/ Phe158 означает 28,2% и Val/Val158 76,9%, p = 0,0006; Phe/Phe158 28,2% и Val/Phe158 78,4%, p < 0,0001). Это также наблюдалось для промежуточных (R1r) и низких (слабый D) RhD-экспрессирующих клеток-мишеней после обработки бромелаином (дополнительная фиг.3). В целом, влияние фенотипа FcγRIIIa NK-клеток отсутствовало или было менее заметным при использовании гипофукозилированных антител против RhD (рис. 3, дополнительная рис. 3).

РИСУНОК 3. Полиморфизм

FcγRIIIa–Val/Phe158 влияет на ADCC посредством фукозилированного IgG1. Точечная диаграмма рассеяния, показывающая средние ответы ADCC (в процентах) NK-клеток от 18 различных доноров с генотипом FCGR3A (указанных для фенотипов FcγRIIIa: Phe/Phe158, Val/Phe158, Val/Val158) по отношению к нелеченым (слева от пунктирной линии) или бромелайну — обработанные (справа от пунктирной линии) экспрессирующие RhD эритроциты (R2R2) в присутствии фукозилированных (черные точки) или гипофукозилированных (серые точки) анти-RhD IgG1 (5 мкг/мл).Для каждого донора наносят среднее значение эксперимента, проведенного в трех экземплярах. Статистически значимые различия между условиями ADCC с использованием одного и того же донора NK-клеток определяли с помощью двустороннего парного теста t . Статистически значимые различия для фукозилированного или гипофукозилированного IgG1 между NK-клетками разного фенотипа выделены жирным шрифтом и были определены с помощью двустороннего непарного теста t . Значимые различия отмечены звездочками. * р < 0.05, ** р < 0,01, **** р < 0,0001.

Количество и статус фукозилирования цитофильных антител определяют способность блокировать ответы ADCC специфическими антителами

Большое количество аспецифических эндогенных/цитофильных антител, присутствующих in vivo, конкурирует за связывание с FcγRIIIa на NK-клетках и потенциально препятствует ответам ADCC. Чтобы изучить это, мы сначала определили блокирующую способность фукозилированных и гипофукозилированных антител против TNP, которые могут конкурировать за связывание FcγR, в анализе ADCC против RhD.В соответствии с более высокой аффинностью к FcγRIIIa гипофукозилированные антитела против TNP блокировали ADCC эритроцитов с помощью фукозилированных анти-RhD IgG1 более эффективно по сравнению с фукозилированным аналогом (фиг. 4А).

РИСУНОК 4. Статус фукозилирования цитофильных антител

и их способность блокировать ответы ADCC. ( A ) Зависимое от концентрации блокирование фукозилированного анти-RhD IgG1- (0,2 мкг/мл) специфического ответа ADCC (нормализованный процент ± стандартная ошибка среднего) фукозилированным (черный) или гипофукозилированным (серый) неспецифическим анти-TNP IgG1.Для нормализации значений ADCC использовали контрольные условия без блокировки Abs (контроль установлен на 100%). Вычисленные IC 50 показаны вертикальными пунктирными линиями для блокирования фукозилированным (черный) или гипофукозилированным (серый) анти-TNP IgG1. Один эксперимент, проведенный в трех повторностях, изображен как представитель трех независимых экспериментов. ( B ) Иллюстративные гистограммы проточной цитометрии, показывающие наличие цитофильного IgG на свежевыделенных NK-клетках после контроля (pH 7,4) (светло-серый) или кислотности (pH 3.0) (темно-серый) элюирование. Неокрашенные клетки (белые) были включены для целей контроля. Цитофильный IgG на NK-клетках выявляли с помощью фрагментов козьего античеловеческого IgG F(ab)’ 2 . ( C ) Присутствие (по данным gMFI ± SEM) IgG человека на свежих (белых) или элюированных при 37°C в течение ночи (O/N) NK-клетках, которые впоследствии были восстановлены (или нет, темно-серые) собственными неразбавленная (светло-серая) или исходное увеличение ×100–разбавленная (светло-серая, полосатая) донор-специфическая плазма. NK-клетки были выделены от четырех разных доноров, и их соответствующий фенотип FcγRIIIa показан на рисунке.Один эксперимент, проведенный в двух повторностях, изображен как представитель трех независимых экспериментов. Отдельные точки данных изображаются в виде белых треугольников с гистограммами, указывающими среднее значение. Значимые различия были определены множественным тестом t с поправкой Холма-Сидака. ** р < 0,01, *** р < 0,001. ( D ) Фукозилирование Asn297 (в процентах) IgG, элюированных из свежевыделенных NK-клеток (левая панель, 10 доноров) и из O/N-элюированных NK-клеток, которые были воссозданы собственной донор-специфической плазмой до элюирования кислотой ( правая панель, четыре донора).Степени фукозилирования определяли методом масс-спектрометрии. Фукозилирование IgG анализировали из общей плазмы (черные квадраты) и из NK-клеток после элюции контроля (pH 7,4) (белые кружки) и кислотной (pH 3,0) (светло-серые треугольники). Образцы от одного донора соединяют линией. Дополнительные признаки гликозилирования см. в дополнительной рис. 4B. Статистические различия между уровнями фукозилирования в общей плазме и IgG, элюированных кислотой, определяли с помощью двустороннего парного теста t , и значимые различия отмечены звездочками.* р < 0,05, **** р < 0,0001. ( E ) Ответы ADCC (процент ± SEM) NK-клеток [различные обработки, как в (C), в отношении клеток R2R2 с фукозилированным (левая панель) и гипофукозилированным (правая панель) анти-RhD IgG1 (5 мкг/мл)]. Один эксперимент, проведенный в трех повторностях, изображен как представитель трех независимых экспериментов. Отдельные точки данных изображаются в виде белых треугольников с гистограммами, указывающими среднее значение. Значимые различия были определены множественным тестом t с поправкой Холма-Сидака.* р < 0,05, ** р < 0,01.

Мы подтвердили наличие цитофильного IgG на свежевыделенных NK-клетках, где количество было несколько выше на NK-клетках от доноров FcγRIIIa Val/Val158 (рис. 4B, 4C), что согласуется с предыдущими наблюдениями (40). Чтобы захватить и изучить эти цитофильные антитела, была проведена кислотная элюция (5 мин при pH 3,0), что привело к истощению антител из NK-клеток (рис. 4B, дополнительная рис. 4A). Степень фукозилирования этих цитофильных антител была значительно ниже, чем в плазме (рис.4D, левая панель; Дополнительная рис. 4B, левая панель), что согласуется с более высокой аффинностью гипофукозилированного IgG1 к FcγRIIIa (4, 8, 16–18), который, таким образом, будет дольше оставаться на NK-клетках во время процедур выделения. Затем мы оценили, влияют ли эти цитофильные IgG, связанные с NK-клетками, на ответы ADCC, как мы наблюдали для анти-TNP IgG (рис. 4A). Результаты показывают, что оставшиеся FcγRIIIa-связанные цитофильные антитела, присутствующие на свежевыделенных NK-клетках, не ингибировали или лишь слегка ингибировали активность ADCC в нашем анализе in vitro по сравнению с NK-клетками, которые были лишены IgG при инкубации в течение ночи (20 ч при 37°C) до сохраняют жизнеспособность и функциональность (рис.4Е).

Чтобы воспроизвести ситуацию in vivo, элюированные в течение ночи NK-клетки были восстановлены с использованием их собственной донор-специфической плазмы. Количество IgG, связанного с NK-клетками, было примерно в 10 раз выше по сравнению со свежевыделенными NK-клетками (рис. 4C), а последующая кислотная элюция этих реконструированных из плазмы NK-клеток показала, что степень фукозилирования была немного ниже по сравнению с IgG из плазмы (рис. 4C). Рис. 4D, правая панель; Дополнительный рис. 4B, правая панель). Стадия восстановления плазмы, по-видимому, уменьшала реакцию ADCC, индуцированную фукозилированным анти-RhD IgG1, но не гипофукозилированным анти-RhD (рис.4Е). Когда для воссоздания NK-клеток использовали 100-кратно разбавленную фракцию плазмы, ответ ADCC не снижался, что указывает на то, что высокая оккупация FcγRIIIa на NK-клетках необходима для блокирования ADCC посредством фукозилированного анти-RhD IgG1 (рис. 4E). . В заключение, цитофильные антитела на изолированных NK-клетках показали более низкое фукозилирование, но не влияли на ответы ADCC in vitro. Однако цитофильные антитела потенциально блокируют ответы ADCC in vivo, в зависимости от концентрации антител и статуса фукозилирования.Следовательно, цитофильный IgG можно рассматривать как еще один параметр, влияющий на ADCC, опосредованную NK-клетками, в дополнение к другим параметрам, определенным в этом исследовании (рис. 5).

РИСУНОК 5.

Параметры, участвующие в ADCC, опосредованной NK-клетками. ( A ) Схематическое изображение иммунологического синапса между эффекторными (серыми) и IgG-опсонизированными клетками-мишенями (оранжевые) посредством взаимодействий Ab-FcγRIIIa (синие). Параметры, изображенные на этом рисунке, представляют собой плотность Ag (красные кружки), ζ-потенциал/гликокаликс (розовый, толщина указывает на величину отрицательного поверхностного заряда), статус фукозилирования IgG1 (темно-серый) и цитофильные антитела (желтый).( B ) Обзор, дающий спектр параметров (изображенных на A), определяющих величину ADCC с анти-RhD IgG1. Проценты ADCC получены из результатов, изображенных на рис. 3 и дополнительном рис. 3. Чтобы проиллюстрировать величину ADCC, проценты имеют цветовую кодировку от 0% уничтожения (красный) до 100% уничтожения (синий).

Обсуждение

ADCC является одним из наиболее важных эффекторных механизмов терапевтических Abs, направленных на опухоль. В этом исследовании мы определили вклад пяти параметров в индукцию ADCC, опосредованную NK-клетками, in vitro.Они представлены на рис. 5, который показывает полный спектр, начиная с наименее сильного ответа ADCC (низкая плотность Ag, фукозилированный IgG, низкоаффинный фенотип FcγRIIIa-Phe/Phe158, с интактным гликокаликсом) до наиболее сильного ответа ADCC ( высокая плотность Ag, гипофукозилированный IgG, высокоаффинный фенотип FcγRIIIa–Val/Val158, отсутствие гликокаликса клетки-мишени). Мы обнаружили, что величина ответа ADCC сильно зависит от плотности Ag как для фукозилированных, так и для гипофукозилированных антител. Со стороны эффекторных клеток NK-клетки, экспрессирующие полиморфный вариант FcγRIIIa-Val158, вызывают более высокий лизис клеток-мишеней.Интересно, что мы идентифицировали отрицательный заряд гликокаликса клетки-мишени (ζ-потенциал) как важный ограничивающий фактор для способности ADCC. Все эти факторы определяют активность антител и поэтому, вероятно, важны для преобразования их способности in vivo.

Одним из очевидных параметров, который мы изучали, была плотность Ag в клетке-мишени. Наши данные согласуются с предыдущими наблюдениями, в которых плотность Ag на клетке-мишени коррелировала с эффективностью анти-HER2/ neu Ab для запуска надлежащего ответа ADCC на HER2/ neu –положительные опухолевые клетки (41, 42). .Для RhD требовалась более высокая плотность Ag на эритроцитах по сравнению с TNP для достижения столь же сильного ответа ADCC, что указывает на то, что другие факторы, помимо плотности Ag, влияют на активность ADCC, включая подвижность Ag, гибкость, доступность и стехиометрию Ab-Ag и /или сродство к Ab. Мы обнаружили только слабый ответ ADCC с фукозилированным анти-RhD с использованием эритроцитов с естественным, но высоким уровнем экспрессии RhD (R2R2), тогда как ADCC не наблюдалось, когда использовались промежуточные (R1r) и низкоэкспрессирующие (слабый D) клетки-мишени.В предыдущих исследованиях мы не выбирали эритроциты-мишени на основе уровней экспрессии RhD и поэтому, скорее всего, использовали наиболее распространенные фенотипы R1R1 (распространенность: 41,0–43,8%) и R1r (25,5–32,2%) в анализах ADCC, а не менее преобладающий R2R2 (0,7–4,7%), что объясняет, почему мы ранее не наблюдали реакции ADCC на эритроциты с использованием фукозилированного анти-RhD IgG1 (4, 8). Гипофукозилирование анти-TNP, анти-K или анти-RhD IgG1 приводило к потенцированию ответа ADCC в отношении одной и той же клетки-мишени (1, 4, 8), что также наблюдалось в других исследованиях (20) и в этом исследовании для все эритроциты, экспрессирующие Ag, что подчеркивает важность статуса фукозилирования Ab для ADCC.

В этом исследовании потенциал ADCC с фукозилированным анти-RhD IgG1 значительно различался между NK-клетками из FcγRIIIa Val/Val158 /FcγRIIIa Val/Phe158 и FcγRIIIa Phe/Phe158 доноров, что согласуется с донорами2– В 5 раз более высокая аффинность IgG1 к варианту FcγRIIIa–Val158. Это различие согласуется с другими исследованиями, показывающими зависимую от полиморфизма FcγRIIIa-Val/Phe158 кинетику ADCC (43, 44). Однако степень дифференциальной ADCC между фенотипами FcγRIIIa также зависела от гликокаликса и от того, были ли антитела фукозилированы или нет.Это, вероятно, объясняет, почему разница в активности ADCC, опосредованной NK-клетками, между донорами FcγRIIIa Val/Val158 , FcγRIIIa Val/Phe158 или FcγRIIIa Phe/Phe158 была менее выраженной при использовании гипофукозилированных анти-RhD IgG1 (4). Дополнительным аспектом, не изученным в этом исследовании, который может влиять на ADCC, опосредованную NK-клетками, является вариация числа копий гена FCGR3A , которая, как было показано, коррелирует с экспрессией рецептора на поверхности NK-клетки и лизисом клетки-мишени (29, 45).

Для изучения влияния слоя гликопротеина мембраны клетки-мишени на АЗКЦ гликокаликс эритроцитов обрезали бромелаином. В целом, это лечение усиливало реакции ADCC на клетки-мишени RBC. При насыщающей концентрации IgG1, используемой в этих анализах, уровни опсонизации были одинаковыми для обработанных бромелаином и необработанных эритроцитов, что позволяет предположить, что наблюдаемые различия ADCC были результатом удаления самого гликокаликса, а не повышенной доступности Ag. Когда мы специально удалили отрицательно заряженные фрагменты сахара (сиаловую кислоту) из гликокаликса, наблюдалось такое же увеличение ответов ADCC, как и при лечении бромелаином, что указывает на то, что сила отталкивания, возникающая в результате ζ-потенциала, ограничивает ADCC, а не физическую. барьер гликокаликса.Альтернативным объяснением увеличения ADCC при удалении сиаловой кислоты на стороне клетки-мишени может быть распознавание сиаловой кислоты на эритроцитах через рецепторы лектина Ig-типа, связывающие сиаловую кислоту (SIGLEC), на NK-клетках. Рецепторы SIGLEC 7 и 9 являются ингибирующими рецепторами на NK-клетках, которые, как было показано, ограничивают ADCC при распознавании сиаловой кислоты на опухолевых клетках-мишенях (46). Если это так, то также важно понимать, что лиганды, связанные с MHC класса I, становятся более доступными после десиалилирования мишени и вызывают усиленную дегрануляцию NK-клеток посредством активации рецептора, активирующего NK-группу 2D (NKG2D) (47).Интересно, что гликановый состав раковых клеток часто изменяется, включая измененный состав сиаловой кислоты и повышенный уровень в опухолевых клетках, что, по-видимому, коррелирует с тяжестью заболевания (48). Однако обработка клеток-мишеней бромелаином, которая, как и обработка нейраминидазой, увеличивала величину ADCC, не уменьшала кажущееся содержание сиаловой кислоты, выставленной на поверхность эритроцитов (дополнительная рис. 2E), предполагая, что измененное срабатывание SIGLEC и NKG2D не может исключительно объяснить наблюдаемое усиление ответов ADCC.Слабое увеличение связывания агглютинина S. nigra с клетками-мишенями после обработки бромелаином может быть объяснено расщеплением гликопротеинов, потенциально приводящим к одновременному усиленному воздействию обычно скрытых гликолипидов. Необходимы дальнейшие исследования для определения механизмов, лежащих в основе гликокаликс-индуцированных эффектов ADCC.

В дополнение ко всем параметрам как со стороны клеток-мишеней, так и со стороны эффекторных клеток, которые влияют на ADCC, было обнаружено, что присутствие цитофильных антител также влияет на способность ADCC.В соответствии с нашими выводами Patel et al. (49) также совсем недавно наблюдали значительно сниженное фукозилирование ядра в цитофильном IgG, связанном с поверхностью NK-клеток, также предположительно с FcγRIIIa, по сравнению с сывороточным IgG. Однако в наших анализах in vitro цитофильные антитела не влияли на ADCC, поскольку мы использовали инкубированные в течение ночи NK-клетки, которые вызывали диссоциацию цитофильных антител. Плазменное восстановление этих NK-клеток, однако, снижало специфические ответы ADCC с помощью фукозилированного IgG1, чего нельзя было наблюдать для гипофукозилированного IgG1, что указывает на то, что в условиях in vivo цитофильный IgG обладает способностью модулировать ответы ADCC.В зависимости от локализации ADCC-ответа количество цитофильных АТ, вероятно, будет разным, что может в определенной степени определять конкуренцию за FcγRIIIa и потенциальный блокирующий эффект.

В этом исследовании мы оценили все параметры, влияющие на способность NK-клеток индуцировать лизис клеток-мишеней. Эти параметры, вероятно, также участвуют в других функциях, зависящих от NK-клеток, таких как Ab-зависимая активация NK-клеток, и поэтому было бы интересно включить количественную оценку секреции IFN-γ и хемокинового мотива C-C лиганда 4 (CCL4). и экспрессия маркера дегрануляции CD107a в будущих исследованиях (50).

Мы пришли к выводу, что плотность Ag, полиморфизм FcγRIIIa и гликокаликс клетки-мишени являются важными и независимыми ограничивающими факторами, влияющими на ADCC эритроцитов NK-клетками, которые можно частично преодолеть с помощью гипофукозилированного IgG.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим всех добровольцев, сдавших кровь для исследовательских целей.

Сноски

  • Эта работа была поддержана Генмабом и Фондом исследования переливания крови Ландштейнера, грант 1527.

  • Электронная версия этой статьи содержит дополнительные материалы.

  • Сокращения, используемые в этой статье:

    ADCC
    Ab-зависимой клеточной цитотоксичности
    gMFI
    геометрическое среднее интенсивность флуоресценции
    ГПА
    гликофорина А
    резус
    Резус D
    сиглек
    сиаловой кислотосвязывающий лектин Ig-типа
    TNP
    2,4,6-тринитрофенол.
  • Получен 14 августа 2019 г.
  • принят 4 октября 2019 г.
  • Copyright © 2019 Американская ассоциация иммунологов, INC.

Protocol 3 -Lentivirirrus Transduction на целевую линию

7

.

Следующий протокол основан на протоколе Addgene, который можно найти по адресу: http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/#E

.

Лентивирусные частицы могут эффективно инфицировать широкий спектр типов клеток, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки.Добавление пуромицина позволит вам выбрать клетки, которые стабильно экспрессируют интересующую вас кшРНК.

Материалы

  • Гексадиметрина бромид (полибрен)* Sigma-Aldrich: #H9268
  • Протамина сульфат* MP Biomedicals: #194729
  • Пуромицин* Sigma-Aldrich: #P8833
  • Целевые клетки (зависит от вашего эксперимента)
  • Питательная среда для клеток-мишеней (зависит от вашего эксперимента)
  • Материалы для анализа (зависит от вашего эксперимента)

Подробные протоколы получения полибрена, протамина сульфата и пуромицина приведены в приложении.

Определение оптимальной концентрации пуромицина

Каждая клеточная линия по-разному реагирует на отбор пуромицином. Addgene настоятельно рекомендует определить оптимальную концентрацию пуромицина для вашей клеточной линии перед началом эксперимента.

День 1:

  • Посеять клетки-мишени в десять чашек диаметром 6 см и выращивать при 37°C, 5% CO 2 в течение ночи.

День 2:

  • Клетки-мишени должны быть примерно на 80-90% конфлюэнтны.
  • Разбавьте пуромицин предпочитаемой культуральной средой для клеток-мишеней. Конечная концентрация пуромицина должна составлять от 1 до 10 мкг/мл с шагом 1 мкг/мл.
  • Промаркируйте планшеты с 1 по 10 и добавьте к клеткам соответствующую среду, содержащую пуромицин

Дней 3+:

  • Ежедневно осматривайте клетки и меняйте их на свежую среду, содержащую пуромицин, через день.
  • Минимальная концентрация пуромицина, приводящая к полной гибели клеток через три-пять дней, является концентрацией, которую следует использовать для селекции в ваших экспериментах.Вы можете повторить это титрование с меньшими приращениями пуромицина, чтобы определить более точную оптимальную концентрацию пуромицина.

Протокол лентивирусной инфекции и селекции

День 1:

  • Клетки-мишени на планшете и инкубируйте при 37°C, 5% CO 2 в течение ночи.

День 2:

  • Клетки-мишени должны быть примерно на 70% слиты. Переход на свежие питательные среды, содержащие 8 мкг/мл полибрена.Полибрен повышает эффективность вирусной инфекции. Однако полибрен токсичен для некоторых клеточных линий. В этих клеточных линиях замените полибрен сульфатом протамина.
  • Добавьте раствор лентивирусных частиц из шага E. Для планшета-мишени 6 см добавьте от 0,05 до 1 мл вируса (добавьте ≥0,5 мл для высокого MOI и ≤0,1 мл для низкого MOI). Масштабируйте количество добавляемого вируса в зависимости от размера вашей целевой пластины. MOI (множественность заражения) относится к количеству заражающих вирусных частиц на клетку.Addgene рекомендует вам протестировать ряд MOI, чтобы определить оптимальную MOI для инфекции и подавления генов в линии клеток-мишеней.
  • Инкубируйте клетки при 37°C, 5% CO 2 в течение ночи.

День 3:

  • Переход на свежую среду через 24 часа после заражения. Если в вашей клеточной линии наблюдается вирусная токсичность, вы можете сократить время заражения до 4–20 часов. Удалите носитель с вирусом и замените новым.Не добавляйте пуромицин, по крайней мере, через 24 часа после заражения, чтобы обеспечить достаточную экспрессию гена устойчивости к пуромицину.
  • Для отбора инфицированных клеток добавьте пуромицин в среду в концентрации, определенной на этапах, описанных выше. Addgene рекомендует параллельно поддерживать одну неинфицированную пластину с клетками. Этот планшет будет служить положительным контролем для выбора пуромицина.

Дней 4+:

  • Меняйте среду на свежую, содержащую пуромицин, по мере необходимости каждые несколько дней.
    Анализ зараженных клеток. Следующие рекомендации являются рекомендациями по количеству дней, в течение которых вы должны ждать до сбора ваших клеток. Тем не менее, вы должны оптимизировать время на основе вашей клеточной линии и анализа.

Опубликованные статьи

Хворова А эт. др. 2003. Функциональные siRNAs и miRNAs обнаруживают смещение нитей. Ячейка 115: 209-216. (ПубМед)

Моффат Дж и др. др. 2006. Библиотека лентивирусной РНК-интерференции для генов человека и мыши, примененная к массивному скринингу вирусов с высоким содержанием.Ячейка 124: 1283-1298. (ПубМед)

Налдини Л. эт. др. 1996. Доставка генов in vivo и стабильная трансдукция неделящихся клеток лентивирусным вектором. Наука 272:263-267. (ПубМед)

Шварц ДС и др. др. 2003. Асимметрия сборки ферментного комплекса РНКи. Сотовый 115: 199-208. (PubMed)

Стюарт С.А. и др. др. 2003. Лентивирус доставляет стабильное молчание генов с помощью РНКи в первичных клетках. РНК 9(4):493-501. (ПубМед)

Zufferey R et. др. 1997. Множественно ослабленный лентивирусный вектор обеспечивает эффективную доставку генов in vivo.Nat Biotechnol 15(9):871-5. (ПубМед)

Zufferey R et. др. 1998. Самоинактивирующийся лентивирусный вектор для безопасной и эффективной доставки генов in vivo. Дж. Вирол 72(12):9873-80. (PubMed)

Самый быстрый словарь в мире | Vocabulary.com

  • клетка-мишень любая клетка, имеющая специфический рецептор антигена, антитела, гормона или лекарственного средства, или являющаяся очагом контакта вируса, фагоцита, нервного волокна и т. д.

  • легкоуправляемый

  • target area расположение цели, которая должна быть поражена

  • цель ориентир для стрельбы

  • орган-мишень (радиология) орган, предназначенный для получения терапевтической дозы радиоактивного вещества

  • лук-порей трехгранный лук-порей европейский, натурализованный в Великобритании

  • мишень тренировочная мишень

  • аккумуляторная батарея перезаряжаемая батарея

  • CD4-клетка Т-клетка с рецептором CD4, которая распознает антигены на поверхности инфицированной вирусом клетки и секретирует лимфокины, стимулирующие В-клетки и Т-клетки-киллеры; Т-хелперы инфицированы и убиты вирусом СПИДа

  • CD8-клетка Т-клетка с рецептором CD8, которая распознает антигены на поверхности инфицированной вирусом клетки, связывается с инфицированной клеткой и уничтожает ее

  • прямая почтовая реклама, рассылаемая непосредственно потенциальным клиентам по почте

  • прямота верность курса на цель

  • трехгранная кость запястья, которая сочленяется с гороховидной, крючковидной и полулунной костями

  • забываемый легко забываемый

  • забывчивый (памяти) с недостаточным запоминанием или диапазоном

  • Торквато Тассо Итальянский поэт, написавший эпическую поэму о взятии Иерусалима во время Первого крестового похода (1544-1595)

  • Тритон Taricha torosa, похожий на Taricha granulosa по характеристикам и среде обитания

  • по забывчивости по забывчивости

  • сухая ячейка небольшая ячейка Лекланша, не содержащая свободной жидкости

  • Торричелли Итальянский физик, изобретатель ртутного барометра

  • Обнаружение связывания лекарственного средства с мишенью в клетках с использованием флуоресцентной сортировки клеток в сочетании с масс-спектрометрическим анализом

    Эффективность лекарственного средства зависит от взаимодействия с соответствующим терапевтическим белком-мишенью в физиологическом месте активности.Прямое обнаружение этого взаимодействия in vitro остается сложной задачей, особенно если невозможно получить изолированный белок или если невозможно разработать подходящий метод анализа. Измерение связывания хита, отведения или лекарства с намеченной мишенью особенно сложно в клетках. Таким образом, обнаружение вовлечения мишени является одной из основных проблем при проверке попадания с помощью фенотипических анализов [1–3]. Сообщалось о нескольких методах обнаружения взаимодействия с наркотиками. Недавно был описан ряд творческих методов, в которых используются функционализированные препараты или зонды с флуоресцентно-поляризованной визуализацией [4-7].Другие используют хемопротеомные методы для профилирования спектра белков, взаимодействующих с химическими зондами [8]. Такие методы требуют специализированных/адаптированных инструментов и/или мощностей для производства зондов с флуоресцентной меткой. Текущим стандартом для демонстрации вовлечения внутриклеточных мишеней является анализ клеточного теплового сдвига (CETSA), который обнаруживает лиганд-индуцированную термостабилизацию белков-мишеней [9-11]. Однако авторы заявляют, что метод «вряд ли будет работать для сильно негомогенных белков».В общем, сложные лекарственные мишени, которые плохо экспрессируются в растворимой форме, нестабильны в растворе или ведут себя по-разному в отсутствие ключевых кофакторов или партнеров по связыванию белков, вызывают трудности. Мы разработали метод TAPS, чтобы найти решение для этого пробела в измерении вовлечения мишеней и расширить набор подходов для растворимых белковых мишеней. TAPS сочетает в себе флуоресцентно-активированную клеточную сортировку (FACS) с анализом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) для обнаружения связывания лекарств с их мишенью внутри клеток в зависимости от концентрации, что дает результаты, которые напоминают кажущуюся кривую связывания небольшой молекулы. к цели в любом сотовом контексте.Кроме того, TAPS выбирает в одном методе анализа соединения с достаточной клеточной проницаемостью и исключает с помощью необходимых контролей соединения, которые не обладают специфичностью или демонстрируют высокую цитотоксичность. Этот метод обычно применим для любой внутриклеточной мишени, которая может быть выражена как флуоресцентный слитый белок, и здесь продемонстрирована его применимость к сложным мембранным белкам.

    Техника TAPS включает кратковременную экспрессию интересующего гена в виде конъюгата флуоресцентного белка в подходящем типе клеток для создания диапазона целевых концентраций.Таким образом, флуоресцентно меченные белки-мишени анализируются в клеточной среде в присутствии эндогенных кофакторов и белок-белковых интеракторов в физиологически значимой ткани. Белок вырабатывается в течение 24 часов, и трансфицированные клетки инкубируют с отдельными или объединенными соединениями. Клетки подвергают FACS-анализу и сортируют в соответствии с интенсивностью флуоресценции, проявляемой флуоресцентным слитым белком. За лизисом отсортированных популяций следует анализ ЖХ-МС/МС, что позволяет сравнить соединения, связанные в нетрансфицированных клетках, свободных от мишеней, и соединения, связанные в интенсивно флуоресцентных клетках, экспрессирующих различные уровни целевого белка.Отрицательные клетки, полученные в результате временной экспрессии в этих экспериментах, действуют как важный интегральный контроль, позволяющий определить специфичность связывания лекарственного средства. В случаях, когда невозможно кратковременно экспрессировать интересующий белок-мишень, стабильно трансфицированные клеточные линии можно использовать параллельно с нативной нетрансфицированной клеточной линией для проведения анализа TAPS.

    Анализ TAPS был разработан с использованием связанного с митохондриальной мембраной фермента кинуренин-3-монооксигеназы (КМО).Этот фермент становится все более важной мишенью для разработки лекарств, так как недавно он был задействован в качестве терапевтической мишени для болезни Гентингтона [12] и полиорганной недостаточности, вызванной тяжелым острым панкреатитом [13]. Однако КМО человека трудно получить и выделить в рекомбинантной форме, поскольку он связан с мембраной и требует присутствия липидной и белковой среды для поддержания активности. Считается, что гидрофобный домен, нацеленный на мембрану, на С-конце этой НАДФН-зависимой флавопротеингидроксилазы отвечает за ее низкую растворимость в воде, плохую стабильность и склонность к агрегации с другими мембранными белками при рекомбинантной экспрессии [14-16].Таким образом, важность анализа взаимодействия лекарственного средства с КМО непосредственно в клетках млекопитающих в присутствии кофакторов и внутриклеточных связывающих белков, необходимых для функциональности фермента, имеет первостепенное значение. Разработка и успешное применение метода TAPS для анализа соединений против КМО внутри клеток убедительно свидетельствует о том, что этот метод применим для нацеливания на другие сложные белки.

    Клонирование

    Ген КМО человека E2-Crimson (вариант Cys452) был синтезирован с помощью GenScript в векторе pUC57.Последовательность ДНК для E2-малинового цвета была получена от Clontech. Ген слияния флуоресценции и КМО лигировали в вектор pCDNA3.1 (Invitrogen) с использованием сайтов рестрикции NheI (N-конец) и NotI (С-конец).

    Транзиторная экспрессия флуоресцентного белка-мишени

    Клетки HEK293 пассировали в планшетах, обработанных поли- D -лизином, и инкубировали в течение ночи в среде OPTI-MEM (Lonza) при 37 °C, 5% CO 2 . На следующий день клетки временно трансфицировали pcDNA3.ДНК 1-E2-Crimson-huKMO с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в среде OPTI-MEM по стандартному протоколу трансфекции. Среду для трансфекции удаляли из клеток через 6 ч после трансфекции и заменяли средой DMEM, содержащей 10% FBS, 1% L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (Life Technologies). Трансфецированные клетки выдерживали при 37 °C, 5% CO 2 в течение 24–48 ч после трансфекции перед проведением анализа TAPS. Трансфекцию клеток и последующий анализ проводили в различных форматах планшетов (6-, 12-, 24- и 48-луночных) во время разработки анализа, скрининг соединений выполняли в формате 6-луночных планшетов.

    Анализ TAPS

    Стадия 1: Инкубация соединения

    Соединения разводили до концентрации 20 мкМ М (ДМСО <1%) в среде для тканевых культур (DMEM с 10% FBS, 1% L-глутамина, 1% пенициллин-стрептомицин), затем инкубировали с трансфицированными клетками в течение четырех часов при 37°C, 5% CO 2 . 20 мкМ Концентрация соединения была выбрана как подходящая концентрация для разработки анализа и скрининга. После инкубации клетки осторожно отделяли от планшета пипеткой и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин.Культуральную среду удаляли пипетированием, а клеточный осадок повторно суспендировали в буфере FACS (PBS + 2% FBS) для смывания несвязавшегося соединения. Клетки центрифугировали, как описано выше, и удаляли промывочный буфер. Затем клетки ресуспендировали в буфере FACS и переносили в 5 мл пробирки FACS. Пробирки заворачивали в фольгу и помещали на лед до сортировки.

    Этап 2: сортировка FACS

    Клетки сортировали с использованием системы BD FACS Aria II, оснащенной соплом 100 µ м. Данные были получены и обработаны с использованием программного обеспечения BD FACSDiva версии 6.1.3. Флуоресценцию клеток детектировали с использованием канала APC с использованием лазера 640 нм мощностью 40 мВт для возбуждения E2-Crimson. Используемый фильтр был 670/14 нм, обнаруживая флуоресцентное излучение E2-Crimson в диапазоне 663–677 нм. Клетки сортировали и собирали в четыре клеточные популяции, определяемые по интенсивности флуоресценции, использовали стробирование прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для исключения мертвых клеток, и собирали только живые клетки. Клетки собирали в 5 мл пробирки FACS, содержащие 1 мл DMEM с 10% FBS, 1% L -глютамином и 1% пенициллином-стрептомицином.Каждую популяцию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Среду удаляли и клеточный осадок повторно суспендировали в 20 мМ HEPES, pH 7,0. Суспензию кратковременно обрабатывали ультразвуком для лизиса клеток перед центрифугированием, как и ранее, для осаждения клеточного дебриса. Лизат (супернатант) переносили во флаконы для ЖХ-МС и хранили при температуре -20 °C до проведения МС-анализа.

    Этап 3: Масс-спектрометрическое определение соединений в клеточных лизатах
    Аппаратура

    Этот метод был описан нами ранее [17].В качестве хроматографической системы использовалась система TurboFlow TM TLX Aria-1 (Thermo Fisher Scientific, Хемел-Хемпстед, Великобритания), состоящая из двух насосов Allegros, определяемых как загрузочный и элюирующий насосы, двух модулей переключения клапанов и автодозатора жидкости CTC. Детекцию проводили с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра TSQ Quantum Discovery (Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, UK).

    Оптимизация параметров хроматографии и масс-спектрометрии

    Образцы подвергались онлайн-экстракции с использованием системы TurboFlow TM TLX Aria-1, работающей в режиме фокусировки.10 мкл мкл инъекции клеточного лизата загружали непосредственно в колонку C18PXL (50  ×  0,5 мм, ThermoFisher Scientific, Hemel Hempstead, UK) TurboFlow TM с высокой скоростью потока, вызывая перетекание белкового материала в напрасно тратить. Ряд переключателей клапанов привел к элюированию извлеченного образца из колонки TurboFlow TM непосредственно на аналитическую колонку. Растворитель А представлял собой воду с 0,1% муравьиной кислоты, растворитель В представлял собой метанол с 0,1% муравьиной кислоты и растворитель С представлял собой ацетонитрил:изопропанол:ацетон, 45:45:10.

    После экстракции TurboFlow TM аналиты впоследствии разделяли на обращенно-фазовой аналитической колонке T3 Atlantis (2,1 × 150 мм, 3 мкм м, Waters, Manchester, UK), защищенной Kinetex KrudKatcher® ( Phenomenex, Маклсфилд, Великобритания). Аналитическую колонку поддерживали при 5°C с помощью охладителя колонки.

    Онлайн-система TurboFlow Aria-1 была напрямую подключена к тройному квадрупольному масс-спектрометру Quantum Discovery, работающему в режиме электрораспыления ионов с переключением полярности для мониторинга положительных и отрицательных ионов.Температура источника составляла 300°C, напряжение распыления 3 кВ и смещение скиммера 12 В. Аргон, газ столкновения в Q2, имел давление 1,5 мТорр. Автоматические настройки настройки использовались для достижения максимального ионного сигнала для каждого аналита для начальных проверочных экспериментов, оптимизируя напряжение линзы тубуса, переходы исходного вещества в продукт и энергию столкновения для каждого перехода. Для каждого аналита определяли квантификатор и квалификатор. Мониторинг ионов-квантификаторов и квалификаторов добавляет анализу дополнительную специфичность.Приемлемый количественный показатель: отношения площадей пиков квалификатора в биологических образцах считались такими, которые находились в пределах 20% от среднего отношения, наблюдаемого в стандартах. Применяя настройки настройки, можно создать площадь пика для каждого соединения. Для объединенного скрининга соединений настройки настройки не использовались. Образцы подвергали полному МС-сканированию с диапазоном определения молекулярной массы, установленным на уровне 250–465 (дальтон). Пики, обнаруженные при этом начальном сканировании, затем идентифицировали по молекулярной массе и сравнивали с их отношением массы к заряду.

    Ширина сканирования м / z 0,5, время сканирования 0,1 с и единичное разрешение на Q1 и Q3. Данные были собраны как данные центроида, чтобы минимизировать размеры файлов. Данные были получены и обработаны с использованием программных пакетов Aria 1.3, Xcalibur 1.4 и LC Quan 2.0 SP1.

    Соединения

    Три известных ингибитора КМО из патентной и научной литературы [18, 19] и несвязывающее соединение из основной библиотеки соединений Университета Эдинбурга были использованы для разработки и проверки анализа (рис. 1).100 соединений, выбранных из основной библиотеки соединений Эдинбургского университета по открытию лекарственных средств, были объединены с соединениями 1, 2 и 3 (рис. 1) и одновременно проанализированы в виде смеси для демонстрации скрининга нескольких соединений. Библиотека для скрининга состояла из разнообразного набора соединений, включая соединения, неактивные в отношении КМО, и три хорошо охарактеризованных ингибитора КМО, проницаемых для клеток. К неактивным соединениям относились те, о которых известно, что они проникают через клетки в другие мишени. Набор соединений содержал различные химические вещества с диапазоном молекулярной массы (169–445 Да) и липофильности (LogP 0.94–6.1).

    Приблизить Уменьшить Сбросить размер изображения

    Рисунок 1.  Структура и активность соединений, используемых для проверки клеточного метода TAPS. Цифры CAS и активность крысиного фермента КМО, о которой сообщается в литературе, показаны для Cpds 1–4 вместе со значениями IC 50 , полученными нами ранее в анализе активности КМО в отношении фермента человека [17].

    Скачать рисунок:

    Стандартное изображение Изображение с высоким разрешением

    Анализ активности КМО

    Все соединения, проанализированные в «пуле» соединений, оценивали на активность против КМО человека в анализе активности КМО.Источником белка КМО для этого анализа был лизат, полученный с использованием следующей стабильной клеточной линии. Клетки

    HEK293 (Flp-In-293, которые экспрессируют lacZ-зеоцин, Life Technologies) стабильно котрансфицировали 9 мкг мкг ДНК pcDNA5/FRT/V5/HisTOPO и 18 мкг мкг плазмиды pog44. Pog44 экспрессирует белок рекомбиназы Flp, совместная трансфекция pog44 с интересующим геном обеспечивает целенаправленную интеграцию в геном клетки млекопитающего в пределах транскрипционно активной области. Трансфекцию проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies) в среде OPTI-MEM (Lonza).Клетки отбирали в течение двух недель с использованием гигромицина В (Sigma Aldrich) в количестве 100 мк г/мл -1 для отбора гена устойчивости к гигромицину, содержащегося в векторе pcDNA5, перед выделением и культивированием положительных колоний.

    Лизат клеток HEK-huKMO анализировали на ферментативную активность KMO путем измерения количества KYN, преобразованного в 3HK, обнаруженного с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) после инкубации с соединениями, проверенными в анализе TAPS, с использованием метода, который мы описано ранее [17].В этом анализе соединения тестировали в формате одно соединение на лунку. Вкратце, лизат, содержащий 200 мкл г общего белка, инкубировали с 4 мМ MgCl 2 , 1 мМ НАДФН и 200 мк М L-кинуренина в 20 мМ HEPES, рН 7,0, в течение двух часов при 37 °C при осторожном встряхивании. при 250 об/мин в общем объеме анализа 100 мкл л. Образцы добавляли к 500 мкл л ацетонитрила (содержащему 25 мкл г мл -1 внутреннего стандарта, d5-TRP) для прекращения активности с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин для осаждения осадка.Надосадочную фракцию сушили в атмосфере азота, а остаток повторно суспендировали в смеси 30:70 метанол:вода с 0,1% муравьиной кислотой для анализа ЖХ-МС/МС.

    Анализ ЖХ-МС проводили с использованием тройного квадрупольного масс-спектрометра TSQ Quantum Discovery (Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, UK) с использованием колонки с плавлеными порами пентафторфенила (PFP) (Waters) при 40 °C. Объем впрыска составлял 10 мкл л, а скорость потока составляла 500 мкл л мин -1 . Время выполнения метода составляло 4 минуты, а в качестве внутреннего стандарта использовали триптофан d5.Пики квалификатора и квантификатора были идентифицированы для 3HK и для триптофана d5. Данные были получены и обработаны с использованием программных пакетов Xcalibur 1.4 и LC Quan 2.0 SP1.

    Окрашивание клеток

    Клетки HEK293 временно трансфицировали и сортировали с помощью FACS, как описано выше. Образцы клеток из каждой отсортированной популяции помещали в прозрачные 96-луночные планшеты (Whatman) и инкубировали в течение ночи при 37 °C, 5% CO 2 . На следующий день из клеток отсасывали среду, и клетки осторожно промывали PBS + (PBS, содержащий 1 мМ Ca 2+ и 0.5 мМ MgCl 2 ). Конъюгат агглютинин зародышей пшеницы-AlexaFluor488 использовали в концентрации 5 мкг г/мл -1 для окрашивания клеточных мембран путем инкубации в течение 10 мин при 37°С. Пятно удаляли и клетки дважды промывали PBS +. Затем клетки фиксировали 10-минутной инкубацией в 3,7% формальдегиде, разбавленном в PBS + . После удаления фиксатора клетки трижды тщательно промывали путем 5-минутной инкубации в PBS + . Для повышения проницаемости клеток 0.Добавляли 1% Triton-X 100 в PBS на 5 мин при комнатной температуре. Клетки промывали еще три раза перед инкубацией с 300 нМ DAPI в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре в темноте для обеспечения окрашивания ядер. В заключение клетки трижды промывали в PBS. Клетки визуализировали с использованием системы скрининга Opera TM High Content. Флуоресценцию E2-Crimson-huKMO определяли с помощью лазера 640 нм (2000 мк Вт, 280 мс), окрашивание ядер (DAPI) определяли с помощью источника УФ-излучения (возбуждение 365 нм, эмиссионный фильтр 450/50, 40 мс) и лазер 488 нм (1250 мкм Вт, 40 мс) использовали для обнаружения окрашивания клеточной мембраны (конъюгат агглютинин зародышей пшеницы-Alexa488).

    Выбор и валидация ингибиторов КМО

    Три известных ингибитора КМО с наномолярным и микромолярным сродством [18, 19] и одно структурно родственное отрицательное контрольное соединение (рис. 1) были выбраны для разработки и валидации анализа TAPS. Активность этих ингибиторов была подтверждена нами ранее в отношении КМО человека [17] в анализе ферментативной активности, описанном в разделе методов, и полученные значения IC 50 находились в том же диапазоне, что и литературные значения для фермента КМО крысы для соединений 1. –3 (рис. 1).Было подтверждено, что соединение 4 неактивно в анализе активности (фиг. 1).

    Клеточная флуоресценция E2-малинового цвета коррелирует с активностью КМО

    КМО обнаруживали в клеточном матриксе в виде дальнекрасного флуоресцентного конъюгата путем слияния с E2-малиновым [20]. Широкий диапазон интенсивностей клеточной флуоресценции, возникающий в результате временной экспрессии флуоресцентной KMO, был обнаружен и отсортирован с помощью FACS для создания клеточных популяций для МС-анализа. Конфокальная визуализация клеток из отсортированных популяций использовалась в качестве параллельного метода для подтверждения экспрессии КМО (рис. 2(а), (б)).Популяции отсортированных клеток при лизисе и анализе на ферментативную активность КМО показали хорошую корреляцию между повышенной интенсивностью флуоресценции и активностью фермента КМО (рис. 2(с)). Следовательно, клеточная флуоресценция E2-Crimson надежно указывала на экспрессию и функциональность KMO.

    Приблизить Уменьшить Сбросить размер изображения

    Рисунок 2.  Экспрессия функционального hKMO и скрининг соединений в анализе TAPS.( а ) Временная трансфекция клеток HEK293 с помощью E2-Crimson-huKMO создает популяции трансфицированных клеток различной степени, гистограмма показывает распределение интенсивности флуоресценции в трансфицированных клетках и гейты популяции, применяемые для сортировки клеток, ( b ) изображения окрашивания клеток, полученные с использованием система Opera TM High Content Screening показывает переменную экспрессию E2-Crimson в каждой отсортированной популяции (показаны красным). Флуоресценцию E2-Crimson-huKMO детектировали с использованием лазерного возбуждения 640 нм (2000 мк Вт, 280 мс), окрашивание DAPI (показано синим цветом) определяли с использованием источника УФ-излучения (возбуждение 365 нм, эмиссионный фильтр 450/50, 40 мс). мс) и лазер 488 нм (1250 мк Вт, 40 мс) использовали для эксциации пятна клеточной мембраны (показан зеленым, конъюгат агглютинин зародышей пшеницы-Alexa488).( c ) 3-HK, продуцируемый на клетку в лизате каждой отсортированной клеточной популяции после инкубации с 200 мк М кинуренинового субстрата в течение 2 ч, коррелирует с интенсивностью флуоресценции в клетке. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов.

    Скачать рисунок:

    Стандартное изображение Изображение с высоким разрешением

    Внутриклеточное связывание ингибиторов KMO-мишеней обнаружено в анализе TAPS

    Обнаружение ингибиторов KMO (Cpds 1–3) в лизатах клеточной популяции в анализе TAPS сильно и в зависимости от концентрации коррелирует с уровнями экспрессии мишени, что указывает на аффинность специфического ингибитора к КМО (рис. 3(а)).Детектирование с помощью МС неактивного соединения 4 продемонстрировало очень низкий и примерно одинаковый сигнал во всех лизатах клеточной популяции, что указывает на незначительное специфическое сродство к КМО или на его отсутствие (рис. 3(а)). Кроме того, обнаружение соединений ЖХ-МС/МС во флуоресцентных KMO-положительных образцах отражало половину максимальных ингибирующих концентраций, полученных в анализе активности KMO (рис. 3(b)). Это говорит о том, что соединения демонстрируют внутриклеточное сродство к KMO, а не к его партнеру по слиянию E2-Crimson. Эти результаты показывают, что протокол анализа TAPS можно использовать для идентификации проницаемых для клеток соединений со специфической аффинностью связывания с КМО.

    Приблизить Уменьшить Сбросить размер изображения

    Рисунок 3.  (a) Количество соединения, обнаруженное с помощью МС для известных ингибиторов КМО (соединения 1–3), представленное здесь как общая площадь пика, обнаруженная в отсортированном образце клеток, деленная на количество клеток в популяции. чтобы дать площадь пика соединения на клетку, увеличивается с экспрессией флуоресцентного целевого белка, обнаруженного с помощью FACS. Количества проверенных соединений 1–4, обнаруженные с помощью МС в анализе TAPS, также коррелируют с ингибирующей активностью каждого соединения.Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. (b) График, показывающий корреляцию между ингибирующей активностью, определенной в анализе активности КМО, и количеством соединения, обнаруженным в клетках в популяции «высокой» флуоресценции/КМО в анализе TAPS для соединений в объединенном скрининге. Каждый • представляет одно соединение на экране. Cpds 1–3 обозначены их значениями IC 50 . Данные являются репрезентативными для одного независимого эксперимента.

    Скачать рисунок:

    Стандартное изображение Изображение с высоким разрешением

    Внутриклеточные соединения, связывающиеся с мишенями, могут быть обнаружены в объединенной смеси соединений

    Для проверки потенциала мультиплексирования метода было проанализировано 103 соединения в конечной концентрации 20 мкМ М каждое, включая проверенные соединения 1, 2 и 3. одновременно в одной клеточной инкубационной смеси.Соединения 1, 2 и 3 были единственными соединениями, которые были обнаружены исключительно в положительном образце с высокой флуоресценцией-KMO, что указывает на то, что анализ TAPS можно применять для тестирования коллекций соединений среднего размера (рис. 3(b)). Этот скрининг также идентифицировал соединения с одинаковым обнаружением во всех образцах, что указывает на неспецифическое связывание или высокую клеточную проницаемость. Эти результаты были подтверждены тестированием соединений в анализе активности КМО (рис. 3(b)). Было показано, что специфичность связывания коррелирует с ингибирующей активностью в анализе активности, подтверждая надежную идентификацию попадающих и ложноположительных соединений в анализе TAPS.

    Мониторинг взаимодействия мишени с лекарством внутри клеток представляет собой проблему на начальном этапе процесса открытия лекарств. Molina et al. [9] описали CETSA, который направлен на внутриклеточное взаимодействие лекарственного средства с мишенью, но также подтвердили, что этот метод не подходит для негомогенных белков или белков, которые не агрегируют при разворачивании лиганд-связывающего домена. Таким образом, существует потребность в способах, применимых к сложным белкам-мишеням, и в одновременном тестировании больших наборов тестируемых соединений для оценки связывания лекарственного средства с белком внутри клеток.Анализ TAPS сравнивает обнаружение соединения в клетках, демонстрирующих переменную экспрессию целевого белка. Используя известные ингибиторы выбранного нами целевого фермента, было показано, что специфическое сродство этих соединений к мишени может быть указано путем сравнения накопления соединения в клетках со сверхэкспрессированными уровнями целевого белка по сравнению с неспецифическим накоплением в нормальных клетках. Соединения с эквивалентным накоплением в сверхэкспрессирующих клетках по сравнению с нетрансфицированными клетками идентифицируются как неспецифические связывающие вещества и исключаются.Поскольку только проницаемые для клеток специфические связывающие вещества сравнительно обогащены сверхэкспрессирующими клетками, относительная аффинность связывания соединения и клеточная проницаемость могут быть выявлены одновременно с помощью МС-анализа. Основные контрольные эксперименты включают тестирование представляющего интерес соединения (соединений) в инкубации с вариабельно и временно трансфицированными клетками, клетками, трансфицированными только флуоресцентным белком, и, при необходимости, с соответствующими мутантами-мишенями и родственными белками. Если временная экспрессия целевого белка не может быть достигнута, аналогичный анализ может быть проведен с использованием стабильно трансфицированных клеток по сравнению с нетрансфицированными клетками.Предупреждением для любой итерации анализа является требование экспрессии флуоресцентно-меченого белка-мишени. Кроме того, формат микропланшета, применяемый для анализа конкретной мишени, то есть пропускная способность, которая может быть достигнута, зависит от уровня экспрессии белка, поскольку количество обнаруживаемого связанного соединения коррелирует с количеством присутствующего белка. При выборе клеток для анализа TAPS следует учитывать эндогенную экспрессию целевого белка.

    Мы выбрали KMO, сложный, но все более важный фермент-мишень, для разработки этого анализа.Белковые мишени, такие как КМО, которые требуют комплексообразования с клеточными интерактомными белками или химическими кофакторами, создают трудности для биохимического приготовления и тестирования in vitro . Чтобы преодолеть эти специфические проблемы, мы пропустили этапы очистки ферментов и проанализировали ферменты-мишени непосредственно в клетках млекопитающих в присутствии кофакторов и внутриклеточных связывающих белков, необходимых для функциональности фермента. Клетки HEK293 отбирали для анализа КМО в анализе TAPS. В то время как КМО экспрессируется клетками почек, клетки НЕК293 не проявляют заметной активности КМО [20].Таким образом, клетки HEK293 обеспечивают физиологически релевантную матрицу для анализа, но маловероятно, что на результат анализа повлияет эндогенный KMO. В более общем плане для всех мишеней, если эндогенная экспрессия мишени обильна в используемом типе клеток, мы признаем, что это может привести к искажению результатов. В этих обстоятельствах можно было бы выбрать другой тип клеток, в этом может не быть необходимости, учитывая, что важной мерой связывания соединения с мишенью является относительное обогащение соединением клеток, экспрессирующих флуоресцентную мишень, по сравнению с нефлуоресцентными.Следовательно, пока неизвестные соединения тестируются в избытке, как это сделали мы, связывание должно быть очевидным. Успешное применение этого метода к мембранным белкам указывает на пригодность для анализа других сложных мишеней, таких как полноразмерные партнеры по межбелковому взаимодействию или белки, которые стабильны только в присутствии нуклеиновых кислот или липидов.

    КМО обнаруживали в клеточном матриксе после слияния с E2-Crimson [21]. Эксперименты с FACS и конфокальной визуализацией подтвердили, что клеточная флуоресценция E2-Crimson надежно указывает на экспрессию и функциональность KMO.Временная трансфекция клеток неизбежно приводила к вариабельной экспрессии флуоресцентного белка-мишени, что позволяло извлекать отрицательный контрольный образец и КМО-положительный образец из одной и той же клеточной инкубации с лекарственным средством. Этот этап анализа облегчает различение соединений, демонстрирующих неспецифическое связывание клеточного компонента во всех клетках, от соединений, демонстрирующих аффинность специфического связывания в клетках, экспрессирующих более высокие концентрации белка-мишени. Обнаружение известных ингибиторов КМО в анализе TAPS в зависимости от концентрации коррелировало с уровнями экспрессии-мишени, что указывает на специфическое сродство к КМО.Известное неактивное соединение демонстрировало неизменный сигнал независимо от экспрессии мишени, указывая на небольшую специфическую аффинность или отсутствие специфической аффинности к KMO, а также на отсутствие неспецифического или случайного связывания клеточных белков. Обнаружение этих соединений в анализе TAPS отражало половину максимальных ингибирующих концентраций, полученных с использованием анализа активности KMO. Различия в кажущихся кривых внутриклеточного связывания, особенно для двух соединений с одинаковыми IC 50 , скорее всего, связаны с клеточным поглощением, событиями неспецифического связывания или специфичной для соединения ионизацией во время считывания МС.

    В качестве следующего шага в разработке анализа TAPS мы проверили возможности мультиплексирования метода. В одной клеточной инкубационной смеси одновременно анализировали 103 соединения. Обнаружение трех известных ингибиторов КМО в положительном образце с высокой флуоресценцией КМО свидетельствует о пригодности TAPS для тестирования коллекций соединений среднего размера. Скрининг отличал соединения, демонстрирующие неспецифическое связывание или высокую клеточную проницаемость, от известных соединений, связывающихся с КМО, с результатами, успешно подтвержденными в анализе активности КМО.Сравнивая результаты каждого метода, мы смогли подтвердить надежную идентификацию попадающих и ложноположительных соединений в анализе TAPS.

    Метод TAPS представляет собой многопараметрический инструмент, который обеспечивает несколько аспектов характеристики соединений. В то время как связывание с мишенью и клеточная проницаемость оцениваются для соединений, обнаруженных с помощью считывания МС, соединения, демонстрирующие клеточную цитотоксичность, исключаются на этапе анализа FACS. Анализ FACS был запрограммирован на включение только живых здоровых клеток с использованием стробирования прямого рассеяния и бокового рассеяния для устранения мертвых клеток, что означает, что соединения с нежелательным потенциалом цитотоксичности удаляются с экрана.Если для соединений, протестированных с помощью TAPS, потребуются дополнительные данные об активности, лизаты, полученные в результате анализа FACS, могут быть непосредственно применены для анализа вторичной активности, такого как анализ активности фермента, продемонстрированный здесь. В альтернативной конфигурации анализа этап клеточной пермеабилизации, такой как автоматическая оптоинъекция с использованием LEAP, может быть успешно включен в анализ TAPS, что позволяет использовать метод TAPS для соединений, которые не требуются для проникновения в клетки (данные не показаны).

    В настоящее время мы считаем, что анализ TAPS можно быстро и плавно интегрировать в рабочие процессы биохимического и биофизического отбора аффинности, ферментативного и фенотипического скрининга, чтобы доказать, что любые соединения-попадания взаимодействуют с исследуемой мишенью.Кроме того, анализ TAPS может также иметь значительную ценность в своем потенциале для средней пропускной способности, мультиплексного скрининга экспериментально сложных белковых мишеней, таких как белки внутриклеточной мембраны, которые в противном случае затруднены из-за отсутствия подходящего метода скрининга. Разработка и применение анализа TAPS для скрининга соединений на КМО внутри клеток указывает на то, что этот метод подходит для нацеливания на другие сложные белки. Помимо скрининга внутриклеточных мембранных белков, мы также считаем TAPS методом выбора для анализа внутриклеточной аффинности для крупномасштабных многобелковых комплексов, содержащих целевые белок-белковые взаимодействия или трудно поддающиеся очистке мишени, такие как полноразмерные киназы.Прекрасная возможность количественного определения как концентрации белка с помощью интенсивности флуоресцентного белка, так и концентрации соединения с помощью МС также позволит решить до сих пор нерешенные вопросы о стехиометрии ингибитора белка в больных клетках по сравнению со здоровыми. Другая дальнейшая итерация этого метода будет использовать первичные культуры тканей. Это обеспечит оптимальный, физиологически значимый отбор клеток-хозяев с учетом конкретных белков-мишеней. Это может оказаться особенно актуальным в терапии рака, поскольку анализ можно применять для скрининга лекарств в опухолевых клетках, взятых при биопсии.

    В заключение мы сообщаем о новом методе клеточного скрининга для оценки взаимодействия внутриклеточного лекарственного средства с мишенью. TAPS представляет собой метод с двумя параметрами, который мультиплексируется по отношению к соединению и в одном методе анализа позволяет идентифицировать соединения, проницаемые для клеток, обладающие низкой цитотоксичностью и демонстрирующие специфическое сродство к целевому белку в физиологически релевантной среде. Мы продемонстрировали потенциал анализа TAPS путем успешного скрининга плохо растворимого и сложного белка человека, КМО.Поскольку целевая проверка и целевое взаимодействие представляют собой два ключевых ограничивающих фактора в рамках возрождения важности фенотипического скрининга и скрининга с высоким содержанием, мы представляем это решение, в котором используется готовое оборудование, доступное для многих ученых в этой области. Не менее ценный, этот простой рабочий процесс позволит осуществлять прямой скрининг новых целей путем выбора сходства, которые до сих пор были доступны только с помощью непрямого обнаружения. Мы считаем, что важными потенциальными мишенями являются межкомпартментальные мембранные белки, включая трансмембранные белки ядерной оболочки, которые, как известно, участвуют во многих видах рака.Процессу поиска лекарств часто препятствуют проблемы, возникающие при получении сложных белков-мишеней. Скрининг белков-мишеней в физиологически релевантной среде с использованием этого метода может дать решение, о чем свидетельствует успешный скрининг плохо растворимого и сложного белка КМО человека.

    Мы благодарим Шонну Джонстон и Уилла Рамзи из Центра проточной цитометрии QMRI за техническую помощь. Мы благодарны всем сторонникам и спонсорам. Эта работа была поддержана MRC и стипендией KW.Во время этой работы DJM получил стипендию для ученых-клиницистов Фонда здравоохранения / Академии медицинских наук и теперь с благодарностью выражает благодарность Британскому совету по медицинским исследованиям за поддержку посредством старшей клинической стипендии. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

    Новая комбинация лекарств может помочь иммунным клеткам нацеливаться и уничтожать раковые клетки

    Исследователи определили многообещающую новую комбинацию лекарств, которая может значительно помочь иммунной системе нацеливаться на раковые клетки и убивать их.

    В исследовании, опубликованном в журнале Cell , описывается лечение, основанное на сочетании внутривенной дозы хорошо известного лекарства от тошноты, прохлорперазина (называемого в Австралии Stemetil), с существующими методами лечения рака.

    Ученый из Университета Квинсленда (UQ) Доцент Фиона Симпсон, руководившая исчерпывающим исследовательским проектом, сказала, что это может привести к новым методам лечения некоторых видов рака.

    Доктор Симпсон провела последнее десятилетие, работая над исследовательским проектом, посвященным памяти ее матери, которая умерла от рака в 1999 году.

    «Лекарство против тошноты работает путем изменения поверхности опухолевых клеток, так что существующие противораковые препараты, нацеленные на опухоли, лучше взаимодействуют с иммунной системой», — сказал доктор Симпсон.

    «В результате раковые клетки становятся сидячими мишенями, которые больше не могут ускользнуть от иммунной системы.

    «Мы наблюдали невиданный ранее процесс, который увеличил способность иммунных клеток-«естественных киллеров» прикрепляться к, и убить рак. Как будто клетки-киллеры прикрепляются к опухолевым клеткам.

    Лечение можно комбинировать с существующими противораковыми препаратами, такими как цетуксимаб, трастузумаб и авелумаб, и повышать их эффективность, и оно было изучено на опухолях головы и шеи, молочной железы и метастатическом колоректальном раке у мышей, а также на пяти пациентах с раком головы и шеи. рак

    «Эти героические пациенты добровольно вызвались на «испытание без пользы», согласившись на биопсию опухоли с последующим 20-минутным внутривенным переливанием стеметила, а затем еще одну биопсию», — сказал доктор Симпсон.

    «Мы смогли показать, что Стеметил изменил поверхность опухолевых клеток у этих пациентов».

    Следуя первоначальным выводам, исследователи объединили Stemetil с противораковым антителом, что привело к исчезновению всех опухолей у десяти мышей с раком головы и шеи.

    Доктору Симпсону было любопытно посмотреть, что произойдет, если они повторно заразят тех же раковых клеток мышам четыре недели спустя.

    «Удивительно, но их рак был быстро устранен — как будто новая комбинация, помимо того, что она была более эффективной, также могла научить иммунную систему тому, как лучше распознавать раковые клетки», — сказал доктор Симпсон.

    «У мышей развился долговременный иммунитет к раку, который у них был изначально.»

    Группа исследования рака Фионы Симпсон работала с экспертами-иммунологами, включая доктора Джеймса Уэллса из UQ, над внедрением результатов исследований в лечение пациентов.

    «Наше долгосрочное видение состоит в том, чтобы использовать этот подход не только для немедленного устранения рака у пациента, но и для предотвращения его рецидива в будущем путем создания защитной «иммунной памяти», — сказал доктор Уэллс.

    В настоящее время группа доктора Симпсона завершает исследование безопасности комбинации стеметила и цетуксимаба при раке головы и шеи, трижды отрицательном раке молочной железы и аденоидно-кистозной карциноме в больнице принцессы Александры.

    В сотрудничестве приняли участие исследователи и врачи из Института Диамантина UQ и Института молекулярной биологии, больницы принцессы Александры, Детского медицинского исследовательского института, Университета Ньюкасла и Университета Сиднея.

    Компания UniQuest, занимающаяся передачей технологий Университета Квинсленда, будет искать возможности для коммерциализации.

    Ссылка: Chew, et al. (2020) Ингибирование эндоцитоза у людей для улучшения ответа на антитела, опосредующие ADCC. Сотовый . DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.019 

    Данная статья переиздана из следующих материалов. Примечание: материал мог быть отредактирован по длине и содержанию. За дополнительной информацией обращайтесь к указанному источнику.

    0 comments on “Клетка мишень: Клетка-Мишень (Target Cell) — это… Что такое Клетка-Мишень (Target Cell)?

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.